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Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

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DOI:

10.3791/66479

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24 de mayo de 2024

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1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento de herida punzante para la formación de trombos hemostáticos. Los trombos formados son grandes y tienen cientos de micras de diámetro. Por lo tanto, los enfoques de imágenes de volumen son apropiados. Sugerimos la microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada como un enfoque de alta resolución disponible para muchos y detallamos un protocolo preparativo.

Resumen

La hemostasia, el proceso de control fisiológico normal del daño vascular, es fundamental para la vida humana. Todos sufrimos pequeños cortes y heridas punzantes de vez en cuando. En la hemostasia, la agregación plaquetaria autolimitada conduce a la formación de un trombo estructurado en el que el cese del sangrado proviene de tapar el orificio desde el exterior. La caracterización detallada de esta estructura podría conducir a distinciones entre hemostasia y trombosis, un caso de agregación plaquetaria excesiva que conduce a la coagulación oclusiva. Aquí se presenta un enfoque basado en imágenes para la estructura del trombo de la herida punzante que se basa en la capacidad de la microscopía electrónica de sección delgada para visualizar el interior de los trombos hemostáticos. El paso más básico en cualquier protocolo experimental basado en imágenes es una buena preparación de la muestra. El protocolo proporciona procedimientos detallados para la preparación de heridas punzantes y trombos ricos en plaquetas en ratones para su posterior microscopía electrónica. Se proporciona un procedimiento detallado para la fijación in situ del trombo de la herida punzante en formación y su posterior procesamiento para la tinción y la inclusión para microscopía electrónica. La microscopía electrónica se presenta como la técnica de imagen final debido a su capacidad, cuando se combina con el corte secuencial, para visualizar los detalles del interior del trombo a alta resolución. Como método de imagen, la microscopía electrónica proporciona un muestreo imparcial y un resultado experimental que escala de nanómetros a milímetros en 2 o 3 dimensiones. Se cita un software de microscopía electrónica gratuito apropiado que admita la microscopía electrónica de área amplia en la que se pueden combinar cientos de fotogramas para proporcionar imágenes a escala nanométrica de secciones transversales completas de trombos de heridas punzantes. Por lo tanto, cualquier subregión del archivo de imagen se puede colocar fácilmente en el contexto de la sección transversal completa.

Introducción

La formación de un trombo punzante que conduce al cese de la hemorragia es uno de los eventos más esenciales en la vida1. Sin embargo, a pesar de esa esencialidad, el conocimiento de lo que ocurre estructuralmente durante la formación de trombos, ya sea en una vena, una arteria, un evento aterosclerótico o un coágulo oclusivo, ha sido limitado por la resolución y la profundidad de las imágenes. La microscopía óptica convencional tiene una profundidad limitada en comparación con un trombo de herida punzante completamente formado, de 200 a 300 μm en Z1, y en un nivel de resolución cuando se compara con el tamaño de los orgánulos plaquetarios y su espaciamiento, a menudo inferior a 30 nm2. La microscopía de luz de dos fotones puede producir la profundidad necesaria de imágenes, pero no mejora significativamente la resolución. Los avances más recientes en microscopía óptica, por ejemplo, las técnicas de superresolución, siguen siendo de resolución limitada, en la práctica ~20 nm en XY y el doble en Z, y de profundidad, no más que la microscopía óptica convencional. Además, la microscopía óptica de superresolución, al igual que gran parte de la microscopía óptica de investigación, se basa en la microscopía de fluorescencia, una técnica que está inherentemente sesgada a un pequeño conjunto de proteínas candidatas para las que existen buenos anticuerpos o buenas construcciones marcadas3. En conclusión, la microscopía electrónica de barrido convencional puede, a lo sumo, visualizar la superficie del trombo rico en plaquetas en formación.

Para superar estas limitaciones técnicas a la hora de caracterizar la estructura del trombo, teníamos tres objetivos. En primer lugar, producir de forma reproducible una herida punzante definida en una vena o arteria de ratón que luego podría estabilizarse fácilmente in situ mediante fijación química. En segundo lugar, aplicar un procedimiento preparatorio que haga hincapié en la preservación de la membrana, un objetivo coherente con el objetivo de definir la posición de las plaquetas individuales dentro del trombo en formación. En tercer lugar, utilice una técnica de visualización imparcial que, en una sola imagen, pueda escalarse entre nanómetros y casi milímetros.

