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Artículo de método

Tinción con rojo de Picrosirius para la evaluación histopatológica semicuantitativa del depósito de colágeno en modelos murinos de rechazo crónico del aloinjerto pulmonar

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DOI:

10.3791/66395

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21 de marzo de 2025

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La tinción con rojo Picrosirius es un método semicuantitativo para evaluar objetivamente la deposición de colágeno en el remodelado fibrótico pulmonar murino de una manera resuelta espacialmente. Además de evaluar la deposición total de colágeno, la tinción Picrosirius Red permite diferenciar fibras de colágeno de diferentes grosores.

Resumen

La fibrosis es el sello fisiopatológico del rechazo crónico después del trasplante de pulmón y el principal obstáculo para la supervivencia a largo plazo del receptor. Existen varios modelos de trasplante pulmonar murino para el estudio del rechazo crónico. Sin embargo, muestran resultados heterogéneos en cuanto a los cambios fibróticos del injerto, y la extensión histológica de la fibrosis se informa principalmente de forma cualitativa. Por lo tanto, un enfoque resuelto espacialmente que permita el análisis estadístico puede ayudar a evaluar la fibrosis en estos modelos. Este estudio presenta la tinción con rojo Picrosirius para una evaluación semicuantitativa de la organización del colágeno en aloinjertos pulmonares murinos y la compara con las tinciones estándar de hematoxilina y eosina, tricrómico de Masson y Herovici. La tinción se realizó en secciones de dos modelos de trasplante murino diferentes en función de las incompatibilidades menores y mayores del complejo de histocompatibilidad (MHC). Se estableció el método para el análisis semicuantitativo de la organización del colágeno en secciones pulmonares completas. Por lo tanto, puede servir como herramienta para modelos experimentales murinos de enfermedades pulmonares fibróticas.

Introducción

El trasplante de pulmón es la opción terapéutica definitiva para los pacientes que padecen enfermedad pulmonar terminal. Sin embargo, la supervivencia a largo plazo se ve obstaculizada por el rechazo crónico, afectando al 50% de los receptores en los primeros cinco años postoperatorios1. La remodelación fibrótica de las vías respiratorias pequeñas y del parénquima pulmonar es el rasgo histológico que subyace a la pérdida progresiva de la función pulmonar en el rechazo crónico del injerto pulmonar2. Experimentalmente, el rechazo crónico del injerto pulmonar se puede modelar con el trasplante de pulmón ortotópico murino entre cepas de ratón MHC no compatibles. Se han propuesto diferentes combinaciones de cepas para lograr el fenotipo de rechazo crónico3. Entre ellos, se utiliza con frecuencia la combinación de trasplante del donante menor MHC no compatible C57BL/10 y del receptor C57BL/64. Alternativamente, los pulmones de donantes de BALB/c pueden trasplantarse a receptores C57BL/6 que reciben tratamiento inmunosupresor diario5. Estos modelos dan lugar a diferentes grados histológicos de cambios fibróticos6. Estos cambios a menudo se informan cualitativamente utilizando la hematoxilina y la eosina estándar, y la tinción tricrómica de Masson.

La tinción histológica estándar con hematoxilina y eosina permite una visión general de la muestra, ya que tiñe los núcleos de azul, mientras que el citoplasma y las fibras de colágeno aparecen de rojo. Con la tinción tricrómica de Masson, los núcleos se tiñen de negro, las fibras de colágeno se tiñen de verde a azul y el fondo, incluidos el citoplasma, la fibrina y los músculos, es rojo. Debido a que la tinción tricrómica de Masson puede conducir a valores subestimados, el uso de la tinción roja de Picrosirius se considera beneficioso7. Picrosirius Red es un tinte aniónico lineal que se asocia con fibras largas de colágeno catiónico y proporciona una tinción roja rica en contraste. Además, la tinción Picrosirius Red mejora la birrefringencia natural de las fibras de colágeno bajo luz polarizada cruzada8. De esta manera, se puede evaluar el grosor y el empaquetamiento de la fibra de colágeno. Con un filtro polarizador, el fondo se oscurece y es posible distinguir el grosor del colágeno depositado. Mientras que las fibras gruesas de colágeno aparecen rojas, las fibras delgadas de colágeno emergen verdes bajo la polarización. En la literatura se describe con frecuencia una asociación directa entre birrefringencia y subtipo de colágeno, asignándose birrefringencia roja al colágeno I y birrefringencia verde al colágeno III9.

