Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Resumen

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Resumen

El traumatismo craneoencefálico leve es un trastorno neurológico clínicamente muy heterogéneo. Se necesitan urgentemente modelos animales de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) altamente reproducibles con patologías bien definidas para estudiar los mecanismos de la neuropatología después de un TCE leve y probar terapias. Replicar todas las secuelas del TCE en modelos animales ha demostrado ser un desafío. Por lo tanto, es necesaria la disponibilidad de múltiples modelos animales de TCE para dar cuenta de los diversos aspectos y severidades observados en los pacientes con TCE. CHI es uno de los métodos más comunes para fabricar modelos de roedores de rmTBI. Sin embargo, este método es susceptible a muchos factores, incluido el método de impacto utilizado, el grosor y la forma del hueso del cráneo, la apnea animal y el tipo de soporte e inmovilización de la cabeza utilizados. El objetivo de este protocolo es demostrar una combinación de los métodos de ventana de cráneo adelgazado y lesión por percusión fluida (FPI) para producir un modelo de ratón preciso de rmTBI asociado a CHI. El objetivo principal de este protocolo es minimizar los factores que podrían afectar la precisión y la consistencia del modelado de CHI y FPI, incluido el grosor del hueso del cráneo, la forma y el soporte de la cabeza. Al utilizar un método de ventana de cráneo adelgazado, se minimiza la inflamación potencial debido a la craneotomía y la FPI, lo que da como resultado un modelo de ratón mejorado que replica las características clínicas observadas en pacientes con TCE leve. Los resultados del análisis conductual e histológico utilizando la tinción de hematoxilina y eosina (HE) sugieren que el RMTBI puede conducir a una lesión acumulativa que produce cambios tanto en el comportamiento como en la morfología macroscópica del cerebro. En general, el rmTBI modificado asociado a CHI presenta una herramienta útil para que los investigadores exploren los mecanismos subyacentes que contribuyen a los cambios fisiopatológicos focales y difusos en el rmTBI.

Introducción

Las lesiones cerebrales traumáticas leves, incluidas las conmociones cerebrales y las subconmociones cerebrales, representan la mayoría de todos los casos de lesiones cerebrales traumáticas (>80% de todas las lesiones cerebrales traumáticas)¹. Las lesiones cerebrales traumáticas leves suelen ser el resultado de caídas, accidentes de tráfico, actos de violencia, deportes de contacto (p. ej., fútbol, boxeo, hockey) y combates militares ^2,3. El TCE leve puede provocar eventos neurobiológicos que afectan las funciones neuroconductuales a lo largo de la vida del paciente y aumentan el riesgo de enfermedades neurodegenerativas ^4,5,6. Los modelos animales proporcionan un medio eficaz y controlado para estudiar el TCE leve, con la esperanza de mejorar aún más el diagnóstico y el tratamiento del TCE leve. Se han desarrollado varios modelos para el TCE leve, como el impacto cortical controlado (CCI), la caída de peso (WD), la lesión por percusión líquida (FPI) y los modelos de TBI por explosión ^7,8. Ningún modelo experimental puede imitar toda la complejidad de la patología inducida por TCE ^9,10. La heterogeneidad de estos modelos es ventajosa para abordar las diversas características asociadas con los pacientes con TCE leve e investigar los mecanismos celulares y moleculares correspondientes. Sin embargo, cada modelo animal de TCE tiene sus limitaciones³, lo que limita nuestro conocimiento actual sobre el TCE leve en animales y su relevancia clínica.

Los modelos WD y CCI se utilizan para replicar condiciones clínicas como pérdida de tejido cerebral, hematoma subdural agudo, lesión axonal, conmoción cerebral, disfunción de la barrera hematoencefálica e incluso coma después de un TCE ^3,11,12. El modelo WD consiste en inducir daño cerebral al golpear la duramadre o el cráneo con pesos que caen libremente. El impacto de un objeto pesado sobre un cráneo intacto puede replicar lesiones mixtas focales/difusas; Sin embargo, este método se asocia con poca precisión y repetibilidad del sitio de la lesión, lesión de rebote y una mayor tasa de mortalidad por fracturas de cráneo ^3,11,12. El modelo CCI consiste en aplicar metal accionado por aire para impactar directamente la duramadre expuesta. En comparación con el modelo WD, el modelo CCI es más preciso y reproducible, pero no produce lesiones difusas debido al pequeño diámetro de la punta impactadora¹¹. Durante el modelado FPI, el tejido cerebral se desplaza brevemente y se deforma por percusión. La FPI puede inducir una lesión mixta focal/difusa y replicar la hemorragia intracraneal, la hinchazón del cerebro y el daño progresivo de la materia gris después de un traumatismo craneal. Sin embargo, la FPI tiene una alta tasa de mortalidad debido al daño del tronco encefálico y a la apnea prolongada ^3,12. La craneotomía involucrada en los modelos convencionales de WD, CCI y FPI puede conducir a contusión cortical, lesiones hemorrágicas, daño de la barrera hematoencefálica, infiltración de células inmunitarias, activación de células gliales, tiempo de modelado prolongado y posibles resultados fatales ^3,12.