La microscopía electrónica de área amplia montada se eligió como una técnica importante de visualización final por una sola razón importante: en las imágenes de microscopio electrónico, se ve una amplia gama de características dentro de una célula que delinea sus orgánulos y características dentro de los orgánulos. Se pueden reconocer objetos pequeños como los ribosomas. Esta gama de características se debe a que las manchas de metales pesados densos en electrones, uranilo, plomo y osmio, que se utilizan para la microscopía electrónica para producir contraste, se unen a una amplia gama de moléculas. En una imagen de microscopio electrónico, se ve gran parte de lo que hay allí, mientras que con los enfoques de inmunofluorescencia y marcaje de proteínas, solo se ve lo que se ilumina. Esto significa, por ejemplo, los sitios de antígenos presentes en una especie de proteína individual dada. En el caso de una molécula marcada, a menudo una proteína, es el sitio o sitios donde se encuentra esa proteína. Todas las demás moléculas son oscuras y no están iluminadas. Sin embargo, ¿es práctica esta elección de microscopía electrónica? Un trombo de herida punzante tiene un tamaño de 300 por 500 μm y, con un tamaño de píxel de 3 nm, es una imagen de 100.000 por 167.000 píxeles. Una cámara de microscopio electrónico de alta calidad tiene 4000 por 4000 píxeles. Eso significa que se deben unir/mezclar aproximadamente 1000 fotogramas para obtener una sola imagen. Esa es una posibilidad que ha estado presente en la mayoría de los microscopios electrónicos fabricados en los últimos 15 años. La platina del microscopio está computarizada y las imágenes se pueden unir con una computadora. Esa es la lógica que llevó a las decisiones que subyacen a la formulación del protocolo presentado.

De manera concluyente, presentamos a continuación una serie de pasos que dan una herida reproducible en la vena o arteria de ratones que luego, siguiendo los pasos de fijación in situ y los pasos posteriores de inclusión, se puede visualizar mediante microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada a escala de nm y en la imagen cosida visualizada a escala cercana a mm, la escala de la real in situ Trombo fijo. La escalabilidad de este tipo es necesaria para comprender la formación de trombos como un problema en hematología/salud y como un sistema de biología del desarrollo en el que las plaquetas son el principal tipo de célula. Estos avances ofrecen una gran virtud de la microscopía electrónica, a saber, que uno ve lo que está ahí, no solo lo que se ilumina. Para un protocolo detallado sobre la preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido de cara a bloque en serie (SBF-SEM), se remite al lector a un artículo reciente de Joshi et al.4.

Protocolo

Los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas. Aquí, se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembras de 8 a 12 semanas de edad, de tipo salvaje. Estos ratones son adultos jóvenes con poca acumulación de grasa. Los mismos procedimientos son aplicables a ratones mutantes para diversas proteínas importantes para la hemostasia, como el factor de von Willebrand o la glicoproteína VI plaquetaria (GPVI)5,6. Todos los equipos, instrumentos quirúrgicos, reactivos y otros materiales utilizados se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Herida punzante de la vena yugular/arteria femoral 1,7