Este protocolo describe el uso de la tinción con Picrosirius Red para evaluar la fibrosis en aloinjertos pulmonares murinos. Además de la tinción histológica convencional, permite una evaluación semicuantitativa del cambio fibrótico en modelos murinos de rechazo crónico, proporciona un medio para distinguir entre fibras de colágeno gruesas y delgadas en una sola tinción, es rentable y fácil de realizar. Este método puede aplicarse igualmente a otros modelos experimentales murinos caracterizados por la remodelación fibrótica del parénquima pulmonar.

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Protocolo

Todos los protocolos con animales cumplen con los principios éticos de las 3R para la investigación humanitaria con animales y fueron aprobados por el comité de ética veterinaria local (Veterinäramt Kanton Zürich, Suiza, Estudio número 45/2014). Del mismo modo, los lectores deben obtener el permiso de las instituciones pertinentes antes de realizar cualquier procedimiento en animales de laboratorio.

1. Adquisición de muestras

  1. Realizar experimentos con animales de acuerdo con las necesidades individuales y la aprobación ética respectiva. Un solo microcirujano realiza todas las cirugías sin ningún tiempo de isquemia prolongado adicional.
    NOTA: Para una reproducción de nuestros resultados representativos, obtenga ratones machos adultos específicos libres de patógenos C57BL/6J, C57BL/10J y BALB/c que pesen entre 27 y 30 g de Charles River Laboratories. En el caso de los isoinjertos, utilice animales C57BL/6J como donantes y receptores. En el modelo menor de incompatibilidad, trasplante pulmones de donantes C57BL/10J a receptores C57BL/6J. En el modelo de incompatibilidad mayor, trasplante de pulmones de donantes BALB/c a receptores C57BL/6J e inyecte ciclosporina (10 mg/kg/día) y metilprednisolona (1,6 mg/kg/día) por vía subcutánea diariamente5. Use solución salina para la perfusión y recupere los pulmones después de 8 semanas (56 días).
  2. Para la eutanasia, intubar al animal con un catéter de 20 g y ventilarlo conO2 suplementado con isoflurano al 2%-3%. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la ausencia de una respuesta a un pellizco de la pata.
  3. Realice una laparosternotomía mediana mediante una incisión en la pared abdominal con tijeras quirúrgicas y un corte a lo largo del esternón para exponer el corazón. Identificar la vena cava inferior y la orejuela auricular izquierda por su localización anatómica.
  4. En rápida sucesión, corte la vena cava inferior y el apéndice auricular izquierdo con unas tijeras quirúrgicas y perfunda el animal con 3-5 ml de NaCl al 0,9% a través de la raíz de la arteria pulmonar con una jeringa para extraer toda la sangre de la circulación pulmonar.
    NOTA: La eutanasia debe realizarse de acuerdo con la aprobación ética respectiva. Se pueden aplicar otros métodos de manera similar. Se recomienda que la sangre de la circulación pulmonar se extraiga completamente, lo que también se puede realizar por perfusión después de un paro circulatorio.
  5. Retire los pulmones perfundidos con unas tijeras.
  6. Para su conservación, incubar las muestras en formalina al 4%. Inyecte la solución de formalina directamente en el bronquio y la vasculatura pulmonar. Sumerge las muestras en formol y déjalas incubar durante al menos 6 h.
    NOTA: Para el inflado del pulmón con formalina, se debe aplicar un procedimiento estandarizado para obtener resultados comparables. En otros artículos se publican ejemplos de protocolos para este tipo de procedimientos10,11.
  7. Recorte el órgano de acuerdo con las necesidades experimentales. Cortar transversalmente los pulmones por la mitad para capturar todas las partes del árbol bronquial en una sección.
  8. Transfiera las muestras a un procesador automático de tejidos para su deshidratación en secuencia de alcohol, aclarando en xilol y recubrimiento de parafina de la siguiente manera: 70% de etanol, 70% de etanol, 80% de etanol, 96% de etanol, 100% de etanol (1 h cada una), 100% de etanol, 100% de etanol, xilol (2 h cada uno), xilol (1 h) y parafina 3x durante 2 h.
  9. Derrita la parafina e incruste las muestras en la orientación correcta en casetes de inclusión de polioximetileno. Tenga cuidado de incrustar las muestras con la superficie de corte hacia abajo. Utilice un micrótomo giratorio para cortar secciones de 5 μm consecutivas. Deje secar los portaobjetos durante 24 horas a 37 °C antes de continuar con el procesamiento.