El TCE leve se caracteriza por una puntuación GCS (escala de coma de Glasgow, GCS) dentro del rango de 13 a 15². El TCE leve puede ser focal o difuso y se asocia tanto con lesiones agudas, como la ruptura de la homeostasis celular, excitotoxicidad, depleción de glucosa, disfunción mitocondrial, alteración del flujo sanguíneo y daño axonal, como con lesiones subagudas, como daño axonal, neuroinflamación y gliosis ^2,3. A pesar de los avances significativos en la delineación de la compleja fisiopatología del TCE, los mecanismos subyacentes del TCE/TCE leve siguen siendo difíciles de alcanzar y requieren más investigación⁹. Dado que el CHI es el tipo más común de TCE¹², este protocolo presenta un enfoque novedoso para crear un modelo de ratón controlado con mayor precisión de la LCTM rm utilizando un dispositivo FPI modificado para realizar el impacto en una ventana de cráneo adelgazado¹³. Al evitar las lesiones inducidas por la craneotomía, el grosor variable del cráneo y las imprecisiones inducidas por la forma, así como las lesiones de rebote, este enfoque pretende superar las principales desventajas asociadas con los modelos WD, CCI y FPI. La aplicación del impacto de la FPI en la ventana del cráneo adelgazada es conveniente para evaluar el daño de los vasos cerebrales después de la RMT-TBI y ayuda a minimizar las altas tasas de mortalidad en algunos modelos, lo que resulta en una mayor semejanza con las características clínicas de los pacientes con TBI.

Protocolo

Todos los procedimientos involucrados en este protocolo se realizaron bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad Normal de Zhejiang, Número de Permiso, dw2019005) y en cumplimiento con el ARRIVE y la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las especificaciones técnicas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Procedimiento de manipulación de animales

1. Los ratones de casa se encuentran en un ambiente controlado con una temperatura de 22-24 °C, una humedad que oscila entre el 40% y el 60%, un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y proporcionan acceso ad libitum al agua y a la comida estándar para ratones. Para el propósito de este experimento, se utilizaron 25 ratones machos ICR (25-30 g, 8 semanas de edad).
2. Asigne aleatoriamente los ratones al grupo de control (n = 12) o al grupo rmTBI (n = 13). Para prevenir la posible agresión de los ratones falsos hacia los ratones que se sometieron a RMTBI, sepárelos en jaulas distintas.
3. Dé a los ratones al menos 1 semana para que se aclimaten a su entorno de jaula antes de comenzar el experimento. Este período de aclimatación asegura que los ratones se familiaricen con su entorno y minimiza los impactos potenciales del estrés o la ansiedad en las respuestas fisiológicas o conductuales durante el estudio.

2. Preparación del dispositivo TBI

1. Fabricar el modelo rmTBI en ratones utilizando un dispositivo FPI modificado (ver Tabla de Materiales; Figura 1A) ¹³. Antes de usar el dispositivo FPI, inspeccione cuidadosamente todas las conexiones en busca de signos de fugas o grietas, prestando especial atención a las uniones entre el cilindro y la tubería, y entre el conector de tres vías y la tubería. Para determinar con precisión las presiones de impacto, se instaló un transductor de presión hasta el punto de impacto en el dispositivo de lesión por percusión de fluido¹³.
2. Realice una inspección cuidadosa del dispositivo FPI para asegurarse de que el pistón se mueva suavemente dentro del cilindro y que los impactos se puedan realizar de manera efectiva (Figura 1B). Verifique que no haya burbujas de aire presentes dentro del sistema. Si se detectan burbujas de aire, agregue con cuidado agua destilada al sistema con una jeringa de 50 ml y expulse las burbujas de aire empujando rápidamente la varilla del cilindro a través de un conector de 3 vías cercano y/o a través de la jeringa.
   NOTA: El sistema FPI consiste en agua destilada dentro del cilindro y tubería conectada. Es crucial calibrar el dispositivo antes de operarlo para garantizar la precisión y confiabilidad de los resultados.

3. Preparación del cráneo adelgazado

NOTA: La cirugía con animales y la preparación del cráneo adelgazado no deben realizarse a la vista de otros ratones. La ventana del cráneo adelgazado es útil para evaluar el daño de los vasos cerebrales después de un procedimiento de FPI.