  1. Anestesia del ratón
    1. Coloque el ratón en la cámara de inducción y gire el vaporizador de isoflurano a un ajuste de caudal alto (500 mL/min, 3% de isoflurano). Se elige el isoflurano porque tiene poco efecto sobre el diámetro de los vasos sanguíneos.
      PRECAUCIÓN: La exposición prolongada al isoflurano puede causar efectos adversos para la salud. El uso de un vaporizador de bajo flujo, botes de captura de gas de anestesia y una buena ventilación de la habitación pueden reducir en gran medida la exposición.
    2. Cuando el ratón parezca dormido, pellizque uno de los dedos del ratón para ver si reacciona. Si es así, vuelva a colocar el ratón en la cámara de inducción durante unos minutos y vuelva a intentar la prueba de pellizco. Si el ratón no reacciona, colóquelo en posición supina sobre la placa calefactora (previamente cubierta con papel de aluminio).
    3. Baja el vaporizador a un caudal bajo (100 mL/min, 1,75% de isoflurano). Coloca la nariz del ratón en el cono de la nariz. Extienda cada extremidad y péguela con pequeños trozos de cinta adhesiva.
    4. Inserte la sonda de temperatura rectal y ajuste la temperatura a 37 °C en el controlador de temperatura. Pegue con cinta adhesiva el cable de la sonda de temperatura para evitar que la sonda se salga accidentalmente.
  2. Incisión de ratón
    1. Con las tijeras, afeita el cuello y el pecho del ratón (para la vena yugular) o la parte interna de la pierna derecha (para la arteria femoral). Limpia los recortes de piel con una almohadilla con alcohol. Si es necesario, vuelva a repasar el área con la maquinilla para eliminar el pelaje restante.
    2. Limpie el área nuevamente con una almohadilla con alcohol nueva para eliminar todos los recortes. Es muy importante que la zona esté lo más limpia posible. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia a través de un pellizco en el dedo del pie.
    3. Con unas tijeras y unas pinzas romas, levante y corte la piel sobre la vena yugular derecha. Corta una ventana redonda en la piel lo suficientemente grande como para exponer la vena yugular y parte del tejido circundante.
  3. Limpieza de la vena yugular (los mismos principios se aplican a la arteria femoral)
    1. Con la técnica de disección roma, empuje suavemente a un lado los ganglios adiposos y linfáticos, así como el tejido conectivo.
      NOTA: En este paso se lleva a cabo una limpieza general alrededor de la embarcación; Sin embargo, se llevará a cabo una limpieza cuidadosa y exhaustiva bajo el microscopio después de que la vena yugular se fije en paraformaldehído durante 24 horas.
    2. Llene una jeringa de 20 ml con solución salina normal calentada a 37 °C. Cargue la jeringa en la bomba de infusión de jeringa. Conecte la aguja de mariposa de 27 G y el tubo asociado a la jeringa.
    3. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 0,5 mL/min. El suave chorro de solución salina lavará la sangre de la vena/arteria perforada. Coloque el chorro de solución salina unos pocos mm a un lado del sitio de punción, no directamente sobre él.
  4. Perforación de la vena yugular/arteria femoral
    1. Inicie el temporizador. Obtener una aguja hipodérmica de 30G (diámetro nominal de 300 μm) para la vena yugular y una aguja hipodérmica de 33G (200 μm de diámetro) para la arteria femoral. El uso de una aguja más pequeña proporciona solo un tiempo de sangrado ligeramente más largo para la situación arterial de presión más alta.
    2. Gira el bisel hacia arriba. Coloque la aguja en un ángulo de 25° sobre la vena yugular/arteria femoral. Fíjate en la hora.
    3. Perfore rápidamente el recipiente, asegurándose de perforar solo la parte superior del recipiente. Tenga cuidado de no perforar también el fondo del recipiente. Fíjate en el momento en que el sangrado se detiene por completo.
    4. Espere el tiempo adecuado para obtener la formación de trombo (Figura 2A) antes de iniciar la fijación de la perfusión (es decir, 1, 5, 10 o 20 minutos para obtener diferentes etapas de desarrollo del trombo). Aplicar la eutanasia al animal por exanguinación o seguir las directrices institucionales locales para la eutanasia.
  5. Realización de la fijación de la perfusión transcárdica
    1. Instale la bomba peristáltica antes de que comience la cirugía. Coloque dos tubos cónicos de 50 mL en una gradilla para tubos de ensayo. Llene un tubo con una solución fijadora de paraformaldehído al 4% preparada en una solución tampón de cacodilato de sodio (0,2 M de cacodilato de sodio, 0,15 M de cloruro de sodio a pH 7,4) para estudios de punción yugular y llene el otro tubo con una solución tampón de cacodilato de sodio.
      NOTA: Las condiciones detalladas aquí son suficientes para el caso de baja presión de la yugular y luego se modifican para el caso de mayor presión de una arteria. Para los estudios de sistemas de alta presión con arterias, es decir, la arteria femoral, el fijador de paraformaldehído se complementa con glutaraldehído al 0,1%, y la fijación por goteo externo se combina con la fijación por perfusión.
    2. Coloque el extremo de absorción del tubo de la bomba en el tubo que contiene la solución tampón. Conecte una aguja de mariposa de 27 G con un tubo asociado al extremo de salida del tubo de la bomba y coloque la aguja en un vaso de precipitados limpio.
    3. Ajuste la bomba peristáltica a un caudal de 10 mL/min. Encienda la bomba de perfusión.
    4. Cuando la solución tampón comience a fluir de la aguja al vaso de precipitados, apague la bomba. El tubo y la aguja ahora están preparados para la perfusión transcárdica.
    5. Exponga la cavidad torácica haciendo un corte en la línea media de la piel desde la parte superior del esternón hasta unos pocos milímetros más allá de la parte inferior del esternón con tijeras de disección y pinzas romas. Haga incisiones transversales a lo largo de la base de la caja torácica, comenzando en la línea media y cortando de medial a lateral a cada lado.
    6. Inmediatamente antes de iniciar la perfusión transcárdica, corte rápidamente la caja torácica y refleje cada lado para exponer el corazón.
    7. Encienda la bomba peristáltica. Coloque la punta de la aguja de mariposa de 27 g en la base del ventrículo izquierdo.
    8. Mientras sostienes la aguja firmemente en el ventrículo izquierdo, haz una hendidura en la aurícula derecha con unas tijeras diseccionadoras afiladas para permitir que la sangre y el líquido de perfusión fluyan. Anote la hora en el temporizador.
    9. Perfundir con solución tampón durante 3 minutos para eliminar la sangre del sistema circulatorio. Mientras mantiene la aguja segura en el ventrículo izquierdo, apague la bomba peristáltica y mueva el extremo de absorción del tubo de la bomba peristáltica al tubo de 50 ml que contiene la solución fijadora.
    10. Anote la hora en el temporizador. Vuelva a encender la bomba peristáltica y perfunde con la solución fijadora durante 7 min. Apague la bomba peristáltica.
    11. Retire la aguja del ventrículo izquierdo y colóquela en un vaso de precipitados. Coloque el extremo de absorción del tubo de la bomba en un vaso de precipitados con agua destilada.
    12. Encienda la bomba peristáltica y deje que fluyan aproximadamente 20 ml de agua a través del tubo y salgan por la aguja de 27G hacia el vaso de precipitados para limpiar el tubo. Asegúrese de dejar que toda el agua salga por el tubo y la aguja antes de apagar la bomba.