2. Desparafinación e hidratación de portaobjetos de parafina

  1. Retire la parafina incubando las muestras 2 veces en xilol al 100% durante 5 minutos cada una.
    PRECAUCIÓN: El xilol es inflamable y peligroso para la salud. Úselo solo debajo de la campana extractora.
  2. Hidrate las muestras en etanol al 100%, etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y etanol al 50% durante 2 minutos cada una. Luego, lavar durante 2 min en agua destilada.

3. Teñir con Picrosirius Red

  1. Tiñe los portaobjetos durante 8 min en la solución de hemalum de Meyer. Lave los portaobjetos durante 10 minutos con agua corriente del grifo.
  2. Incubar los portaobjetos durante 1 h en la solución Picrosirius Red. Para la solución de Picrosirius Red, use una solución de tinción premezclada o use 0.1% de Direct Red 80 o Sirius Red F 3B (CI 35780) diluido en ácido pícrico saturado.
    PRECAUCIÓN: El ácido pícrico es inflamable y altamente explosivo y debe tratarse con cuidado.
    NOTA: Hay muchos proveedores diferentes de kits de tinción Picrosirius Red disponibles, como se indica en la Tabla de materiales. Tenga en cuenta las diferencias en el precio y los métodos de tinción, y siempre siga las instrucciones de los proveedores. Se recomienda utilizar únicamente kits de tinción con el índice de color específico para Sirius Red F 3B (CI 35780).
  3. Sumerja los portaobjetos 5x-10x en una solución de ácido acético (0,5%). Agite suavemente los portaobjetos para extraer físicamente la solución.
  4. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 95%, etanol al 100%, etanol al 100%, xilol al 100% y xilol al 100% durante 5 minutos cada uno.
  5. Incruste agregando una gota de medio de montaje en cada muestra y cúbrala con un cubreobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen debajo de una campana extractora.

4. Digitalización y procesamiento de imágenes

  1. Enfoque las muestras bajo un microscopio óptico con un software de imagen adecuado hasta que la imagen se vuelva clara y nítida. Agregue un filtro polarizador y ajuste el grado de polarización hasta que el fondo esté completamente oscuro o negro. Cuando el fondo está lo más oscuro posible, se consigue la polarización correcta.
    NOTA: También es posible visualizar la tinción de Picrosirius Red con luz transmitida convencional y sin filtro polarizador. Para ello, se recomienda utilizar Sirius Red con Fast Green, ya que se ha demostrado que es más sensible que Sirius Red solo12,13. Sin embargo, la microscopía polarizadora es necesaria para distinguir entre fibras de colágeno gruesas y delgadas.
  2. Escanee todas las muestras completamente con un aumento de 20x y exporte como .tiff. Transferencia a Fiji software14. Asegúrese de limpiar las diapositivas correctamente con anticipación y use configuraciones estandarizadas con respecto al tiempo de exposición y la intensidad de la fuente de luz.
  3. Rodea la muestra manualmente y recórtala en el software usando Editar > Borrar exterior. Mida el área de superficie total haciendo clic en Analizar > medir.
    NOTA: La selección del compartimento a medir es un paso crítico para crear resultados fiables y comparables. Al digitalizar y seleccionar toda la muestra, se muestra una buena sección transversal y los tejidos heterogéneos se consideran como un todo. Sin embargo, también es posible limitarse a áreas específicas dentro de las muestras, como la pleura o los bronquios individuales. Tenga en cuenta que siempre debe seleccionar los compartimentos para comparar de manera estandarizada. En caso de que las muestras muestren una gran variabilidad en la ventilación, es aconsejable excluir el área del espacio aéreo del compartimentoanalizado 15.
  4. Mida el contenido total de colágeno por muestra utilizando el umbral de color haciendo clic en Imagen > Ajustar > umbral de color y ajuste la configuración haciendo clic en Analizar > Analizar partículas. Establecer tamaño = 1 - Infinito, Borrar, Resumir. Brillo = 35 - 255. Tono = 2 - 130
    NOTA: Un ajuste razonable de los umbrales de color es fundamental para lograr resultados fiables.
  5. Repita para las fibras de colágeno gruesas y delgadas ajustando el tono como figure-protocol-1 Fibras de colágeno gruesas rojas (tono 2-30) y Fibras de colágeno delgadas amarillo-verde figure-protocol-2 (tono 31-130). El resultado será el área de píxeles manchados.
  6. Configure la macro para el procesamiento automatizado haciendo clic en Plugins > Macros > Grabar y repetir con todas las muestras.
  7. Para obtener valores finales estandarizados al área de superficie de la sección transversal, divida el área de píxeles teñidos para todos los parámetros por el área de superficie total medida en los pasos 4.3 y 4.5 para cada muestra, respectivamente.