1. Cumplir con los requisitos del centro de animales instruyendo al operador experimental para que use una bata y mascarilla estériles durante todos los procedimientos de manejo de animales.
2. Desinfecte la mesa de laboratorio, el dispositivo FPI, el tubo anestésico y el contraespacio adyacente antes de comenzar el experimento con un aerosol de etanol al 70%.
3. Pesar a los ratones en los grupos simulado y rmTBI antes de la cirugía y comparar sus pesos con los registrados 1 semana antes del experimento. Excluya del estudio a cualquier ratón que muestre mala salud, como pelaje áspero, diarrea, pérdida de peso o letargo. Además, excluya a los ratones que pesen menos de 20 g para garantizar su capacidad de tolerar impactos repetidos. Estas medidas son cruciales para mantener el bienestar animal y garantizar resultados experimentales fiables.
4. Anestesiar ratones con isoflurano al 4%-5% (en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) durante 3-4 min en una cámara de inducción. Administrar un lubricante oftálmico (ver Tabla de Materiales) en los ojos del animal para mantener la lubricación durante toda la cirugía. Para mitigar el dolor, administrar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mg/kg) en el punto medio entre las orejas 20 min antes de la anestesia y posteriormente cada 6 h durante 24 h. Además, al final de la anestesia, administrar una dosis subcutánea única de 5 mg/kg de carprofeno a cada animal.
5. Desinfecte la cabeza después de que el ratón haya perdido sus reflejos de enderezamiento y retirada del pedal. Recorta el pelaje de la cabeza del ratón con unas tijeras quirúrgicas y usa una afeitadora para quitar el pelaje restante. Desinfecte el cuero cabelludo con tres aplicaciones secuenciales de clorhexidina al 2%, intercaladas con exfoliantes de etanol al 75%.
6. Coloque una almohadilla quirúrgica estéril desechable debajo del animal y el área circundante para garantizar una higiene adecuada. Realice una incisión de 1,5 cm con una tijera quirúrgica pequeña y fina a lo largo de la línea media del cuero cabelludo del ratón para exponer completamente el sitio quirúrgico (Figura 2A).
7. Asegure el ratón utilizando barras auditivas no terminales en un marco estereotáxico convencional (consulte la tabla de materiales). Ajuste la posición de la cabeza del ratón en un marco estereotáxico a un nivel plano o un ángulo ligeramente inclinado de acuerdo con el área objetivo específica que se investigará. Limpie el pelaje de la zona quirúrgica para evitar inflamaciones posteriores.
8. Mantenga la temperatura corporal del ratón a 37 °C utilizando una almohadilla térmica isotérmica convencional (consulte la tabla de materiales).
9. Durante el proceso de instalación quirúrgico y del cubo de impacto (Luer Lock hembra), mantenga la anestesia del ratón (sin respuesta al pinzamiento de la punta o la cola) con un cono de nariz que proporciona una concentración continua de isoflurano del 2%, regulada por un vaporizador calibrado.
10. Limpie cuidadosamente el área quirúrgica alrededor de la ventana del cráneo adelgazado con un hisopo de algodón estéril empapado en solución salina.
11. Cree una ventana de cráneo adelgazado, de aproximadamente 2,5 mm de diámetro y 20 μm de grosor, en la corteza motora frontal derecha utilizando una microbroca de punta plana (véase la Tabla de materiales, Figura 2B) y una cuchilla microquirúrgica. Ubicar el sitio quirúrgico a 1,5 mm anterior al bregma y 1,3-2,0 mm lateral a la línea media (Figura 2C).
    1. Para evitar que el microtaladro penetre en el cráneo durante la creación de la ventana del cráneo adelgazado, humedezca intermitentemente el cráneo con solución salina mientras muele con el microtaladro.
    2. Confirme el grosor del cráneo sondeando suavemente el cráneo adelgazado con la punta aplanada de una aguja de jeringa fina y evaluando su suavidad. Estimar visualmente la claridad de los microvasos corticales expuestos para determinar el grosor del cráneo.
    3. Para verificar el grosor del cráneo, aplique solución salina estéril en el área adelgazada e inspeccione visualmente con un microscopio de disección convencional (consulte la tabla de materiales). Esta técnica puede ayudar a asegurar que el cráneo se haya adelgazado adecuadamente.
       NOTA: Lubrique el ojo del ratón durante toda la preparación del cráneo adelgazado y el procedimiento de modelado rmTBI para evitar que se seque. El adelgazamiento del cráneo a menos de 15 μm conlleva el riesgo de un traumatismo cortical leve que puede dar lugar a una inflamación cortical leve¹⁴.
12. Fije un Luer Lock hembra ajustado (2,2 mm de diámetro interior, creado a partir de un cubo de aguja de 19G, como se muestra en la Figura 2D) en el sitio del cráneo adelgazado. Asegure el Luer Lock con pegamento y cemento dental (Figura 2E).
    NOTA: Al usar pegamento para asegurar la cerradura Luer hembra al área alrededor de la ventana del cráneo adelgazado, es crucial secar completamente el área del cráneo y evitar que el adhesivo ingrese a la ventana. El adhesivo dentro de la ventana puede reducir significativamente la fuerza de impacto del FPI.

4. Procedimiento de modelado de rmTBI asociado a CHI

1. Introducir rmTBI utilizando el método de percusión de fluido lateral con un dispositivo FPI modificado como se describió anteriormente^13,15.
2. Después de completar los procedimientos de ventana de cráneo adelgazado y centro de impacto, transfiera el mouse del aparato estereotáxico a la plataforma de impacto.
3. Dados los posibles efectos de la anestesia sobre el tiempo del reflejo de enderezamiento de los animales y la gravedad de la lesión después de la percusión ^9,16, monitorizar la profundidad de la anestesia evaluando los reflejos palpebrales y de retirada de las patas (Figura 2F).
4. Conecte el Luer Lock hembra, que estaba pegado a la ventana del cráneo adelgazado, al Luer Lock macho en el extremo del tubo del dispositivo FPI (Figura 2G).
   NOTA: En el modelo rmTBI, la anestesia inducida por isoflurano en ratones se prolongó debido a la inducción de apnea e inconsciencia por percusión.
5. Introduzca dos TCE leves (intervalo de 48 h) con el dispositivo modificado. Aplique el primer impacto FPI inmediatamente después de completar la cirugía de ventana de cráneo adelgazado e instalar el Luer Lock. Solo administre el impacto de FPI una vez que el ratón muestre el retorno de un reflejo de retirada a un pellizco de pata en cada ocasión (Figura 2H). La aplicación de un impacto de FPI en ratones profundamente anestesiados puede causar apnea prolongada y la muerte.
   1. Para aplicar el impacto FPI, eleve el péndulo al grado designado a lo largo del transportador en el dispositivo y suelte el péndulo usando el control de software^13,15. El impacto debe alcanzar una intensidad de percusión de 2,0 ± 0,1 atm, siguiendo los protocolos establecidos en los estudios con roedores 10,17,18. Excluir a los animales de las pruebas adicionales si el impacto no se registró entre 1,9 y 2,1 atm o si se produjo una fractura de cráneo durante la FPI.
   2. En el caso de los ratones falsos, fíjelos en el aparato, pero no provoquen el impacto.
6. Después del impacto, desconecte inmediatamente la conexión Luer Lock y transfiera los ratones a una almohadilla térmica isotérmica para su recuperación. Después de que el ratón recupere el estado de alerta y la conciencia, devuélvalo a su jaula de origen sin quitar el bloqueo Luer hembra. Administrar el segundo impacto de FPI, de la misma manera, 48 h después.
7. Después de la rmTBI, retire con cuidado el mechón Luer hembra y el cemento dental. Suturar el cuero cabelludo con adhesivo tisular y utilizar pinzas planas para pellizcar el cuero cabelludo y facilitar el proceso adhesivo (véase la Tabla de Materiales; Figura 2I).
8. Para prevenir la inflamación, la infección y aliviar el dolor y las molestias posquirúrgicas, aplique una mezcla de ungüento de eritromicina y diclofenaco de sodio en una proporción de 1:1 (ver Tabla de materiales) a la herida. Transfiera los ratones a una almohadilla térmica isotérmica para su recuperación.
9. Registre la duración del reflejo de enderezamiento, que comienza cuando el ratón se retira del aparato estereotáxico y se coloca lateralmente en la plataforma impactadora para FPI y continúa hasta que el ratón puede mantenerse en posición vertical de forma independiente.
10. Después de que el ratón recupere el estado de alerta y la conciencia, devuélvelo a su jaula de origen. Por lo general, los ratones están completamente conscientes y pueden caminar dentro de 1,5 horas después de la lesión.
11. En los días posteriores al modelado de la lesión cerebral traumática, observe a los ratones para detectar varios signos, incluidos patrones de respiración, presencia de moco alrededor de la nariz y la boca, y enrojecimiento, hinchazón, exudados o reapertura del área de la herida. Excluir del estudio a los animales que presenten uno o más de los síntomas anormales mencionados.
    NOTA: La pre-microinyección de AAV-GCaMP6s permite observar la homeostasis y excitabilidad neuronal subyacente de Ca2+ en la corteza lesionada a través de la ventana del cráneo adelgazado utilizando microscopía de barrido láser de dos fotones¹⁵.