2. Recogida de muestras para microscopía electrónica

  1. Después de la fijación por perfusión suplementada con un fijador externo inicial de 2 min en el caso de heridas punzantes por punción de la arteria femoral, diseccionar cuidadosamente la porción de la vena yugular/arteria femoral que contiene el sitio de punción y el trombo (Figura 2A). Con unas tijeras afiladas, haga un corte diagonal a través del extremo distal del segmento del vaso y haga un corte recto a través del extremo proximal del segmento del vaso.
    NOTA: Hacer cortes de esta manera ayuda a orientar el vaso más tarde y a identificar la dirección del flujo sanguíneo en el vaso.
  2. Sumerja el segmento del recipiente en paraformaldehído al 4% fresco a temperatura ambiente en una solución tampón de cacodilato de sodio (cacodilato de sodio 0,2 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 7,4) y colóquelo a temperatura ambiente durante 1 h.
  3. Transfiera el tejido fijo a 4 °C durante 24 h. Al día siguiente, tome una placa de cultivo de 35 mm que contenga una esterilla de silicona de ~ 5 mm de grosor (preparada de antemano de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Vierta suficiente solución tampón de cacodilato de sodio en el plato para sumergir el segmento de vena fija.
  4. Mientras observa bajo un microscopio óptico (~15 aumentos), transfiera con cuidado el tejido al plato de 35 mm que contiene la solución tampón y fije cada extremo del recipiente a la estera de silicona con alfileres de acero inoxidable y pinzas finas.
  5. Limpie cuidadosamente el segmento de la vena yugular/arteria femoral con unas microtijeras y unas pinzas muy finas.
    1. Solo para la vena yugular: Retire uno de los clavos y, con las microtijeras, corte longitudinalmente la pared del vaso opuesta al sitio de la punción/trombo. Abra suavemente el recipiente y, con 4 a 5 alfileres (cada uno cortado por la mitad con cortadores de alambre), sujételo a la estera de silicona con el lado intraluminal hacia arriba.
  6. Aspire la solución tampón, reemplácela rápidamente con una solución de paraformaldehído al 1% en una solución tampón de cacodilato de sodio y coloque la tapa en el plato. No deje que el tejido se seque en ningún momento. Manténgalo siempre sumergido en líquido.
  7. Almacene el tejido a 4 °C hasta que sea el momento de procesarlo para microscopía electrónica (Figura 2B). Procese algunas de las muestras de la herida punzante de la vena yugular/arteria femoral para la obtención de imágenes mediante SBF-SEM4 y otras para la obtención de imágenes mediante WA-TEM 8,9. Los pasos de WA-TEM se describen en detalle a continuación.
    PRECAUCIÓN: Realice todos los trabajos que involucren formaldehído, óxido de propileno, OsO4 y 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) en una campana de gases químicos. Estos son productos químicos peligrosos. La exposición al OsO4 puede causar ceguera y la muerte.
    NOTA: Todos los volúmenes de enjuague y tinción son al menos 2 veces el volumen de la muestra. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x puede sustituirse por el tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M. Durante el procedimiento de fijación, es muy importante no dejar nunca que las muestras se sequen, ya que esto afectaría significativamente a la ultraestructura. Utiliza tubos de polipropileno.

3. Preparación de la muestra para microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada (WA-TEM)

NOTA: Este paso representa un punto de decisión en el que el investigador se compromete a prepararse para WA-TEM. Este procedimiento preparatorio no es compatible con SBF-SEM. Para SBF-SEM volumen EM, todas las tinciones deben realizarse antes de incrustar en plástico. Consulte elpunto 4 para obtener un protocolo de preparación SBF-SEM.

