Investigación Aplicación de la onda de choque inducida por láser para el estudio de la lesión coclear inducida por explosión

Resumen

Aquí, describimos los protocolos experimentales para crear un modelo animal de lesión coclear inducida por blastos utilizando ondas de choque inducidas por láser (LISW). La exposición del hueso temporal a LISW permite la reproducción de la fisiopatología coclear inducida por blastos. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar la patología coclear y explorar posibles tratamientos para las lesiones por blastos.

Resumen

El oído es el órgano más susceptible a la sobrepresión de la explosión, y las lesiones cocleares ocurren con frecuencia después de la exposición a la explosión. La exposición a explosiones puede provocar pérdida auditiva neurosensorial (SNHL), que es una pérdida auditiva irreversible que afecta negativamente a la calidad de vida. Se han documentado previamente patologías cocleares detalladas inducidas por blastos, como la pérdida de células ciliadas, neuronas ganglionares espirales, sinapsis cocleares y alteración de los estereocilios. Sin embargo, determinar el deterioro neurosensorial de la cóclea después de una lesión por explosión es un desafío porque los animales expuestos a la sobrepresión por explosión generalmente experimentan perforación de la membrana timpánica (TMP), que causa pérdida auditiva conductiva concurrente. Para evaluar la disfunción coclear neurosensorial pura, desarrollamos un modelo animal experimental de lesión coclear inducida por blastos utilizando una onda de choque inducida por láser. Este método evita la TMP y las lesiones sistémicas concomitantes y reproduce la disminución funcional del componente SNHL de una manera dependiente de la energía después de la exposición a LISW. Este modelo animal podría ser una plataforma para dilucidar los mecanismos patológicos y explorar posibles tratamientos para la disfunción coclear inducida por blastos.

Introducción

La pérdida de audición y el tinnitus se encuentran entre las discapacidades más prevalentes, reportadas en hasta el 62% de los veteranos^. Se han notificado varias complicaciones auditivas inducidas por blastos, como la pérdida auditiva neurosensorial (SNHL) y la perforación de la membrana timpánica (TMP), en individuos expuestos a la sobrepresión blástica². Además, la investigación en individuos expuestos a blastos sugiere que la exposición a blastos con frecuencia resulta en defectos en la resolución temporal auditiva, incluso cuando los umbrales de audición están dentro del rango normal, lo que se conoce como "pérdida auditiva oculta (HHL)"³. Está bien establecido que hay una pérdida sustancial de sinapsis cocleares entre las células ciliadas internas (IHC) y las neuronas auditivas (AN) en la patología coclear relacionada con blastos⁴. La degeneración sináptica da lugar a un deterioro del procesamiento auditivo y es un factor importante que contribuye al desarrollo de HHL⁵. Por lo tanto, los órganos auditivos son componentes frágiles que contienen estructuras complejas y altamente organizadas. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual las ondas expansivas afectan al oído interno a nivel celular sigue sin estar claro. Esto se debe a los desafíos para replicar las complejidades clínicas y mecánicas precisas de las lesiones por blastos en entornos de laboratorio y la complejidad de las patologías cocleares inducidas por blastos.

El componente principal de una lesión por explosión es la onda de choque (SW), caracterizada por un aumento rápido y alto de la presión máxima⁶. La complejidad de las lesiones por explosiones ha sido ampliamente investigada en numerosos estudios retrospectivos ^7,8,9. Existen varios dispositivos para la generación de voladuras, como el gas comprimido¹⁰, los tubos de choque¹¹ y los explosivos de pequeña magnitud¹², a diferentes niveles de presión. La forma de onda de presión del SW generada por los dispositivos recientemente desarrollados se parecía mucho a la de una explosión real. Un concepto importante en el establecimiento de un modelo animal de pérdida auditiva neurosensorial inducida por blastos es minimizar las lesiones concomitantes, aparte del daño auditivo, para reducir la muerte de los animales. Por lo tanto, se han desarrollado estudios de lesiones por explosión en los que se han miniaturizado los tubos de choque y la salida se puede controlar con precisión para que los animales expuestos rara vez mueran. Sin embargo, aunque estos modelos animales suelen desarrollar complicaciones, como la TMP, la evaluación de la función coclear es difícil debido a la hipoacusia conductiva concurrente². Anteriormente realizamos un estudio en animales con protección auditiva sobre lesiones por explosiones utilizando tapones para los oídos y no encontramos incidencia de TMP¹³. Los tapones para los oídos podrían atenuar parcialmente el daño coclear severo, pero no la neurodegeneración auditiva central o el desarrollo de tinnitus. Por lo tanto, los tapones para los oídos protegen la cóclea y la membrana timpánica. Sin embargo, se requiere un modelo animal de daño coclear puro inducido por blastos sin TMP para estudiar la fisiopatología coclear causada por lesiones por blastos.