5. Prueba del laberinto acuático de Morris (MWM)

NOTA: El MWM (ver Tabla de Materiales) es un método ampliamente reconocido para evaluar el aprendizaje espacial y los déficits de memoria en ratones después de una lesión cerebral traumática.

1. Realizar la prueba MWM a partir de los 7 días posteriores a la lesión (DPI). La piscina circular del MWM tenía un diámetro de 120 cm y una altura de 50 cm, con la temperatura del agua mantenida a 25 °C. Separe la piscina circular en cuatro cuadrantes, con la plataforma de escape, una plataforma redonda con un diámetro de 6 cm y una altura de 30 cm, sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua en el cuadrante noreste.
2. Coloque una cámara directamente sobre la piscina circular para registrar la trayectoria del movimiento de los ratones. Marque los ratones con cinta negra en la espalda para facilitar el reconocimiento por parte del software de adquisición de imágenes y para el registro de datos, incluida la latencia, la distancia de natación y la trayectoria del movimiento.
3. Coloque los ratones en el agua, mirando hacia la pared interior de cada uno de los cuatro cuadrantes, una vez por cada cuadrante. Una vez que los ratones encuentren la plataforma, déjelos descansar allí durante 10 segundos. Si un ratón no logra encontrar la plataforma en un plazo de 60 s, pida al operador que guíe al ratón hasta la plataforma, déjelo descansar en la plataforma durante 10 s y, a continuación, devuelva el ratón a su jaula de origen para que descanse.
4. Repita para cada ratón la prueba de adquisición 4 veces al día. Después de las pruebas de adquisición, en 12 DPI, realizó un experimento de sonda espacial de 60 s y registró el número de veces que los ratones cruzaron el área original de la plataforma y la duración de la estancia del ratón en el cuadrante donde se encontraba la plataforma.
5. Después de cada ensayo, seque rápidamente los ratones con una toalla o colóquelos debajo de una lámpara de calentamiento para mantener su temperatura corporal y prevenir la hipotermia durante la prueba de adquisición de 60 s de DPI 7 a DPI 11.
6. Después de completar los procedimientos experimentales descritos anteriormente, anestesiar a los ratones con pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) a 13 DPI. Perfundir solución salina isotónica por vía transcárdica, seguida de perfusión con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2). Recuperar los cerebros para la tinción convencional de HE para evaluar las alteraciones de la morfología cortical macroscópica y del hipocampo. Una descripción detallada del protocolo de tinción de HE se puede encontrar en publicaciones anteriores^13,15.
7. Una vez finalizados todos los experimentos, se debe aplicar la eutanasia al ratón mediante una inyección de pentobarbital por sobredosis (≥100 mg/kg, i.p.) si no se necesitan muestras de ratón. Antes de recolectar pañuelos o deshacerse del cadáver, controle al ratón hasta que no haya latidos cardíacos durante al menos 60 segundos.

Resultados

El protocolo descrito en este estudio describe un método para inducir RMTBI a través de una ventana de cráneo adelgazada, que ofrece una solución a la lesión cerebral causada por la preparación de la craneotomía durante el modelado convencional de TBI por percusión. Al utilizar este procedimiento de percusión de fluido modificado con el dispositivo modificado, se logró una mayor precisión y reproducibilidad del impacto de FPI¹³. El impactador modificado tiene la versatilidad para ser utilizado tanto para el modelado CHI como para el FPI, con o sin craneotomía de cráneo. Además, la gravedad de la lesión se modula ajustando los parámetros de la lesión, como el ángulo de caída del péndulo de impacto, o añadiendo almohadillas de espuma de etileno-acetato de vinilo de célula cerrada adicionales de diferente dureza a la placa final del polo del pistón.

El modelo rmTBI modificado proporciona ventajas significativas, como producir patología focal y difusa sin exponer la cortical dural, lo que minimiza la inflamación por exposición meníngea y/o FPI directa sobre el parénquima. Además, este modelo reduce las variaciones en el grosor y la forma del hueso del cráneo para producir resultados de lesiones confiables. Por lo tanto, el modelo rmTBI modificado es eficaz y fiable para simular déficits neuropatológicos y conductuales relacionados con los síntomas post-conmoción cerebral (PCS) clínicamente relevantes en diferentes grados de lesión. En particular, este modelo es útil para investigar los mecanismos patológicos de TCE que dependen de la precisión y reproducibilidad de los modelos animales de TCE, especialmente para investigar los mecanismos leves relacionados con el TCE.