  1. Lave la muestra de tejido en el plato de 35 mm 2 veces con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) o PBS a temperatura ambiente (RT). Mantenga la muestra anclada, lo que permite rastrear la orientación de la muestra a través de estos pasos preparativos.
  2. Fijar con 0,8 mL de verde de malaquita al 0,05%/2,5% de glutaraldehído/cacodilato de sodio al 0,1 M (pH 6,7 - 7,0) durante 20 min en hielo.
  3. Retire el fijador y lave la muestra 4 veces durante 5 minutos cada una con cacodilato de sodio 0,1 M. Retire el cacodilato de sodio 0,1 M.
  4. Postfijo con 0,8 mL de 0,8% K3Fe(CN)6 o K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 en cacodilato de sodio 0,1 M. Coloque una tapa sobre el plato para mantener la luz fuera (OsO4 es sensible a la luz). Teñir durante 20 min a 1 h en RT.
  5. Retire el OsO4 y enjuague 4 veces durante 5 minutos cada una con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M. Retire el tampón de cacodilato de sodio y tiña con ácido tánico al 1% durante 20 minutos en hielo.
  6. Retire el ácido tánico y lave durante 5 minutos con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M 1x y 2x durante 5 minutos cada uno con agua destilada (DI) de grado molecular.
  7. Teñir con acetato de uranilo (UA) al 0,5% durante 1 h RT o toda la noche a 4 °C en la oscuridad.
  8. Retire el acetato de uranilo y enjuague 5 veces durante 5 minutos cada una con agua destilada de grado molecular. Antes del último lavado y mientras la muestra aún está sumergida en agua desionizada, corte la alfombrilla de silicona alrededor de la muestra sujeta con una cuchilla de afeitar. Levanta este pequeño trozo de estera de silicona de la placa y colócalo en un tubo de polipropileno.
    NOTA: Es importante que la muestra permanezca fijada a la pieza de silicona mientras esté en el tubo. Es necesario cambiar a tubos de polipropileno en este paso porque el óxido de propileno utilizado en los pasos posteriores degradará el poliestireno de las placas de 35 mm.
  9. Después de quitar el último tampón, enjuague brevemente 1 vez con etanol al 25%. Deseche el etanol al 25% e incube con etanol al 25% durante 3 minutos en hielo.
  10. Retire el etanol al 25%. Enjuague brevemente 1 vez con etanol al 50%. Deseche el etanol al 50% e incube con etanol al 50% durante 3 minutos en hielo.
  11. Retire el etanol al 50% y enjuague brevemente 1 vez con etanol al 75%. Deseche el etanol al 75% e incube con etanol al 75% durante 3 minutos en hielo.
  12. Retire el etanol al 75% y enjuague brevemente 1 vez con etanol al 95%. Deseche el etanol al 95% e incube con etanol al 95% durante 3 minutos en hielo.
  13. Retire el etanol al 95% y lave 3 veces, al menos 10 minutos cada vez, con etanol al 100% (200 grados). Retire el etanol al 100% y agregue óxido de propileno (PO). Enjuague 3 veces al menos 10 minutos cada una, con PO.
  14. Prepara la mezcla de resina como se describe a continuación.
    1. Calentar los componentes de la resina a 60 °C para licuarlos completamente. Mezcle bien 12,5 mL de Embed-218, 7,5 mL de Araldite 502 y 27,5 mL de DDSA en un tubo de 50 mL a 60 °C. Esta mezcla se puede conservar durante 6 meses a 4 °C. Calentar a 60 °C antes de usarlo. Alícuota la cantidad requerida antes de su uso.
  15. Incruste los ejemplos como se describe a continuación.
    1. Coloque una alícuota de la mezcla de resina en un tubo y agregue 20 μL/mL de activador DMP-30. Mezclar bien girando a 60 °C; El color debe oscurecerse.
    2. Diluya esta alícuota de resina activada en un 50% en PO y deje que la resina y el PO se mezclen completamente.
    3. Retire el último enjuague de PO del tubo que contiene la muestra y reemplácelo con la mezcla de 50% de resina / PO, llenando casi por completo el tubo. Gire la muestra durante la noche a temperatura ambiente.
    4. Al día siguiente, mezclar una nueva alícuota de resina (1 mL por muestra) con 20 μL/mL de DMP-30.
  16. Coloque la muestra en un plato de polipropileno con un pequeño volumen de mezcla de resina/PO al 50% del tubo de muestra bajo un microscopio de disección (~6x aumento) y retire con cuidado los alfileres del tejido. Transfiera solo el tejido a otro plato de polipropileno que contenga una pequeña cantidad de resina 100% con un activador DMP-30.
  17. Llene un molde de inclusión de silicona con el 100% de resina con el activador DMP-30 y coloque cuidadosamente la muestra en el molde. Coloque el molde en el horno y hornee a 60 °C durante al menos 48 h . La muestra preparada se muestra en la Figura 2B.
  18. Realice imágenes de microscopía electrónica de transmisión de área amplia (WA-TEM) montadas como se describe en10,11. Consulte la Figura 3 para ver una representación del proceso que va desde una punción inicial hasta un trombo de 1 minuto renderizado en 3 dimensiones. La inclusión de un protocolo detallado para la obtención de imágenes de microscopía electrónica WA-TEM montadas no se incluye aquí y está más allá del alcance de los protocolos actuales sobre la preparación de muestras.
    NOTA: WA-TEM es una capacidad subestimada de la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión modernos con una platina computarizada. El software shareware que soporta estas funciones10,11 está disponible en el grupo del Dr. David Mastronarde, de la Universidad de Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Resultados