Previamente desarrollamos un modelo de lesión por explosión tópica del oído interno en ratas y ratones utilizando una onda de choque inducida por láser (LISW)^14,15. Este método puede realizarse de forma segura y sencilla a nivel de laboratorio estándar y se ha utilizado para generar modelos de lesiones pulmonares y craneales por blastos^16,17. La energía del LISW se puede ajustar cambiando el tipo y la potencia del láser, lo que permite controlar el grado de daño coclear. El modelo de lesión coclear inducida por LISW es valioso para estudiar los mecanismos de la SNHL causada por lesiones por blastos e investigar posibles tratamientos. En este estudio, describimos protocolos experimentales detallados para crear un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW y demostramos la degeneración coclear, incluida la pérdida de células ciliadas (HC), sinapsis cocleares y neuronas ganglionares espirales (SGN), de una manera dependiente de la energía en ratones después de la exposición a LISW.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Defensa Nacional (aprobación # 18050) y se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. Se hizo todo lo posible para minimizar el número de animales y su sufrimiento.

1. Animales

1. Utilice ratones machos CBA/J de 8 semanas de edad para seguir este protocolo. Antes del experimento, someta a los ratones a una prueba de función auditiva y a una observación endoscópica de la membrana timpánica para garantizar la normalidad.
2. Divida 27 ratones CBA/J en tres grupos: (1) grupo expuesto a 2,0 J/^cm2 (n = 9 ratones); (2) grupo expuesto a 2,25 J/^cm2 (n = 9 ratones); y (3) grupo expuesto de 2,5 J/^cm2 (n = 9 ratones). Retire todas las orejas para su evaluación 1 mes después de la exposición a LISW.

2. Entornos experimentales de exposición a LISW

1. El objetivo láser es un disco de caucho natural negro, de 10 mm de diámetro y 0,5 mm de grosor. Para aumentar el impulso de LISW, utilice un adhesivo de soldadura de resina acrílica para unir una lámina de tereftalato de polietileno (PET) transparente de 1,0 mm de espesor en la parte superior del área objetivo. Irradie un láser Nd:YAG Q-switched de 532 nm para generar el LISW detrás del objetivo (Figura 1A).
2. Enfoque el pulso láser con una lente plano-convexa a un punto de 3,0 mm de diámetro en el objetivo láser.
3. Utilice la irradiación LISW para generar plasma en la superficie de unión de los dos materiales y vaporizar el caucho (ablación mediada por plasma), dejando el caucho vaporizado en la cavidad.
4. Utilice un hidrófono para medir la onda de presión de LISW a 1,0 mm bajo el agua, no en tejido vivo. Coloque un hidrófono de fibra óptica de 0,25 mm de diámetro debajo de la goma negra a 1,0 mm por debajo de la superficie del agua para registrar las formas de onda de presión LISW y medirlas con un osciloscopio digital.
   NOTA: Las formas de onda de presión mostraron características estables con presión e impulso máximos similares a los que se muestran en la Figura 1B.
5. Realizar todos los procedimientos con animales bajo anestesia general utilizando inyecciones intraperitoneales de 1 mg/kg de clorhidrato de medetomidina y 75 mg/kg de ketamina. Aplique una pomada oftálmica en ambos ojos del ratón para evitar que se seque y proporcionar soporte de calor.
6. Afeita con cuidado las regiones postauriculares para evitar retener el aire atrapado en el pelaje. Fije los ratones en una placa y coloque las regiones postauriculares en el área focal del LISW en una dirección vertical hacia arriba.
7. Coloque un objetivo de goma negra percutáneamente en la región postauricular de la oreja del ratón. Para garantizar la adaptación de la impedancia acústica, utilice un gel conductor de ultrasonidos entre el objetivo láser y la superficie de la piel.
8. Aplique un solo pulso de LISW a la cóclea a través del hueso temporal. Ajuste las salidas de los pulsos láser a tres densidades de energía: 2,0 J/^cm2 , 2,25 J/^cm2 y 2,5 J/^cm2.

