Aislamiento de mutantes nulos o alterados de interacción mediante el ensayo de dos híbridos de levadura

Las interacciones entre biomoléculas son la parte más básica de los fenómenos biológicos. Las interacciones proteína-proteína constituyen una parte importante de dichas interacciones. Por lo tanto, la identificación de los socios de interacción de una proteína de interés es fundamental para dilucidar aún más la función de la proteína/gen de interés. El método de dos híbridos de levadura (Y2H) es una técnica popular para identificar interacciones proteína-proteína in vivo¹. En este sistema, dos proteínas (X e Y) cuya interacción se va a probar se fusionan con el dominio de unión al ADN (DB) y el dominio de activación transcripcional (AD), respectivamente. La proteína de fusión DB-X se une a una secuencia de reconocimiento del dominio DB; por lo tanto, cuando las proteínas X e Y interactúan, la proteína de fusión AD-Y entra en la proximidad de la secuencia de reconocimiento. En consecuencia, se activa la transcripción del gen reportero aguas abajo de la secuencia de reconocimiento. Por lo tanto, la presencia o ausencia de actividad del gen reportero puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de la interacción proteína-proteína¹.

Una vez que se identifica un socio de interacción específico de la proteína de interés, se deben realizar análisis adicionales para dilucidar la función biológica de la interacción. Para este propósito, si se pueden aislar los mutantes de las proteínas que perjudican o eliminan la interacción específica proteína-proteína, servirán como herramientas poderosas. El sistema Y2H se puede utilizar directamente para aislar dichos mutantes mediante el cribado de clones "negativos para la interacción", empezando por el clon de tipo salvaje "positivo para la interacción". Para acelerar este proceso, se desarrollaron sistemas Y2H "inversos" (rY2H) ^2,3. En los sistemas rY2H, las cepas de levadura huésped albergan genes marcadores contraseleccionables como genes reporteros, lo que significa que las células de levadura crecen solo cuando las proteínas AD-Y y DB-X no interactúan.

Aunque tanto el sistema Y2H como el rY2H permiten el aislamiento de mutantes con interacción negativa, el proceso de aislamiento de los mutantes es laborioso porque no todos los candidatos obtenidos mediante cribado portan el tipo de mutaciones deseado (normalmente mutaciones con cambio de sentido). El problema más grave es que una fracción significativa de los candidatos albergan mutaciones de cambio de marco o sin sentido, y es necesario realizar Western blot para excluir clones no deseados. Para superar este problema, se han desarrollado nuevos vectores plásmidos⁴. En estos vectores, KanMX, un marcador de resistencia a los fármacos, se posiciona fuera de marco aguas abajo del dominio DB o AD. El gen marcador se convierte en marco con el dominio DB o AD solo cuando se inserta el gen de interés. Cuando se introducen mutaciones aleatorias en el gen de interés, los mutantes indeseables, como los que tienen mutaciones con cambio de marco o mutaciones sin sentido, pueden eliminarse fácilmente mediante la selección de resistencia a los fármacos, y los candidatos portadores de mutaciones deseables con cambio de sentido pueden identificarse fácilmente con el cribado Y2H⁴. En este artículo se presenta un protocolo para aislar mutantes nulos/alterados de interacción de una proteína de interés utilizando esta estrategia.