Cuantificación de los efectos del fármaco sobre el tiempo de sangrado de la herida punzante
Los tiempos de sangrado de las heridas punzantes proporcionan un modelo fisiológico del riesgo de un fármaco que puede llevarse a cabo fácilmente en ratones. Los resultados que se derivan de un experimento de herida punzante son predictivos. Aquí, mostramos una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. El dabigatrán, un inhibidor de la trombina, se utiliza como anticoagulante oral de acción directa, el llamado DOAC12. Se utilizó el modelo de herida punzante en la vena yugular para evaluar el riesgo inherente a diferentes dosis de dabigatrán a través de una posible hemorragia prolongada a través de la formación tardía de trombos en ratones. Se administró una dosis variable de 15, 50 o 150 μg/kg de dabigatrán por vía intravenosa (i.v.) 20 min antes de la punción de la vena yugular. Mostramos las medias del tiempo de sangrado a diversas concentraciones de dabigatrán (Figura 4). A nivel de dosis, se observa una prolongación significativa del tiempo de sangrado, p <0,051. Esto indica un factor de riesgo significativo en el uso del medicamento en humanos. Experimentalmente, el fármaco a estas dosis tiene un efecto significativo sobre la ultraestructura del trombo en formación.

Evaluación del estado de activación plaquetaria en un trombo de herida punzante en formación
El enfoque WA-TEM proporciona una visión general de un área de herida en un solo plano cuando se observa con un aumento más bajo y mucho detalle con un aumento más alto (Figura 5). Los detalles obtenidos se pueden situar directamente en el contexto de la visión general. Hemos utilizado este enfoque para evaluar el reclutamiento de plaquetas de forma discoide para un trombo de herida punzante en formación. Las plaquetas circulantes son discoides, de ahí su nombre, y contienen un conjunto completo de gránulos secretores. Una pregunta clave ha sido cómo las plaquetas circulantes pueden ser reclutadas para el trombo en crecimiento sin perturbar las propiedades de flujo libre de las plaquetas restantes. Nuestro trabajo apunta a una hipótesis de Tether and Activate en la que las plaquetas circulantes son reclutadas por el trombo, una por una, a través de un proceso de anclaje como plaquetas discoidales que contienen un conjunto completo de orgánulos2. La evidencia de esto proviene de la WA-TEM de trombos de la vena yugular 1 min después de la punción. Después de la sección para producir cortes completos del trombo desde el centro de la herida aún sangrante, tomamos imágenes de 500 a 800 fotogramas, 4.000 por 4.000 píxeles, 3.185 nm de tamaño de píxel en una cuadrícula ráster XY rectangular a lo largo de toda la dimensión del trombo en sección transversal utilizando una platina automatizada y un microscopio electrónico de transmisión utilizando el software SerialEM10. A continuación, los marcos se unieron con el software eTomo, que forma parte del paquete de programas IMOD11. Esto da como resultado una sola imagen de tamaño variable, por ejemplo, 120.000 píxeles por 90.000 píxeles que puede ser a pantalla completa con un zoom bajo, 0,02, o en detalle con un zoom más alto, de 0,25 a 1,0 utilizando el software 3DMOD, de nuevo como parte del conjunto de programas IMOD (Figura 5). En neto, el análisis basado en software encontró que las plaquetas discoides asociadas al trombo unidas periféricamente dentro del orificio de punción estaban espaciadas como cuentas en una cuerda. A una corta distancia dentro del trombo, la forma discoide era menos distintiva y las plaquetas estaban más estrechamente asociadas entre sí. Más adentro del trombo, las plaquetas estaban redondeadas, apretadas y parcialmente desgranuladas. Una secuencia de morfología sugirió la unión inicial de las plaquetas al trombo a través de una molécula de atadura larga, probablemente el factor de von Willebrand, y que cualquier paso adicional de activación plaquetaria se restringía al interior del trombo en formación. Por lo tanto, el reclutamiento de plaquetas al trombo podría ocurrir sin alterar la circulación de la sangre dentro de la vena yugular.