3. Prueba de función coclear

NOTA: Las pruebas de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) se realizaron como se informó anteriormente^14,15.

1. Realice la medición de ABR 1 día antes y 1 día y 1 mes después de la exposición a LISW.
2. ABR es un potencial evocado auditivo en respuesta a estímulos auditivos y se usa comúnmente para evaluar umbrales de audición en cuatro frecuencias (12.0 kHz, 16.0 kHz, 20.0 kHz y 24.0 kHz).
3. Presente el sonido de estimulación a través de un auricular pequeño y mida el nivel de presión sonora cerca de la membrana timpánica del ratón utilizando un pequeño micrófono colocado cerca del auricular. Emita estímulos de ráfaga de un generador de sonido a 37 ciclos/s y amplifique la presión sonora desde un nivel de presión sonora (SPL) de 20 dB hasta 80 dB SPL en pasos de 5 dB SPL.
4. Inserte un electrodo de aguja de acero inoxidable para el registro del electroencefalograma debajo del canal auditivo y la región frontal de la oreja e inserte un electrodo de tierra debajo de la región caudal de la cola.
5. Evalúe las funciones cocleares midiendo la amplitud del pico ABR I (P1). Analice automáticamente las formas de onda ABR con respecto a los umbrales de audición y la amplitud ABR P1 utilizando el software de análisis de picos ABR como se informó anteriormente¹⁸.
6. Calcule los cambios del umbral ABR restando los umbrales obtenidos antes de la exposición. Comparar los cambios del umbral ABR en los tres grupos expuestos con los de los oídos contralaterales no expuestos (control). Mida las amplitudes de ABR utilizando la forma de onda de ABR durante la estimulación de SPL de 80 dB.

4. Valoración histológica

NOTA: La evaluación histológica se realizó como se describió anteriormente^14,15.

1. HC y sinapsis coclear
   1. Realizar el examen anatomopatológico de la cóclea 1 mes después de la exposición a LISW.
   2. Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies antes de la perfusión. Después de la hemoperfusión con solución de Ringer lactato, realizar perfusión transcardíaca con 1 mL/g de paraformaldehído (PFA) al 4%. Después de la decapitación, extraer la cóclea y perfundirla directamente con PFA al 4%, seguido de la fijación a 4 °C durante la noche.
   3. Después de la fijación, descalcifique la cóclea agitándola en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mol/L durante 2 días.
   4. Divide la cóclea desmineralizada en cuatro trozos. Después de congelar cada pieza de cóclea en hielo seco durante 10 min, realice el bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h en suero de caballo normal al 5% simplemente conjugado con Triton X al 0,3% para la permeabilización.
   5. Utilice anticuerpos anti-miosina 7a (Myo7A), anti-proteína de unión a C-terminal (CtBP2) y anti-neurofilamentos (NF) como anticuerpos primarios e incubados a 37 °C durante la noche. Utilice los anticuerpos Myo7A, CtBP2 y NF para evaluar las HC, las cintas presinápticas y las fibras nerviosas cocleares, respectivamente.
   6. Lave el anticuerpo primario no unido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 x 3 min. Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios adecuados a 37 °C durante 2 h. Después de la tinción, lave las muestras durante 3 x 5 minutos con PBS y encapsule las muestras en el vidrio del portaobjetos con un encapsulante soluble en agua con un cubreobjetos.
   7. Para la evaluación, adquiera la imagen completa de la cóclea (dividida en cuatro partes) con un aumento de 10x y calcule el mapa de frecuencia coclear utilizando el complemento de software ImageJ al que se hace referencia para localizar con precisión las regiones cocleares específicas a una frecuencia de 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz y 24,0 kHz.
   8. Calcular las tasas de supervivencia de la HC y el número de sinapsis en cada frecuencia.
      1. Para calcular las tasas de supervivencia de los HC, cuente el número de HC supervivientes y faltantes por cada 200 μm de longitud en cada frecuencia, y calcule la tasa de supervivencia de los HC utilizando la ecuación (1) que se muestra a continuación:
         Tasa de supervivencia de HC (%) = (Número de HC supervivientes / Número de HC supervivientes y faltantes) × 100 (1)
      2. Para calcular el número de sinapsis, obtenga imágenes de alta resolución de la pila z del área HC interna utilizando una lente objetivo de inmersión en aceite (63×) con un zoom digital de 3,1x y un tamaño de paso de 0,25 μm bajo microscopía de fluorescencia confocal. Importe las pilas de imágenes a ImageJ y cuente automáticamente los puntos de CtBP2 por IHC dentro de un rango de 50 μm en cada pila de imágenes. Calcule la tasa de supervivencia de las cintas sinápticas usando la ecuación (2):
         Tasa de supervivencia de las cintas sinápticas (%) = (Número de cintas sinápticas en los oídos expuestos a LISW / Número de cintas sinápticas en los oídos control) × 100 (2)
   9. Para la microscopía electrónica de barrido (SEM), extraiga la cóclea, como se ha descrito anteriormente, y luego fíjela con PFA al 2% y glutaraldehído al 2,5% juntos a 4 °C durante la noche. Después de la descalcificación de la cóclea agitándola en una solución de EDTA 0,5 mol/L a 4 °C durante 7 días, diseccione la cóclea en cuatro piezas para prepararla en todo el montaje.
   10. Fijar los tejidos con tetróxido de osmio al 1% a 4 °C durante 30 min, deshidratar en etanol al 50% a temperatura ambiente durante 10 min, repetir con etanol al 70 %, 80 %, 95 % y luego al 100 %, pulverizar el recubrimiento con osmio y examinar bajo un microscopio electrónico a 5,0 kV, como se informó anteriormente¹⁴.
   11. Realizar un análisis cuantitativo de la disrupción del haz estereociliar en las células ciliadas externas (OHC) calculando la relación de estereocilios alterados (número de estereocilios OHC interrumpidos/número total de estereocilios OHC) en cada grupo de energía utilizando las imágenes SEM¹⁴. Cuente el número de estereocilios por 100 μm en el centro de las regiones de 16,0 y 24,0 kHz. Designe una o más filas de haces de OHC que están doblados hacia el lado lateral, enredados o sin su base como interrumpidos.
2. SGNs
   1. Para evaluar cuantitativamente el número de SGNs 1 mes después de la exposición a LISW, realizar perfusión transcardíaca con PBS al 4%, decapitar, extraer la cóclea y realizar la fijación posterior en las mismas condiciones descritas anteriormente. Descalcificar la cóclea en 0,5 M EDTA durante 1 semana.
   2. Después de la descalcificación, sumergir las cócleas en sacarosa al 30% durante la noche, incrustarlas en el compuesto crioseccionante, congelar en nitrógeno líquido para preparar secciones cerca del canal de Rosenthal con un espesor de 15 μm, teñir con hematoxilina y eosina, y observarlas bajo un microscopio óptico¹⁴.
   3. Para la medición de la densidad de SGN, cuente el número de SGN en la curva central del canal de Rosenthal y calcule la supervivencia de SGN por control.