La rama lateral frontal de la arteria cerebral media del ratón y la vena rinal caudal¹⁹, situadas debajo del cráneo adelgazado, permitieron una visualización clara bajo la cámara. Después de dos percusiones de rmTBI, cada una a una presión de aproximadamente 2,0 atm, todos los ratones exhibieron hematomas subdurales a 0 DPI. Aunque la integridad del cráneo adelgazado no parecía estar comprometida; sin embargo, se observó una reducción en el número de microvasos junto con cambios en la morfología de la microvasculatura (Figura 2H), como se informó previamente¹⁵. A los 2 DPI, los hematomas se resolvieron en gran medida. La mortalidad se produce principalmente por el impacto mientras el ratón está bajo anestesia profunda, lo que puede prolongar significativamente la apnea. La evaluación regular de la profundidad de la anestesia antes del impacto a través de los reflejos palpebrales y de retirada de las patas puede reducir sustancialmente la mortalidad. Otros factores que pueden afectar a las tasas de mortalidad tras la percusión de fluidos son la tensión del ratón, la dureza del cráneo, el sexo y la edad. En un estudio anterior que utilizó el mismo protocolo rmTBI, un ratón C57BL/6J había muerto¹⁵ años. En este protocolo, solo se utilizaron ratones machos ICR para introducir todos los procedimientos.

Tanto los estudios en humanos como en animales han demostrado que incluso los impactos subconmocionales repetitivos en la cabeza pueden causar lesiones microestructurales generalizadas de la materia blanca 20,21,22, que se asocian con un peor rendimiento cognitivo ^21,22. A 7-12 DPI, rmTBI puede producir deficiencias en el aprendizaje espacial y la memoria, que se examinaron utilizando el paradigma MWM. En la figura 4 se ilustran los resultados obtenidos de esta evaluación.

El análisis del último ensayo de adquisición en el MWM demostró un aumento significativo (p< 0,05) en la latencia de los ratones rmTBI para llegar a la plataforma sumergida, en comparación con el grupo control. En el ensayo de sonda, el análisis del porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante de la plataforma original demostró una reducción significativa (p<0.01) en el grupo rmTBI en relación con el grupo de control, lo que indica una disminución en las capacidades de aprendizaje y memoria de referencia espacial en ratones con rmTBI.

El método descrito aquí se utilizó en una publicación anterior¹⁵ utilizando los ratones C57BL/6J. Además del MWM, se llevaron a cabo tres análisis adicionales, como se describe a continuación.

El OFT se utilizó para evaluar las capacidades de locomoción y exploración midiendo la velocidad media de viaje, la distancia total recorrida y el porcentaje de distancia recorrida en las zonas centrales. Realice una prueba de campo abierto (OFT) a 6 DPI para evaluar la locomoción, la exploración y la ansiedad en ratones. El dispositivo de prueba mide 40 x 40 x 40 cm, que se dividió en 16 zonas (cada una de 18 x 18 cm). El ratón se colocó en el centro del dispositivo y se le permitió explorar libremente durante 5 minutos. Se registró la distancia recorrida en las 4 zonas centrales, la distancia total recorrida, la velocidad media de desplazamiento y el tiempo de permanencia en las zonas fronterizas. Los niveles de ansiedad se evaluaron a partir del porcentaje de distancia recorrida en las zonas centrales y el tiempo de permanencia de los roedores en las zonas limítrofes durante un período de observación de 5 min. A 6 DPI, es posible que el RMTBI no tenga un impacto significativo en las habilidades locomotoras generales de los ratones, puede inducir una ansiedad significativa y alterar el comportamiento exploratorio, como se muestra en la Figura 4¹⁵. Además, el modelo rmTBI modificado induce lesiones axonales difusas, que pueden evaluarse a través de pruebas conductuales adicionales, como la prueba de capacidad cognitiva descrita en este protocolo.

Se ha demostrado que RmTBI afecta el trabajo espacial y la memoria de referencia en ratones, como se ilustra en la Figura 5¹⁵. Estas funciones cognitivas se evaluaron mediante la prueba Y-maze. La prueba se realizó a 8 DPI para medir los déficits de memoria de trabajo a corto plazo en ratones. Para el comportamiento de alternancia espontánea: se utilizó un dispositivo acrílico Y-maze (20 cm de alto, 50 cm de largo y 10 cm de ancho en la parte inferior). Después de colocar el ratón en el centro del dispositivo y permitirle explorar durante 8 minutos, se registraron las entradas del brazo. El comportamiento de alternancia espontánea se define como la entrada sucesiva del ratón en los tres brazos en conjuntos de tripletes. Calcule la tasa de alternancia espontánea (%) como (series sucesivas de tripletes / número total de entradas de brazo menos 2) x 100. Para la memoria de referencia espacial, durante el entrenamiento de 8 minutos, cierre aleatoriamente un brazo del dispositivo Y-maze. Después de 1 h después de la exposición inicial, el ratón se reintroduce en el laberinto con los tres brazos abiertos y se le permite explorar libremente durante 3 minutos. Se registra el tiempo dedicado a explorar el nuevo brazo en comparación con los otros dos brazos. Calcule el índice de preferencia como el tiempo empleado en el nuevo grupo frente al tiempo empleado en los tres grupos.