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Figura 1: Montaje quirúrgico para realizar un experimento de trombo de herida por punción de vena yugular/arteria femoral. El equipo quirúrgico (A) y los instrumentos (B) están cuidadosamente dispuestos para la eficiencia del movimiento, ya que el tiempo es crítico durante el experimento. (C) Después de la fijación por perfusión, la porción del vaso que contiene el trombo de la herida punzante se fija a una estera de silicona en una placa de cultivo de 35 mm mientras se observa bajo el microscopio óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Pasando de un vaso sanguíneo a muestras incrustadas en plástico que se seccionarán para WA-TEM o SBF-SEM. (A) Se muestra una arteria femoral con una herida punzante y formación de trombos extravasculares acumulados (círculo y flecha). (B) Un trombo (círculo y flecha) está incrustado en plástico para el corte de WA-TEM con un micrótomo para la posterior obtención de imágenes en 2D. (C) Un trombo (círculo y flecha) está incrustado en plástico, recortado para dar un palo corto, de menos de 1 mm, para sujetarlo a un alfiler dentro de una cámara de imágenes SBF-SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Formación de la herida punzante al trombo: Esquema del flujo preparatorio desde una herida punzante (A) hasta un corte de imagen de un trombo (B) de la vena yugular postpunción de 1 min. La pared del vaso está etiquetada en azul en el corte de la imagen, los pequeños puntos negros cerca de la pared del vaso son glóbulos rojos y los agregados de plaquetas del trombo aparecen como áreas de color gris oscuro. Esta cifra ha sido modificada de1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Un ejemplo de datos, en forma gráfica, generados en un experimento de herida punzante en la vena yugular. Se muestra una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. Esta cifra ha sido modificada de1. Las medias del tiempo de sangrado a varias concentraciones de dabigatrán se muestran junto con barras de error que indican más o menos la desviación estándar. El análisis estadístico mediante la prueba t de Student indicó un valor p de <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Imágenes WA-TEM de un corte unido para formar un montaje. (A) Se recopilan fotogramas individuales de alta resolución y luego se unen con el fin de colocar las características en un contexto más amplio. (B) Al hacer zoom, se pueden resaltar detalles importantes en contexto (poli: leucocitos polimorfonucleares, endotelio: endotelio y col: fibras de colágeno). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Presentamos un procedimiento detallado de heridas punzantes para la producción de trombos hemostáticos en venas yugulares y arterias femorales, su fijación de perfusión in situ y el procesamiento de muestras para microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada. Los procedimientos generales son útiles para generar trombos hemostáticos para el análisis ultraestructural y para comparar los tiempos de sangrado en ratones experimentales, por ejemplo, ratones tratados con diferentes tipos y dosis de fármacos. También es útil para comparar los tiempos de sangrado en ratones de control de tipo salvaje con los tiempos de sangrado en ratones knockout (es decir, knockouts para varias glicoproteínas en plaquetas que interactúan con ligandos adhesivos) y la posterior microscopía electrónica de alta resolución. El protocolo se puede adaptar fácilmente al análisis de inmunofluorescencia como lectura principal con la pérdida de características que hacen que la microscopía electrónica sea una opción sólida. Por otro lado, la inmunofluorescencia es una herramienta principal para localizar proteínas dentro de una estructura. Al igual que con cualquier protocolo técnico, hay algunos pasos que son más críticos que otros y hay pasos dentro del protocolo que pueden tratarse como puntos de elección importantes para el análisis posterior.

A continuación se describen los pasos críticos, los puntos de elección para el análisis posterior y las limitaciones. El paso real de la punción de la aguja: La herida punzante se hace con una aguja de jeringa sostenida en un ángulo de 25° con respecto a la vena o arteria. Esto minimiza la posibilidad de perforar ambos lados de la vena o arteria. Un ángulo de 90°, por otro lado, maximiza las posibilidades de no raspar la capa endotelial intravascular o dañar la matriz de colágeno extravascular en el exterior del vaso sanguíneo, pero conlleva un mayor riesgo de perforar ambos lados de la vena o arteria. La elección es una de experiencia, manos y confianza.