5. Análisis estadístico

1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software de su elección.
2. Analice las diferencias estadísticas en el desplazamiento del umbral de ABR, HC, SGN y los recuentos sinápticos utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías ["frecuencia o partes cocleares (apicales/medias/base)" × "grupos de animales"], análisis de varianza de dos vías (ANOVA), seguido de la prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey.
3. Presentar todos los datos como media ± error estándar y establecer el nivel de significación estadística en p < 0,05.

Resultados

Forma de onda LISW
La reproducibilidad de la forma de onda de presión LISW se midió 5x a 2,0 J/^cm2 de la siguiente manera. Las formas de onda fueron generalmente similares y estables y mostraron un fuerte aumento con el ancho de tiempo, la presión máxima y el impulso de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa y 14,1 ± 1,9 Pa∙s (mediana ± SD), lo que corresponde a las características del SW (Figura 1B). Los LISW se caracterizan por un tiempo de subida rápido, alta presión máxima, corta duración y dominancia de presión positiva. Cuando se aplica al tejido biológico, el objetivo se coloca directamente sobre el tejido vivo a través de la gelatina, y se puede considerar que el SW tiene casi las mismas características que el SW medido aplicado al tejido. Después de la exposición a LISW, la aparición de TMP se evaluó utilizando un pequeño endoscopio digital. Ninguno de los ratones del grupo de energía LISW presentó TMP después de la exposición (Figura 1C).