Además, sugerimos evaluar las lesiones estructurales macroscópicas en el cerebro mediante tinción HE simple (Figura 6)¹⁵ al completar todas las pruebas conductuales. Utilice la región cortical seccionada coronalmente desde 1 mm anterior al sitio de la lesión hasta el margen posterior de la lesión, y la región del hipocampo seccionada coronalmente en la zona típica en forma de media luna (Bregma: -1,7 a -2,2 mm). El conteo de neuronas en cada diapositiva de seis campos aleatorios utilizando una cuadrícula ocular (aumento de 400x) y el promedio del número neuronal proporcionaron la densidad numérica por campo visual (densidad numérica). Se encontró que las regiones cerebrales afectadas por RMTBI exhiben diversos grados de lesiones neuronales¹⁵. Específicamente, la corteza motora demostró una extensión más potente y variada de tales lesiones que el hipocampo. La tinción con HE mostró un cambio considerable hacia la morfología picnótica de las neuronas normales (Figura 6A,B,E,F). Además, se observó que la matriz extracelular se aflojaba específicamente en la región de la lesión (Figura 6F). Además de las áreas aflojadas de la matriz observadas, los ratones rmTBI también mostraron un aumento significativo en la tinción hipercrómica, observada como un color rojo más oscuro, en un número significativo de neuronas subgranulares en el giro dentado y algunas neuronas corticales y CA1. Curiosamente, estos patrones de tinción no presentaron ningún signo acompañante de contracción citoplasmática o núcleo picnótico (Figura 6C, D, G, H, K⁾¹⁵. Los métodos de tinción conductual (a excepción de la prueba WMM) y HE mencionados anteriormente se detallaron en una publicación reciente, que introdujo el modelo rmTBI modificado¹⁵.

Figura 1: El dispositivo FPI modificado y la captura de pantalla del software. (A) El dispositivo FPI modificado. (B) La captura de pantalla muestra la forma de onda de presión FPI y la medición y exportación automáticas de los parámetros de presión de impacto en tiempo real, como el tiempo de subida, el tiempo de caída y la duración de la mitad del ancho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Modelo de ratón modificado de rmTBI en ratones ICR. (A) Se realiza una incisión en la línea media para exponer el área quirúrgica. (B) Se fabricó una ventana de cráneo adelgazada en la corteza motora. La claridad de los microvasos corticales expuestos se utiliza para determinar el grosor del cráneo. (C) El grosor del cráneo también se puede verificar sondeando suavemente el cráneo adelgazado con la punta aplanada de una aguja de jeringa fina y evaluando su suavidad. (D) La hembra Luer Lock estaba pegada a la ventana del cráneo adelgazado. (E) El Luer Lock hembra adjunto se aseguró aplicando el cemento dental. (F) La profundidad de la anestesia se controló mediante la comprobación de los reflejos palpebrales y de retirada de las patas. (G) El impacto del FPI se produjo después del regreso de un reflejo de retirada a un pellizco de la pata. (H) Imagen post-rmTBI de la ventana del cráneo adelgazado a 0 DPI. (I) El cuero cabelludo fue suturado con adhesivo tisular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Los efectos de rmTBI en el aprendizaje de referencia espacial y la memoria en ratones ICR. (A) El rastro de navegación de los ratones durante el último ensayo de adquisición registrado a 11 DPI, (B) la ruta espacial de la sonda en el ensayo de sonda registrado a 12 DPI, y (C) el tiempo de escape que tardaron los ratones en localizar la plataforma durante el último ensayo de adquisición. Los resultados revelaron que el grupo rmTBI tardó significativamente más en llegar a la plataforma oculta que el grupo de control (p<0,05). (D) El porcentaje de tiempo que los ratones pasaron en el cuadrante de la plataforma original en relación con el tiempo total de navegación durante el ensayo de la sonda fue significativamente menor en el grupo rmTBI que en el grupo control (p<0.01). n=8. *p<0.05, **p<0.01 vs. control por prueba t no apareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los efectos de rmTBI en la locomoción, la exploración y la ansiedad en ratones C57BL/6J. (A) Trazas representativas del movimiento de los ratones control y rmTBI durante 5 min OFT. (B-E) Los datos resumidos muestran la distancia recorrida en las zonas centrales, la distancia total recorrida, la velocidad media de viaje y el tiempo empleado en las zonas periféricas, respectivamente. Control, n=13; rmTBI, n = 12. Pág<. 01 vs. control por t-test no apareado. Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Los efectos de rmTBI en el trabajo espacial y la memoria de referencia en ratones C57BL/6J. (A, B) Rastros representativos del movimiento de los ratones de control y rmTBI durante el trabajo espacial y las evaluaciones de la memoria de referencia en el laberinto Y. La prueba de alternancia espontánea del laberinto en Y es un método comúnmente utilizado para evaluar la memoria a corto plazo en modelos de roedores¹⁵. (C) Resumen de las tasas de alternancia espontánea de ratones control y rmTBI durante la evaluación del trabajo espacial. Los roedores suelen preferir explorar un nuevo brazo del laberinto en lugar de volver a visitar uno que ya han explorado. Se calcula un índice de preferencia basado en el tiempo que los roedores pasan en el nuevo brazo en comparación con el tiempo que pasan en los tres brazos, y luego se analiza este índice. (D) Resumen del índice de preferencia de los ratones control y rmTBI durante la evaluación de trabajo espacial. Control, n=13; rmTBI, n=12. Pág<. 01 vs. control por t-test no apareado. Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Comparación de la tinción HE de la corteza motora lesionada ipsilateral y la subregión del giro dentado del hipocampo entre el control y el rmTBI en ratones C57BL/6J. (A, B) Corteza motora normal; y (C, D) la región del hipocampo de los ratones control en diferentes aumentos. (E, F) Corteza motora lesionada y regiones del hipocampo (G, H) de ratones rmTBI. Las neuronas hipercrómicas en la corteza y CA1 pueden haber sido ligeramente afectadas por la preparación de la cirugía o por el RMTBI sostenido; sin embargo, se observaron neuronas hipocrómicas (posiblemente lesionadas intermedias) y picnóticas (neuronas apoptóticas) en la corteza motora de ratones rmTBI en comparación con las neuronas normales de los ratones de control. Estas características de apoptosis neuronal incluyeron la contracción del citoplasma neuronal y del núcleo, acompañada de una vacuolación aparente. En particular, la línea blanca de demarcación en (E) representa el límite entre la lesión y el tejido circundante. Además, las neuronas hipercrómicas en la subregión DG (H) posiblemente se referían a neuronas granulares inmaduras y maduras recién generadas. Los gráficos de barras a continuación muestran la distribución de las neuronas normales y afectadas por rmTBI en las subregiones (I) de la corteza motora y del hipocampo (J) CA1 y (K) DG. Control, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 vs. control por t-test no apareado. Esta cifra ha sido modificada de¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El traumatismo craneoencefálico se refiere a dos tipos principales, el cerrado y el penetrante, este último caracterizado por una alteración del cráneo y la duramadre. Los datos clínicos sugieren que las CHI son más prevalentes que las lesiones penetrantes ^1,2. Después de un solo TCE leve, la mayoría de los pacientes experimentan síntomas de PCS que generalmente se resuelven en un corto período de tiempo, y existe controversia con respecto a la proporción de pacientes cuyo PCS se convierte en secuelas a largo plazo^23,24. En consecuencia, los investigadores han cambiado su enfoque a modelos repetitivos de CHI para comprender mejor los efectos acumulativos^{de las} conmociones cerebrales múltiples, que ocurren comúnmente en caídas, accidentes de tráfico y deportes de contacto. Estos impactos repetidos pueden conducir a efectos más severos y a largo plazo^26,27. Mediante el uso de modelos repetitivos de CHI, los investigadores pueden explorar los posibles efectos aditivos o sinérgicos de múltiples conmociones cerebrales y obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes que contribuyen al PCS. Estos modelos pueden facilitar el desarrollo de intervenciones terapéuticas específicas para mitigar las consecuencias a largo plazo de los impactos repetidos en la cabeza.