1. Construcción de la biblioteca mutante

1. Configure la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (a continuación se muestra un ejemplo). Generalmente, prepare 50 μL de la reacción, que se divide en diez alícuotas de 5 μL, y amplifique el fragmento de gen objetivo en una máquina de PCR⁴.
   NOTA: Los usuarios deben seleccionar una polimerasa apropiada para introducir mutaciones de manera eficiente. Si el fragmento de ADN que se va a amplificar es corto, se necesita una polimerasa con una tasa de error más alta, como la polimerasa Taq, que carece de actividad de corrección. Si el fragmento de ADN que se va a amplificar es largo, se necesita una polimerasa de mayor fidelidad para reducir el número de mutaciones. Las mutaciones ocurren cada pocos cientos de pares de bases después de 30 ciclos de amplificación con la polimerasa 4 Taq^regular. En los resultados representativos, se utilizó una polimerasa Taq diferente (ver Tabla de Materiales), que tiene mayor fidelidad que la polimerasa Taq regular, y la tasa de mutación fue de uno en 600 pares de bases. En el Archivo Complementario 1 se proporciona un ejemplo de las mezclas de PCR, los detalles del cebador y las condiciones de reacción.
2. Una vez finalizada la PCR, combinar todas las alícuotas de la reacción, confirmar que los fragmentos de ADN de interés han sido amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa, etcétera, y purificar el ADN⁵.
3. Ensamble el fragmento de ADN generado en el paso 1.2 con el vector Y2H apropiado utilizando una estrategia de clonación "sin costuras" (Figura 1).
   NOTA: El sistema de clonación sin interrupciones, como el ensamblaje⁶ de Gibson, minimiza la contaminación de la biblioteca de mutantes construida por vectores vacíos generados a través de la autoligadura. En la Tabla 1 se proporciona una lista de vectores Y2H. Se pueden preparar por digestión BamHI antes del montaje. Todos los plásmidos están disponibles en el Proyecto Nacional de Recursos Biológicos - levadura (ver Tabla de Materiales).
4. Introducir la mezcla de reacción generada en el paso 1.3 en células competentes de Escherichia coli preparadas de acuerdo con un protocolo de transformación de E. coli altamente eficiente (por ejemplo, Inoue et al.7). Extienda todas las células competentes en varias placas de LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% de NaCl y 2% de agar) que contengan antibióticos apropiados (consulte la Tabla de materiales). En este punto, extienda una pequeña cantidad (~1/100 de la reacción total) en la misma placa de selección para calcular el título de la biblioteca. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
5. Una vez que haya aparecido un gran número de colonias de E. coli , raspe todas las células de la superficie de la placa con un asa de plástico desechable. Recuperar ADN plásmido de estas células utilizando métodos populares, como la lisis alcalina⁸. Al mismo tiempo, cuente el número de colonias que aparecen después de esparcir pequeñas alícuotas de la mezcla de transformación en el plato. Con este número, calcule el número total de clones independientes en la biblioteca.
   NOTA: En este punto, recoja algunas colonias independientes (4-6) que aparezcan en la placa en la que se extendieron las pequeñas alícuotas de la reacción de transformación, cultívelas por separado y aísle los plásmidos de ellas para confirmar que prácticamente todos los clones llevan los fragmentos de ADN deseados⁵. Hay muchos kits comerciales disponibles para aislar plásmidos de E. coli. El número de colonias que aparecen en la placa después de esparcir pequeñas alícuotas se puede contar manualmente.
6. Mida la concentración del grupo de ADN de la biblioteca. Por lo general, unos pocos cientos de nanogramos de ADN de biblioteca son suficientes para obtener varios miles de transformantes en el siguiente paso.
   NOTA: Se recomienda medir la concentración de ADN utilizando un tinte fluorescente que se adhiera al ADN porque la medición de A₂₆₀ suele ser inexacta.

2. Transformación de la levadura con la biblioteca de mutantes y revestimiento de réplicas

1. Introducir la biblioteca de mutantes en la cepa de levadura huésped (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)_4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) para el ensayo Y2H utilizando unos 100 ng de ADN. Pretransforme las células huésped con el plásmido 'cebo'.
   1. Después del procedimiento de transformación, suspenda las células de levadura en agua estéril y extienda alícuotas de diferentes cantidades en placas apropiadas (generalmente medio SC sin leucina y triptófano: SC-LW [0,67% de base de nitrógeno de levadura, 2% de glucosa, 1,546 g/L de mezcla de doble abandono SC -Leu-Trp y agar al 2%, ver Tabla de Materiales]). Incubar estas placas durante la noche a 30 °C.
      NOTA: El protocolo estándar, como el método de acetato de litio-PEG¹¹ con ~ 5 × 10⁶ células de crecimiento logarítmico, es suficiente para la transformación de la levadura. También se puede utilizar otro método con una alta eficiencia de transformación, como la electroporación.
2. Al día siguiente, cuando aparezcan colonias diminutas, seleccione las placas con un número adecuado de células (500-2000) y haga réplicas de ellas de la siguiente manera.
3. Coloque dos hojas de papel de filtro en un bloque de réplica para hacer varias réplicas (el medio es SC-LW y SC-LW que contiene kanamicina) (ver Tabla de Materiales). Incubar a 30 °C durante 1-2 días.
   NOTA: La concentración de kanamicina (G418) es de 600 μg/mL. No use terciopelo para el enchapado de réplicas porque se perderá la resolución de las colonias.
4. Una vez que las colonias hayan crecido, compare los platos y elija los candidatos. Realice un ensayo de color Y2H (consulte el paso 3) si se utiliza lacZ como reportero.
   NOTA: Para el reportero Y2H, lacZ suele ser mejor para detectar una interacción débil que HIS3.