Evaluación auditiva
Se realizó un examen ABR para determinar la función auditiva. ABR es una medida del potencial sonoro evocado en la vía auditiva, y ABR P1 representa la actividad neuronal acumulada en el nervio coclear. Un día después de la exposición a LISW, el oído expuesto mostró una diferencia significativa en el cambio del umbral de ABR entre los diferentes grupos de LISW (ANOVA de dos vías, p < 0,0001; Figura 2A). Este aumento en el cambio del umbral ABR persistió hasta 1 mes después de la exposición a LISW en los grupos de 2,25 y 2,5 J/^cm2 (ANOVA de dos factores, 2,25 J/^cm2, p < 0,0001; 2,5 J/^cm2, p < 0,0001). En particular, la región de alta frecuencia exhibió un aumento notable en el cambio del umbral de ABR. Sin embargo, los umbrales de ABR se recuperaron a un nivel que no fue significativamente diferente de la preirradiación en el grupo de 2,0 J (ANOVA de dos factores, 2,0 J/^cm2, p = 0,76), lo que indica que la elevación del umbral dependía de la energía. Con respecto a las amplitudes de ABR P1, todos los grupos irradiados con LISW mostraron una disminución significativa en las amplitudes de ABR P1 en todas las frecuencias 1 día y 1 mes después de la exposición a LISW (ANOVA de dos vías, p < 0,0001; Figura 2B). El oído no expuesto (control; oído izquierdo) no mostró alteraciones notables en el umbral de audición ABR después de la exposición a LISW (datos no mostrados).

Supervivencia de los HC y SGN
La observación microscópica de los oídos expuestos a LISW no reveló daño mecánico en las cócleas, como fractura y dislocación de los huesecillos, ruptura de la membrana de la ventana redonda o hemorragia intracoclear, después de la exposición a LISW (datos no mostrados), lo que es consistente con los hallazgos previos ^6,14.

En la Figura 3A se muestra la inmunotinción fluorescente de HCs con Myo7A, cintas sinápticas con CtBP2 y el nervio coclear con NF. No se observó daño coclear grave, como la pérdida de HC o fibras nerviosas, en ninguno de los grupos. Sin embargo, la evaluación cuantitativa de la supervivencia de los OHC positivos para Myo7A difirió significativamente entre los grupos (ANOVA de dos vías, p = 0,002; Figura 3B). El grupo de 2,5 J/^cm2 mostró tasas de supervivencia significativamente más bajas de las CCE que el grupo control, especialmente en la región de alta frecuencia (ANOVA de dos vías, 2,5 J/^cm2, p = 0,0002). Sin embargo, las tasas de supervivencia de las IHC fueron comparables entre los grupos, lo que indica que las OHC son vulnerables a la LISW de alta energía (ANOVA de dos factores, p = 0,76). En la Figura 3C se muestra una evaluación cuantitativa de la supervivencia de la cinta sináptica. Las cintas sinápticas se redujeron significativamente en los grupos de 2,25 y 2,5 J/^cm2 en comparación con el control (ANOVA de dos vías, 2,25 J/^cm2, p < 0,0001; 2,5 J/^cm2, p < 0,0001), y las frecuencias más altas mostraron una tendencia más fuerte a disminuir, similar a la del cambio del umbral de ABR y la supervivencia de la OHC.

A continuación, se evaluó la densidad de SGN, como se muestra en la Figura 3D. Hubo una diferencia significativa en la densidad de SGN entre los grupos (ANOVA de dos vías, p = 0,76), y el grupo de 2,5 J/^cm2 mostró tasas de supervivencia significativamente más bajas de SGN en comparación con los grupos de control (ANOVA de dos vías, 2,5 J/^cm2, p = 0,007). Sin embargo, los grupos de 2,0 y 2,25 J/^cm2 mostraron una supervivencia de SGN comparable a la de los controles. Este resultado indica que la gravedad de la degeneración coclear y la disfunción auditiva depende de la exposición a la energía de LISW, lo que es consistente con los resultados de supervivencia de ABR y HC.

Paquete estereociliar
Observamos un aumento notable en el umbral ABR, aproximadamente 30 dB, en los grupos de 2,25 y 2,5 J/^cm2 a frecuencias superiores a 20 kHz, que persistió hasta 1 mes después de la exposición a LISW (como se muestra en la Figura 2A). Sin embargo, el cambio de umbral de 30 dB que observamos no puede atribuirse únicamente a la pérdida de OHC, la degeneración de las sinapsis cocleares o un número reducido de SGC (Figura 3). Un estudio previo indicó que los cambios en el umbral de ABR eran mínimos cuando el número de cintas sinápticas disminuía en un 50%¹⁹. Por lo tanto, realizamos SEM para investigar la causa de la elevación del umbral ABR. Después de la exposición a LISW a una intensidad de 2,5 J/^cm2, algunos haces estereociliares de OHC parecieron estar alterados, particularmente en regiones de alta frecuencia (Figura 4A), lo que puede ser una de las causas del aumento del umbral ABR después de la exposición a LISW. La evaluación cuantitativa de la disrupción estereociliar reveló que la relación de perturbación tendía a ser mayor en la región de mayor frecuencia de una manera dependiente de la energía (Figura 4B).