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Resultados

El protocolo descrito anteriormente permite una evaluación semicuantitativa objetiva de la deposición de colágeno en el tejido pulmonar murino. El remodelado fibrótico es el sello fisiopatológico del rechazo crónico después del trasplante de pulmón. Por lo tanto, la tinción con rojo de Picrosirius se aplicó en modelos de rechazo de aloinjerto pulmonar crónico mediante trasplante de pulmón ortotópico murino izquierdo. El trasplante pulmonar incompatible con MHC importante de un donante BALB/c a un receptor C57BL/6 bajo in...

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Discusión

Los métodos histológicos estándar, como la hematoxilina y la eosina, y la tinción tricrómica de Masson, son ampliamente utilizados para detectar cambios fibróticos en pulmones murinos de forma espacialmente resuelta16,19. Sin embargo, a menudo se necesitan métodos adicionales para cuantificar estos cambios y evaluar la composición de colágeno del tejido.

La tinción roja de Picrosirius se describió por ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Birte Ohm cuenta con el apoyo del Programa Berta-Ottenstein para Científicos Clínicos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo. Steffen U Eisenhardt es profesor Heisenberg de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y apoyó este trabajo con becas personales. Además, nos gustaría agradecer a Sheena Kreuzaler por su asistencia técnica. La Figura 1 se creó con la ayuda de Biorender.com. Las imágenes se realizaron en el Lighthouse Core Facility, financiado en parte por la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo (Números de Proyecto 2023/A2-Fol; 2021/B3-Fol), el DKTK y el DFG (Número de Proyecto 450392965).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoHoneywell, Charlotte, EE. UU.33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Alemania4633000956 (número de serie)
Coverslip 1.5Roth, Karlsruhe, AlemaniaKCY5.1
Formaldehído 37%Fisher Scientific, Leicestershire, Reino UnidoF/1501/PB15
Solución de hemalum de MeyerMerck, Darmstadt, Alemania109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Offenbach am Main, Alemania13422alternativas que se pueden utilizar: ab150681, abcam, Cambridge, Reino Unido; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City, EE. UU.
Filtro polarizadorZeiss, Oberkochen, Alemania000000-1121-813
Microtomo rotativo, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Alemania149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Medio de montaje HistokittRoth, Karlsruhe, Alemania6638.1
ROTI Plast ParaaffinRoth, Karlsruhe, Alemania6642.5
Casetes de Rotilabo, POMRoth, Karlsruhe, AlemaniaK113.1
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio de adhesiónepredia, Portsmouth, Reino UnidoJ1800AMNZ
Procesador de tejidos Leica, Wetzlar, AlemaniaTP 1020
Software
Fiji versión de software 2.14.0/1.54fde código
ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Alemania
Software de imagen abierto

Referencias

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