3. Ensayo de color Y2H

1. Coloque una hoja de papel de filtro cortada de antemano al tamaño adecuado en la placa de réplica preparada mediante el paso 2. Tenga cuidado de no permitir que se formen burbujas de aire entre el papel de filtro y la placa.
   NOTA: Utilice papel de filtro No. 4A o papel de filtro de grado 50 (consulte la Tabla de materiales). Cualquier placa de kanamicina SC-LW o SC-LW, que se fabrica mediante recubrimiento de réplica, se puede utilizar para el ensayo de color.
2. Cuando el papel de filtro de la placa esté completamente humedecido (cuando el color del papel de filtro cambie por completo), coloque varias hojas de toalla de papel encima y haga que entre en contacto con el papel de filtro para eliminar el exceso de humedad. Retire la toalla de papel cuando absorba el agua y cambie de color. Repite este proceso dos o tres veces.
3. Recoge los bordes del papel de filtro con unas pinzas, despégalo rápidamente de la placa, sumérgelo en nitrógeno líquido y congélalo. Si no dispone de nitrógeno líquido, coloque el papel de filtro en una bandeja de plástico con la colonia hacia arriba e inmediatamente colóquelo en un congelador (de -20 °C a -80 °C) para que se congele por completo.
4. Retire el papel de filtro congelado y colóquelo, con la colonia hacia arriba, sobre una toalla de papel seca para descongelar. Inmediatamente después de descongelar, coloque el papel de filtro, con el lado de la colonia hacia arriba, sobre otro papel de filtro que se haya colocado en una bandeja de plástico o recipiente hermético y empapado con tampón Z (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl y 1 mM MgSO₄, pH 7.0) que contenga X-gal (5-bromo-5-cloro-3-indolil-β-D-galactósido) y 2-mercaptoetanol⁹ (consulte la tabla de materiales). Tenga cuidado de no permitir que se formen burbujas de aire entre los papeles de filtro superior e inferior.
5. Cubra la bandeja de plástico que contiene el papel de filtro y colóquela en un recipiente hermético o en una bolsa de plástico. Cierre el recipiente hermético o la bolsa de plástico e incube a 37 °C hasta que aparezca un color azul.
6. Cuando aparezca un color azul, coloque el papel de filtro con el lado de la colonia hacia arriba sobre unos 500 μL de solución de parada (1 M Na₂CO₃) colocado en una bandeja de plástico limpia. La solución de parada se absorbe rápidamente; Por lo tanto, retire el filtro inmediatamente, colóquelo sobre una toalla de papel limpia con la colonia hacia arriba y deje que se seque.
7. Después de reemplazar la toalla de papel y el filtro esté lo suficientemente seco, use un escáner u otro dispositivo para capturar los datos.