Figura 1: Ajustes experimentales y perfil de presión de LISW. (A) Configuración experimental para la generación de LISW en animales. (B) Características de las formas de onda de presión LISW establecidas en 2,0 J/cm². (C) Imágenes representativas de la membrana timpánica. No se observaron TMP en ninguno de los oídos expuestos a LISW. Como referencia, se muestra el TMP (puntas de flecha amarillas) representativo inducido por voladura utilizando un tubo de voladura. Abreviaturas: LISW = onda de choque inducida por láser; PET = tereftalato de polietileno; TMP = perforación de la membrana timpánica; YAG = granate de itrio y aluminio; SHG = segunda generación de armónicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultados de ABR después de la exposición a LISW. (A) Se observaron cambios significativos en el umbral de ABR en todos los grupos 1 día después de la exposición a LISW. Los cambios en el umbral de ABR en los grupos de 2,25 y 2,5 J/^cm2 permanecieron significativamente elevados hasta 1 mes después de la exposición a LISW. (B) La amplitud de ABR P1 1 día y 1 mes después de la exposición a LISW disminuyó significativamente en todos los grupos. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos en comparación con los valores previos a la exposición (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Las barras de error indican el error estándar de la media. Abreviaturas: ABR = respuesta auditiva del tronco encefálico; LISW = onda de choque inducida por láser; P1 = pico 1; SPL = nivel de presión sonora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Patología coclear después de la exposición a LISW. (A) Imágenes de fluorescencia confocal del órgano de Corti en la región de 20 kHz teñidas con Myo7A (azul), CtBP2 (rojo) y NF (verde) después de la exposición a LISW. (B) Los porcentajes promedio de HC sobrevivientes se muestran en los citococleogramas. La evaluación cuantitativa reveló una pérdida significativa de OHC a 2,5 J/^cm2, aunque no hubo diferencias significativas en la supervivencia de la IHQ entre los grupos. (C) La tasa de supervivencia de las cintas presinápticas en comparación con los valores previos a la exposición disminuyó significativamente en los grupos de 2,25 y 2,5 J/^cm2 . (D) Fotomicrografías representativas de SGN en todos los grupos 1 mes después de la exposición a LISW. La tasa de supervivencia de la SGN disminuyó significativamente a 2,5 J/^cm2. Los asteriscos indican diferencias significativas en comparación con los valores previos a la exposición (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Las barras de error indican el error estándar de la media. Barras de escala = 5 μm (A), 100 μm (D). Abreviaturas: LISW = onda de choque inducida por láser; IHQ = célula ciliada interna; NF = neurofilamento; OHC = célula ciliada externa; SGN = neurona ganglionar espiral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Estructuras superficiales de los OHC. (A) Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido de los estereocilios de OHC en las regiones de 16 kHz y 24 kHz del órgano de Corti un mes después de la exposición a LISW. La disrupción estereociliar se observa en imágenes ampliadas de la zona en caja en el grupo de 2,5 J/^cm2 (zona de 24 kHz). Barra de escala -= 2 μm. (B) La tasa de disrupción estereociliar fue mayor con un aumento en la sobrepresión de LISW. Abreviaturas: LISW = onda de choque inducida por láser; OHC = células ciliadas externas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Este estudio tuvo como objetivo validar un modelo de ratón de daño coclear inducido por blastos utilizando LISW. Nuestros hallazgos demostraron que después de la aplicación de LISW a través del hueso temporal, la oreja de los ratones expuestos exhibió una disminución patológica y fisiológica consistente en la cóclea, que se acompañó de un aumento en la sobrepresión de LISW. Estos resultados indican que este modelo de ratón es apropiado para replicar diversas patologías cocleares mediante el ajuste de la salida de LISW. En concreto, este modelo de ratón de disfunción coclear inducida por LISW podría servir como un buen modelo de lesión coclear debido a su naturaleza controlada, reproducible y cuantificable, así como a su capacidad para reproducir el deterioro fisiopatológico de la cóclea en condiciones controladas.

