Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

Resumen

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Resumen

Shigella, patógeno bacteriano entérico adaptado al ser humano, causa millones de infecciones cada año, crea efectos de crecimiento a largo plazo entre los pacientes pediátricos y es una de las principales causas de muertes diarreicas en todo el mundo. La infección induce diarrea acuosa o sanguinolenta como resultado de que el patógeno transita por el tracto gastrointestinal e infecta las células epiteliales que recubren el colon. Con el asombroso aumento de la resistencia a los antibióticos y la actual falta de vacunas aprobadas, los protocolos de investigación estandarizados son fundamentales para estudiar este formidable patógeno. Aquí, se presentan metodologías para examinar la patogénesis molecular de Shigella utilizando análisis in vitro de adherencia bacteriana, invasión y replicación intracelular en células epiteliales del colon. Antes de los análisis de infección, el fenotipo de virulencia de las colonias de Shigella se verificó mediante la absorción del colorante rojo Congo en placas de agar. También se pueden considerar medios de laboratorio suplementados durante el cultivo bacteriano para imitar las condiciones in vivo. A continuación, las células bacterianas se utilizan en un protocolo estandarizado para infectar las células epiteliales del colon en placas de cultivo de tejidos en una multiplicidad establecida de infección con adaptaciones para analizar cada etapa de la infección. Para los ensayos de adherencia, las células de Shigella se incuban con niveles reducidos de medios para promover el contacto bacteriano con las células epiteliales. Tanto para los ensayos de invasión como para los de replicación intracelular, la gentamicina se aplica durante varios intervalos de tiempo para eliminar las bacterias extracelulares y permitir la evaluación de la invasión y/o la cuantificación de las tasas de replicación intracelular. Todos los protocolos de infección enumeran las bacterias adherentes, invadidas y/o intracelulares mediante la dilución en serie de lisados de células epiteliales infectadas y la siembra de unidades formadoras de colonias bacterianas en relación con los títulos de infección en placas de agar rojo Congo. En conjunto, estos protocolos permiten la caracterización independiente y las comparaciones para cada etapa de la infección por Shigella de las células epiteliales para estudiar este patógeno con éxito.

Introducción

Las enfermedades diarreicas causadas por patógenos bacterianos entéricos son una importante carga para la salud mundial. En 2016, las enfermedades diarreicas fueron responsables de 1,3 millones de muertes en todo el mundo y fueron la cuarta causa de muerte en niños menores de cinco años ^1,2. El patógeno bacteriano entérico gramnegativo Shigella es el agente causal de la shigelosis, una de las principales causas de muerte diarreica en todo el mundo³. La shigelosis causa una morbilidad y mortalidad significativas cada año en niños de países de ingresos bajos y medianos

Protocolo

1. Preparación de reactivos y materiales

NOTA: Todos los volúmenes son consistentes con un ensayo que utiliza dos placas de 6 pocillos.

1. Medio TSB: Añadir 0,5 L de agua desionizada (DI) a 15 g de medio caldo de soja tríptico (TSB, ver Tabla de Materiales) y autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
2. Medio de sales biliares (TSB + BS): Para preparar TSB que contenga 0,4% (p/v) de sales biliares, vuelva a suspender 0,06 g de sales biliares (BS, consulte la Tabla de materiales) en 15 ml de TSB esterilizada en autoclave. Esterilizar con filtro con un filtro PES de 0,22 μm.<....

Resultados

Se realizaron ensayos de adherencia, invasión y replicación intracelular comparando el tipo salvaje (WT) de S. flexneri 2457T con el ΔVF (ΔVF) de S. flexneri, un mutante que se supone que regula negativamente la virulencia de Shigella. Dado que Shigella utiliza sales biliares como señal para regular la virulencia 17,18,47, los experimentos se realizaron después de un subcultivo bacteriano en medios TSB, así como TSB suplementada con sales biliares al 0,4% (p/v)

Discusión

Este protocolo describe un conjunto de tres ensayos estandarizados para estudiar la adherencia a Shigella, la invasión y la replicación intracelular de las células epiteliales intestinales. Aunque estos métodos no son más que versiones modificadas de los ensayos clásicos de gentamicina utilizados para estudiar la invasión y replicación intracelular de diversos patógenos bacterianos dentro de las células huésped 49,50,51, se deben aplicar consideraciones especiales cuando se estudia Shigella.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y mu; m Filtro de PES	Millipore-Sigma	SCGP00525	Filtro estéril de polietersulfona para esterilizar medios de hasta 50 mL
Tubos de cultivo de 14 mL	Corning	352059	Tubos de ensayo de polipropileno de 17 mm x 100 mm con tapón
Tubos cónicos de 50 mL	Corning	430829	50 mL de polipropileno transparente tubos de centrífuga de fondo cónico con tapa a prueba de
fugas Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Corning	3516	Las placas están tratadas para una fijación óptima de las células
biliares	Sigma-Aldrich	B8756	Proporción 1:1 de colato a desoxicolato
Colorante rojo del Congo	Sigma-Aldrich	C6277	Un colorante diazo aniónico a base de bencidina, >85% de pureza
Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess	Invitrogen	C10283	Para usar con el contador de células automatizado Countess Dimethyl sulfóxido
(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A un reactivo orgánico altamente polar
Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM se complementa con alto contenido de glucosa, piruvato de sodio, GlutaMAX y fenol Suero
bovino fetal rojo (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Gentamicina estéril e inactivada por calor
	Sigma-Aldrich	G3632	La concentración de existencias es de 50 mg/mL
Línea celular HT-29	ATCC	HTB-38	Línea celular de adenocarcinoma; colorrectal en origen
Película de parafina	Bemis	PM999	Película de sellado de laboratorio Placas de
Petri	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Placas de Petri para medios sólidos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific 10010049		concentración 1x; pH 7.4
Seleccionar agar	Invitrogen	30391023	Una mezcla de polisacáridos extraídos de las paredes celulares de las algas rojas para hacer medios de recubrimiento bacteriano
Matraces T75	Corning	430641U	Matraces
de cultivo de tejidos Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Un tensioactivo y emulsionante no iónico común
Tinción de azul de tripán	Invitrogen	T10282	Un colorante para detectar células muertas de cultivo de tejidos; solo las células vivas pueden excluir el colorante
Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056	Reactivo para la disociación celular para el mantenimiento y paso de líneas
celulares Caldo de soja tríptico (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Medios de crecimiento bacteriano

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