4. Recuperación y confirmación de clones candidatos

1. Seleccione clones candidatos blancos y Kan^R de la placa original de la réplica (o de la placa replicada que no se utilizó para el ensayo de color). Los ejemplos se muestran en la Figura 1C. Confirme que los clones candidatos son blancos y Kan^R volviéndolos a rayar como un pequeño parche en un medio SC-LW que contenga kanamicina e incubándolos a 30 °C durante 1-2 días. Haz al menos dos series o haz réplicas al día siguiente.
   NOTA: Se deben seleccionar colonias blancas porque las colonias de color azul pálido podrían retener la interacción.
2. Una vez que los clones candidatos hayan vuelto a crecer bien, repita el ensayo de color con al menos una placa generada en el paso 4.1 como se describe en el paso 3 y confirme que permanecen blancos y no se vuelven azules (Figura 2A).
   NOTA: Al volver a rayar los candidatos, no lleve grandes cantidades de celdas. Demasiadas células hacen que sea imposible distinguir los clones de Kan^R y Kan^S .
3. Tome clones que aún sean blancos y Kan^R generados en el paso 4.2 a partir de los restos de la placa y cultívelos independientemente en 1 mL de medio de selección (SC-L o SC-W, dependiendo del vector que se utilice para la construcción de la biblioteca) durante la noche a 30 °C.
4. Transfiera el cultivo a un microtubo y recoja las células por centrifugación (~ 15,000 × g, durante 10-30 segundos a temperatura ambiente). Aísle el ADN completo de la célula de la siguiente manera.
5. Suspender el pellet celular en 400 μL de tampón de lisis (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-Cl (8.0) y 1 mM de EDTA) que contenga 1 μL de 2-mercaptoetanol y 20 mg/mL de Zymolyase 100T (ver Tabla de Materiales), e incubar a 37 °C durante 30 min para digerir las paredes celulares. En este momento, mezcle suavemente invirtiendo el tubo cada 5-10 minutos.
6. Cuando la suspensión celular se haya vuelto opaca o translúcida, añadir un volumen igual de una mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y mezclar bien mediante vórtice a velocidad moderada durante 10-20 s.
7. Centrifugar los microtubos en una microcentrífuga durante 5 minutos a máxima velocidad (~15.000 × g, a temperatura ambiente) y recuperar la fase acuosa que contiene el ADN en un nuevo microtubo. Añadir 0,8 volumen de isopropanol y mezclar bien invirtiendo el tubo.
8. Deje el tubo a temperatura ambiente durante 2-3 minutos y luego centrifugar en una microcentrífuga durante 4-5 minutos a máxima velocidad (~15.000 × g, a temperatura ambiente) para precipitar el ADN.
9. Retirar el sobrenadante y lavar el precipitado con unos 500 μL de etanol al 70%. Retire el etanol por completo y seque el precipitado brevemente.
10. Agregue 20 μL de tampón TE (10 mM de Tris-Cl (8.0) y 1 mM de EDTA) al precipitado, mezcle brevemente y deje el tubo durante la noche a temperatura ambiente para disolver el precipitado.
    NOTA: Si los usuarios tienen prisa, mantenga los tubos a 37-50 °C. El precipitado de ADN se disolverá en unas pocas horas.
11. Una vez que el gránulo esté completamente disuelto, transforme E. coli con una pequeña cantidad de esta solución de ADN.
    NOTA: Aproximadamente 0,5 μL de solución de ADN es suficiente si se utiliza E. coli con una alta eficiencia de transformación.
12. Cuando aparezcan colonias de E. coli , elija varias colonias independientes, cultívelas y recupere los plásmidos mediante métodos estándar, como la lisis alcalina.
13. Introduzca el ADN del plásmido obtenido en el paso 4.12 en las células huésped Y2H que albergan el plásmido cebo. Cuando aparezcan los transformantes, compruébelos mediante el ensayo de color (deben aparecer blancos) y el western blot⁴ (deben expresar una proteína del tamaño deseado).
    NOTA: El método post-alcalino¹² es una forma fácil y rápida de preparar un extracto de célula entera a partir de levadura.
14. Si se cumplen los dos criterios anteriores, determine el sitio de mutación de los clones mediante secuenciación de nucleótidos⁴.

Recientemente, se descubrió que la mitad C-terminal de la proteína Pol2 (Pol2-C) interactúa con Mcm10. Ambas proteínas son esenciales para el inicio de la replicación del ADN y, por lo tanto, para el crecimiento celular en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ayudar a comprender la importancia biológica de esta interacción, se aislaron mutantes Pol2-C que no tienen interacción o tienen una interacción disminuida con Mcm10 utilizando el método descrito aquí.

Se construyó una biblioteca de mutaciones siguiendo el método descrito en el paso 1. Los fragmentos de ADN Pol2-C se amplificaron con la polimerasa GoTaq y se clonaron en el vector Gal4AD (pST2525) utilizando la enzima In-Fusion. El número de clones independientes en la biblioteca se estimó en 5000.

Como se describe en el paso 2, el ADN del plásmido de biblioteca se introdujo en la cepa huésped Y2H TAT-7, que se transformó previamente con el plásmido LexA-Mcm10. Las células se extendieron en una placa SC-LW y se replicaron en placas SC-LW y SC-LW+G418 al día siguiente. Las réplicas se sometieron al ensayo de color como se describe en el paso 3. Algunos de los resultados del ensayo de color se muestran en la Figura 1C.

Cuarenta y siete colonias que eran blancas en el ensayo de color y resistentes a G418 fueron aisladas como las primeras candidatas de aproximadamente 8500 transformantes. Se probaron de nuevo con el ensayo de color, y se confirmó que 25 de los 47 clones eran blancos (Figura 2A). Estos 25 clones fueron retenidos como candidatos. Se recuperaron ADN plásmidos candidatos de cada uno de los 25 candidatos como se describe en el paso 4. Se reintrodujeron en las células huésped de levadura Y2H que albergaban LexA-Mcm10 y se probaron con el ensayo de color, y se seleccionaron 16 clones que carecían de color. Para confirmar aún más que se trataba de mutantes de cambio de sentido Pol2-C, la expresión de la proteína Pol2-C se confirmó mediante Western blot. Doce candidatos exhibieron una banda en una posición que era casi la misma que la del control positivo (proteína de fusión Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, calculada m.w.: 158.8 kDa) (Figura 2B). El ensayo de color mostró que estos 12 clones no interactuaron con Mcm10 (Figura 2C). Después de determinar las secuencias de nucleótidos de estos clones, se confirmó que todos ellos tenían una mutación (s) de cambio de sentido. El número de mutaciones de cambio de sentido varió de una a cinco (datos no mostrados). En promedio, se produjo aproximadamente una mutación de cambio de sentido en cada 1000 bases.