Nuestro estudio previo utilizó un modelo de rata y observó la degeneración coclear inducida por LISW, incluida la elevación de los umbrales de audición, la pérdida de cintas sinápticas y la interrupción del haz estereociliar¹⁴. Otro estudio investigó la degeneración fisiopatológica de la cóclea después de una lesión por blasto en ratones utilizando dos tipos de blastos con características diferentes: dominante de baja frecuencia usando un tubo de blast y dominante de alta frecuencia usando LISW¹⁵. Determinaron que la frecuencia dominante del espectro de potencia de la explosión fue el factor principal en la determinación de la región de daño coclear, como se informó anteriormente¹⁵. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra la metodología detallada de la exposición coclear a LISW y la degeneración coclear inducida por LISW dependiente de la energía y la frecuencia.

Utilizamos la exposición a LISW para dañar la cóclea a través del hueso temporal postauricular en lugar de a través del canal auditivo externo para crear un modelo que solo involucrara el daño coclear sin ninguna TMP o interrupción de la cadena osicular. Nuestros hallazgos implican que la discapacidad auditiva demostrada en este estudio se debió al deterioro de los componentes neurosensoriales en la vía auditiva. Estudios recientes han indicado que la TMP puede servir como un amortiguador contra el daño a la cóclea al absorber la energía SW ^2,20,21. Este modelo de LISW no pudo inducir TMP, incluso con LISW de alta intensidad, porque el SW se irradió directamente al oído interno y no a través de la membrana timpánica. Por lo tanto, para analizar la pérdida auditiva mixta con TMP y SNHL, lo ideal es una explosión de alta intensidad generada mediante una explosión real o un tubo de choque. La elección del tipo de voladura depende del uso específico o del objetivo del estudio. Por lo tanto, este modelo de lesiones animales basado en LISW es útil para dilucidar la fisiopatología coclear pura inducida por blastos sin TMP, lo que resulta en pérdida auditiva conductiva. Desde otro punto de vista, la irradiación de LISW requirió 1 h/animal, incluyendo la configuración del equipo y la verificación de la membrana timpánica después de la irradiación. Por lo tanto, si varios animales fueron expuestos a LISW en una serie de 1 día, es difícil medir la irradiación de LISW y la ABR el mismo día con una sola dosis de anestésico. Debido al riesgo de muerte de los animales al aumentar la dosis de anestésico, en este estudio decidimos realizar mediciones de ABR al día siguiente, no inmediatamente después de la irradiación del mismo día.

En la lesión por explosión, la fase primaria es causada por las fuerzas físicas de la explosión y la transmisión rápida de SW con cambios significativos en la densidad tisular, como las uniones tejido-aire²². Por lo tanto, se considera que la mayoría de las lesiones cocleares inducidas por blastos surgen de la SW durante la fase⁶ primaria, lo que sugiere que los estudios sobre las lesiones cocleares expuestas a la SW son cruciales para comprender los mecanismos de la disfunción coclear inducida por blastos. La creación de un SW utilizando un pulso láser de alta energía sobre un material sólido se conoce como LISW. Estudios previos han utilizado LISW para desarrollar modelos animales de lesiones traumáticas cerebrales y pulmonares inducidas por blastos^16,17. Los beneficios de usar LISW para estudios relacionados con explosiones incluyen su modelo de daño repetible dependiente de la intensidad del láser y el enfoque específico del órgano lesionado porque LISW no afecta áreas fuera del área objetivo.

En este estudio, descubrimos que LISW provoca cambios patológicos en las HC cocleares, las SGN, sus sinapsis y el haz estereociliar, similares al daño causado por una lesión por explosión real¹². El daño infligido por diversas formas de lesiones cocleares, como la pérdida de audición inducida por el ruido, puede atribuirse a dos factores fundamentales: el estrés mecánico directo y la alteración metabólica secundaria. Proponemos que la disrupción del haz estereociliar es la patología primaria que resulta del estrés mecánico directo de la LISW. Los trastornos estereociliares son patologías comunes asociadas a la disfunción auditiva relacionada con la edad e inducida por el ruido^23,24. Todavía no se ha dilucidado el mecanismo exacto que subyace a esta disrupción estereociliar. Un estudio previo reveló que se observó disrupción estereociliar 1 semana después de la exposición a la explosión¹². Una posible razón para este cambio morfológico único puede ser la desconexión de los enlaces de la punta y los enlaces laterales entre los estereocilios de la fila más externa perturbados y los estereocilios de la fila^{central 14}. Además, las raicillas de la fila más externa de estereocilios, que consisten en actina y proteínas agrupantes, como TRIOBP, también están dañadas mecánicamente¹⁵.