A pesar de que algunos modelos de CHI intentan simular tanto el TBI focal único como el RMTBI mediante la incorporación de fuerzas lineales y de rotación, estos modelos pueden dar lugar a lesiones de rebote e imprecisiones en la gravedad de las lesiones debido a factores como la fractura de cráneo, la morfología y el grosor del cráneo, la apnea animal extendida¹⁰ y la variabilidad en los parámetros de entrada mecánica, particularmente cuando se incorpora el movimiento rotacional de la cabeza⁹. Los métodos de impacto controlado por pistón y caída de peso se utilizan comúnmente para inducir rmTBI en modelos animales de CHI²⁵. El impacto controlado por pistón permite un ajuste preciso y ajustable de los parámetros de impacto mediante el uso de dispositivos de impacto electromagnéticos o neumáticos, lo que permite una alta reproducibilidad del impacto. Sin embargo, el uso del impacto controlado por pistón, ya sea en la corteza expuesta como en el CCI o en el cráneo cerrado, todavía requiere una inmovilización estricta de la cabeza del animal en un marco estereotáxico durante el impacto. Por el contrario, los métodos de caída de peso requieren materiales simples y rentables que sean fáciles de configurar, pero la contrapartida es una variabilidad algo alta en la gravedad de la lesión²⁵.

El modelo FPI generalmente induce lesiones focales y difusas mixtas, lo que permite la fabricación de lesiones cerebrales traumáticas de diversa gravedad. A pesar de sus ventajas, el modelo FPI también tiene limitaciones potenciales. Al igual que el modelo CCI, la FPI aún requiere craneotomía, un procedimiento quirúrgico que puede inducir inflamación en el tejido cerebral¹⁷. Además, incluso la FPI leve penetra con frecuencia en la duramadre a diferentes profundidades, lo que puede introducir confusiones en la interpretación de los datos. Por lo tanto, los modelos CCI y FPI tienen limitaciones para replicar las características clínicas observadas en pacientes con TCE leve⁹. Por lo tanto, presentamos un protocolo que combina la ventana de cráneo adelgazado y los métodos FPI, que se puede utilizar para producir un modelo de ratón más preciso de rmTBI asociado a CHI. El objetivo de este protocolo es reflejar fielmente las características clínicas de los pacientes con TCE leve. Un modelo altamente reproducible sería una herramienta invaluable para investigar los mecanismos subyacentes a la fisiopatología del TCE leve y evaluar posibles intervenciones terapéuticas.

Los hallazgos de nuestra investigación sobre el TCE RM se alinean con publicaciones anteriores que utilizaron ventanas de cráneo adelgazadas para investigaciones de TCE leves^28,29. Por ejemplo, Ren et al. crearon una ventana de cráneo adelgazada con un grosor de aproximadamente 30 μm en la corteza de asociación parietal izquierda, induciendo un TCE leve presionando suavemente la ventana con un extremo romo de 1 mm de diámetro a partir de un instrumento estereotáxico quirúrgico²⁹. Su estudio mostró una notable expansión de la muerte celular y la expresión de especies oxidativas reactivas (ROS) en la corteza lesionada²⁹. Para investigar el RMTBI, Nguyen et al. aplicaron tres CCI con una punta de impacto modificada (punta redonda de silicona de 3 mm de diámetro de 1,5 mm de grosor) en una ventana de cráneo adelgazado de ratón (20-40 μm de grosor) en la corteza de asociación parietal²⁸. Para proteger y mantener la transparencia del área del cráneo adelgazado para la obtención de imágenes a largo plazo, cubrieron la ventana del cráneo adelgazado con una capa delgada de pegamento de cianoacrilato. Los tres CCIs se realizaron una vez por semana durante 3 semanas, con parámetros de impacto de 4 m/s de velocidad y 2 mm de profundidad. Como resultado de los tres CCIs, los ratones mostraron astrogliosis evidente y activación microglial²⁸. Dado que el uso de la ventana de adelgazamiento del cráneo como modelo para el TCE/TCE leve es relativamente reciente, se requiere más investigación para examinar la relación entre la gravedad/progresión de la lesión y las diferentes técnicas de impacto. Por ejemplo, en un estudio previo, pudimos observar cambios evidentes en la morfología celular después de dos FPIs que se administraron con un intervalo de 2 días¹⁵. Mientras tanto, en otros estudios, una sola compresión suave en la ventana del cráneo adelgazado indujo un TCE leve con muerte celular evidente y expresión de especies oxidativas reactivas²⁹, y tres ICC semanales resultaron en astrogliosis robusta y activación microglial²⁸.