Figura 1: Esquemas del enfoque basado en Y2H para el cribado de mutantes nulos/deteriorados por interacción. (A) El sistema Y2H. (B) Estrategia para aislar mutantes de interacción nula/deteriorados. 1: El vector Y2H recién construido contiene una copia del gen KanMX aguas abajo de la etiqueta Y2H, el dominio DB y AD. Es importante destacar que este gen KanMX carece de un codón de inicio y está fuera de marco con la etiqueta Y2H. Por lo tanto, no se espera que el gen KanMX se exprese a partir de este vector. Cuando el fragmento de ADN amplificado por PCR se inserta en el vector, el gen KanMX está en el marco con la etiqueta Y2H y se expresa. En consecuencia, solo los plásmidos que albergan la inserción de tipo salvaje o una inserción con una mutación o mutaciones de cambio de sentido pueden expresar el gen KanMX, que confiere resistencia a G418. Los plásmidos con una mutación sin sentido o con cambio de marco no pueden expresar el gen KanMX. 2: La biblioteca de mutantes construida en el paso 1 se introduce en las células de levadura huésped Y2H. Cuando aparecen los transformadores, se hacen réplicas. Al comparar la expresión de uno o varios genes reporteros y la resistencia a G418, se pueden seleccionar candidatos a mutantes nulos o deteriorados por interacción. (C) Un ejemplo de detección. La biblioteca de plásmidos, que albergaba Gal4-AD y un fragmento de ADN Pol2-C mutagenizado por PCR, se introdujo en la cepa huésped Y2H TAT-7, que se transformó previamente con el plásmido LexA-Mcm10. Se muestran imágenes de células antes (izquierda) y después (centro) del ensayo de color y de células cultivadas en una placa SC-LW+G418 (derecha). Los ejemplos de candidatos de mutantes nulos o deteriorados por interacción y candidatos falsos se indican con puntas de flecha blancas y negras, respectivamente. (D) Secuencia de ADN alrededor del sitio de clonación de los vectores Y2H, vectores AD (arriba) y DB (abajo). Se muestra la secuencia desde los últimos diez aminoácidos (aa) de la etiqueta Y2H (rojo) hasta la porción correspondiente a los primeros diez aa de KanMX (verde). También se muestran los sitios de reconocimiento de SmaI y BamHI. Las posiciones de los cebadores de PCR se muestran en la parte inferior cuando el sitio BamHI se utiliza como sitio de clonación. Los mismos cebadores se aplican para clonar el gen de interés en los otros plásmidos (pST2303/2523). Esta figura ha sido modificada con respecto a Tanaka et al.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Un ejemplo del proceso de selección de mutantes nulos o deteriorados por interacción. (A) Las 47 colonias aisladas como clones candidatos, como se muestra en la Figura 1C, se cultivaron nuevamente en medio SC-LW que contenía G418 y se sometieron al ensayo de color. +: control positivo (Wt Pol2-C), -: control negativo (vector). Los clones candidatos numerados del 1 al 25 se cultivaron para recuperar plásmidos. (B) Se recuperaron plásmidos de cada clon candidato en (A), se introdujeron en las células huésped Y2H y nuevamente se sometieron al ensayo de color. Dieciséis de ellos eran blancos (carecían de color). A partir de ellos se prepararon extractos de células enteras y se realizó Western blot con un anticuerpo monoclonal anti-HA. El número del panel corresponde al número de (A). Se realizaron análisis de varios clones de plásmidos independientes recuperados de cada candidato, excepto el #6. (C) Resultados del ensayo de color para los 12 clones finales. Los números corresponden a los de (A). #16, que conservó la interacción con Mcm10, se utilizó como control positivo en el ensayo de color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de vectores Y2H que contienen KanMX fuera de trama con la etiqueta Y2H.

Archivo complementario 1: Un ejemplo de las mezclas de PCR, los detalles del cebador y las condiciones de reacción. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.