Las lesiones cocleares suelen provocar una mayor alteración de los procesos metabólicos que puede persistir durante días o incluso meses¹⁹. En particular, las sinapsis de la cóclea, que son responsables del procesamiento auditivo del sonido, son muy vulnerables a la exposición a las explosiones²⁵. Nuestros modelos animales mostraron que la degeneración de la función de los ANs, como lo demuestra la disminución de las amplitudes de ABR P1, fue causada por el daño coclear inducido por LISW. Un posible mecanismo de la sinaptopatía coclear inducida por LISW es la liberación excesiva de glutamato por parte de las IHC, como la ototoxicidad por glutamato²⁶. La exposición a LISW hace que la membrana basilar vibre violentamente, lo que provoca una liberación excesiva de glutamato de la IHQ, lo que da lugar a la degeneración de la NA. La LISW puede replicar el tipo de toxicidad del glutamato que afecta a la cóclea, lo que provoca sinaptopatía coclear y una disminución del número de sinapsis sin dañar las HC. Otro posible mecanismo es que la exposición a LISW puede dañar las células de soporte coclear, lo que contribuye a la supervivencia de los FAN en función de la liberación de neurotrofinas²⁷. Además, la LISW puede transmitirse directamente a los ANF y causar daño neuronal. En consecuencia, nuestros modelos de daño coclear inducido por LISW podrían ser valiosos tanto para la investigación de blastos como para el examen de diversas formas de degeneración coclear que involucran sinaptopatía coclear.

Existe una necesidad urgente de intervenciones terapéuticas para abordar la pérdida auditiva inducida por blastos, lo que pone de relieve la importancia de las estrategias de tratamiento centradas en la sinaptopatía coclear o la interrupción del haz estereociliar en la CHC. Estos enfoques también se pueden aplicar a otros tipos de trastornos auditivos con mecanismos patológicos similares. Se observó sinaptopatía coclear en nuestro modelo de disfunción coclear inducida por blastos, lo que sugiere que puede ser una diana terapéutica prometedora. LISW se puede utilizar para crear modelos de ratón que reproduzcan con precisión la fisiopatología coclear causada por los blastos, y estos modelos se pueden utilizar para estudiar varios tipos de disfunciones cocleares.

Nuestro estudio tiene varias limitaciones. En primer lugar, medimos los umbrales ABR a 12-24 kHz. Según un estudio previo, el daño coclear inducido por LISW provoca una pérdida auditiva de alta frecuencia en los animales debido a las características del SW y a la vulnerabilidad de la base coclear. Son necesarios más estudios de ABR en regiones de frecuencia más amplias (>24 kHz). En segundo lugar, en este estudio, solo realizamos una evaluación histológica de la cóclea y no evaluamos la vía auditiva central. La discapacidad auditiva en la lesión por explosión no solo se limita a la cóclea, sino que es una discapacidad complicada del tronco encefálico y del sistema auditivo central. En el futuro, sería deseable evaluar el centro auditivo en modelos animales expuestos a LISW.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Láser Q-switched Nd:YAG de 532 nm;	Quantel	Brilliant b
ABR software de análisis de picos	Mass Eye and Ear	N/A	EPL Cochlear Function Test Suite
Adhesivo de soldadura de resina acrílica	Acrysunday Co., Ltd	N/A
Microscopía de fluorescencia confocal	Leica	TCS SP8
compuesto de criosección	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 anticuerpo	BD Transducción	#612044
Espejos dieléctricos multicapa	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Osciloscopio	digitalTektronix	DPO4104B
Auricular	CUI	CDMG15008-03A
Hidrófono	RP acústico e.K.
Image J complemento de software Línea de	medición	de los NIH	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Microscopio óptico	Keyence Corporation	BZ-X700
Anticuerpo de miosina 7A	Proteus Biosciences	#25– 6790 y 6790
Anticuerpo de neurofilamento	Sigma	#AB5539
lente plano-convexa	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Software Prisma	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Microscopio electrónico de barrido	JEOL Ltd	JSM-6340F Endoscopio
digital pequeño	AVS Co. Ltd	AE-C1
Jalea ultrasónica	Hitachi Aloka Medical	N/A
Atenuador variable	Showa Optronics Co.	N/A Sucesor	actualmente disponible: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Encapsulante soluble en agua	Dako	#S1964