Se deben seguir varios pasos con cautela para fabricar un modelo de lesión coherente utilizando el método descrito. Durante la operación de la ventana del cráneo adelgazado, en función de diferentes áreas objetivo (por ejemplo, nos centramos en la corteza motora), la cabeza del ratón debe fijarse en un marco estereotáctico a nivel horizontal o en un ligero ángulo lateral hacia el lado opuesto de la ventana del cráneo adelgazado en este protocolo. Esta posición específica puede facilitar la creación de la ventana del cráneo adelgazada en el área correspondiente a la corteza motora. La colocación precisa de las barras para los oídos es uno de los aspectos más desafiantes de este procedimiento, y puede llevar tiempo y práctica dominarlo. Antes de intentar la operación de ventana de cráneo adelgazado o inducir CHI, es esencial asegurarse de que el cráneo esté nivelado. Si el cráneo no está colocado correctamente, la cabeza debe ajustarse en consecuencia. Debido a la forma y el grosor desiguales del hueso del cráneo, el crecimiento del cráneo es variable incluso dentro de un hueso específico³⁰, es fundamental ajustar la posición de la cabeza antes de realizar el procedimiento de ventana de cráneo adelgazado o CHI. No hacerlo aumenta el riesgo de fracturas de cráneo, lo que puede afectar significativamente la precisión y confiabilidad del CHI. Para obtener una guía más completa sobre el procedimiento de la ventana del cráneo adelgazado, consulte el protocolo descrito por Guang et ^al.14.

La elección del área de modelado de TBI varía entre los investigadores en función de su enfoque de investigación. Dada la variabilidad significativa en la localización real de la lesión en el CHI, a pesar de que la mayoría de los estudios informan que el sitio del impacto está ubicado en el centro entre bregma y lambda, se recomienda variar la ubicación del impacto en futuros estudios experimentales, como se observó en una revisión de modelos animales de CHI²⁵. Para validar el modelo modificado de lesión de cráneo adelgazado de CHI, recomendamos comenzar con la corteza motora, como se describe en este protocolo. El RMTBI puede causar lesiones focales de la corteza motora, que pueden evaluarse fácilmente utilizando enfoques de evaluación locomotora como el OFT de este protocolo. La incisión realizada durante este procedimiento requiere tiempo para sanar, y esto puede desencadenar una respuesta inmunitaria periférica, lo que en última instancia introduce variabilidad en el experimento. Para minimizar el riesgo de inflamación, infección y dolor y malestar postquirúrgicos, recomendamos aplicar una pomada tópica que contenga una combinación de eritromicina y diclofenaco de sodio en la herida. Este enfoque ha demostrado ser eficaz para reducir la inflamación y el dolor asociados con los procedimientos quirúrgicos en animales.

El protocolo de percusión de fluidos basado en el cráneo adelgazado es un método prometedor para modelar rmTBI en roedores, ya que reduce la inflamación comúnmente causada por la exposición de las meninges a FPI. Esta técnica, que se presenta en la ventana del cráneo adelgazado, puede generar eficazmente PCS clínicamente relevantes en diversos grados, lo que proporciona una alternativa potencial para los investigadores que estudian el RMTBI. Además, la ventana del cráneo adelgazado facilita la observación de la homeostasis del Ca²⁺ y la hiperexcitabilidad neuronal en la corteza in vivo¹⁵. El uso de esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes de la progresión del PCS a corto/moderado/largo plazo, mejorando así la capacidad de predecir su desarrollo y desarrollar tratamientos terapéuticos más efectivos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
75% etanol	Shandong XieKang Tecnología Médica Co., Ltd.
Clorhidrato de buprenorfina	Instituto de Investigación Farmacéutica de Tianjin Solución Farmacéutica Co., Ltd	H12020272	, Carprofeno Analgésico
	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Polvo, Digluconato Analgésico
de clorhexidina	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	Solución acuosa al 19%-21%,
kit de cemento y solvente	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3 #	Polvo reconstituido en solvente a juego
Microscopio de disección	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Pomada de eritromicina	Wuhan Mayinglong Grupo Farmacéutico Co., Ltd.	220412
luz fría de fibra óptica	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Microbroca de punta plana	Shenzhen RWD Ciencias de la Vida Inc.	HM31008	2 mm, software
dispositivo FPI	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR	Centro de Animales de Laboratorio de Jinhua	Stock#2023091	25 Ratones machos, 25-30g, 8 semanas de edad
Isoflurano	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Almohadilla térmica isotérmica	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Hecho a medida con un cubo de aguja de 19G
Micro taladro de cráneo de mano	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38,000 rpm
Dispositivo FPI modificado	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Laberinto acuático Morris	Shenzhen RWD Ciencias de la vida Inc.	63031	Evaluar el aprendizaje espacial del ratón y las habilidades de memoria del ratón
Campo abierto	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluar la locomoción y la ansiedad del ratón
Lubricante oftálmico	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Pomada de diclofenaco sódico	Wuhan Mayinglong Grupo Farmacéutico Co., Ltd.	221207	medicamento antiinflamatorio no esteroideo
Sistema de anestesia para animales pequeños-Mejorado	Shenzhen RWD Ciencias de la Vida Inc.	R530IP
Sistema de seguimiento de vídeo inteligente	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, EE. UU	V3.0	Seguimiento y análisis de animales
Marco estereotáctico	Shenzhen RWD Ciencias de la Vida Inc.	68043
Vetbond Adhesivo para tejidos	3M, St Paul, MN, EE. UU	202402AX	Sutura el laberinto Y de la herida del animal
	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Evaluar la memoria de trabajo espacial del ratón