La fijación primaria aquí se realiza con paraformaldehído perfundido, una pequeña molécula que contiene un solo grupo aldehído reactivo. Debido a que contiene un solo grupo químicamente reactivo, el paraformaldehído tiene poca tendencia a reticularse los componentes celulares y poca tendencia a destruir la antigenicidad y, por lo tanto, en resumen, se considera un fijador comparativamente débil para el glutaraldehído, un fijador común para la microscopía electrónica, que contiene dos aldehídos reactivos y, por lo tanto, produce mucha más reticulación molecular13. Se trata de un paso in situ diseñado para preservar la estructura. Los pasos de perfusión eliminan los glóbulos rojos no atrapados en trombos de la preparación. Eso da una preparación que está libre de la mayoría de los glóbulos rojos y hace que sea fácil concentrarse en las propiedades de las plaquetas. Hemos explorado el uso de la fijación in situ con una mezcla de glutaraldehído/paraformaldehído aplicada extravascularmente. Este procedimiento es eficaz, especialmente en una situación de alto flujo/presión. Sin embargo, sí fija los glóbulos rojos circulantes en su lugar. Esto puede complicar el análisis de segmentación posterior de las micrografías electrónicas para determinar la forma y composición de los agregados plaquetarios que forman el trombo de la herida punzante. El uso de glutaraldehído complica enormemente los procedimientos alternativos de inmunofluorescencia debido al alto nivel de autofluorescencia generado por el fijador.

La fijación / separación del vaso sanguíneo fijo en una almohadilla de silicona es crucial para ubicar el trombo con fines de incrustación. En este paso, se realiza un seguimiento de la orientación de la muestra con respecto al flujo sanguíneo y se conoce para los pasos posteriores. El orificio de punción y el trombo formado se pueden localizar fácilmente en el vaso sanguíneo abierto. Por el contrario, el trombo es difícil de encontrar en los vasos sanguíneos intactos extirpados. Eso sería especialmente cierto en una muestra rica en glóbulos rojos circulantes fijos. Ser capaz de rastrear dónde se encuentra la aguja en el pajar es crucial.

La apertura posterior del vaso sanguíneo y la fotografía de dónde se encuentra el trombo formado, el orificio de punción, presenta un punto de elección. En el protocolo general, los pasos posteriores presentados son específicos para preparar la muestra para WA-TEM. En este paso, se podrían tomar otras decisiones de protocolo. Por un lado, la muestra podría procesarse para microscopía de inmunofluorescencia en lugar de microscopía electrónica. Por otro lado, la muestra podría procesarse para microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM u otro enfoque de microscopía electrónica de volumen) en lugar de WA-TEM. Los pasos de procesamiento para SBF-SEM son decididamente diferentes porque para prepararse para este procedimiento, todos los pasos de tinción de metales pesados para microscopía electrónica deben realizarse antes de la inclusión4.

Los pasos de tinción de metales pesados en este protocolo están diseñados para resaltar las membranas frente a los ribosomas y cromosomas, complejos biológicos ricos en ácido nucleico. Se podrían utilizar otros protocolos de tinción de metales pesados, por ejemplo, Storrie y Attardi14 y Liu et al.15.

Es importante prestar atención a las diferencias en las venas y arterias. La mayor presión de la arteria frente a la vena debe compensarse16,17. Por ejemplo, se utiliza una aguja de menor diámetro para producir la herida de la arteria femoral frente a la herida yugular. Esto compensa la presión más alta, dando un tiempo de cese del sangrado casi igual. En el procedimiento de la herida punzante de la vena yugular, se da preferencia al uso de paraformaldehído como fijador en condiciones hipertónicas porque el paraformaldehído, como un fijador pequeño que contiene aldehído, actúa rápidamente, pero es un fijador débil que tiende a dejar intacta la antigenicidad. Esto significa que los protocolos aquí descritos pueden complementarse con estudios de localización mediada por anticuerpos, ya sea a nivel de microscopio óptico o electrónico18,19. En el caso de la herida punzante de la arteria femoral, el glutaraldehído, un fijador de reticulación más fuerte, se utiliza junto con paraformaldehído en un tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M, pH 7,4, para estabilizar y fijar los trombos arteriales. Esta modificación es necesaria para compensar la presión arterial más alta de una arteria en comparación con una vena. En el caso arterial, la concentración de cacodilato de sodio es la mitad de la concentración utilizada en la solución fijadora para los trombos de la vena yugular.

El procedimiento de procesamiento de muestras para microscopía electrónica que se presenta aquí está adaptado a WA-TEM y proporciona información de microscopía electrónica de volumen limitado. WA-TEM produce una serie limitada de imágenes de alta resolución, con un tamaño de píxel de 3,185 nm o menos, a través de secciones transversales de trombos completos, ya sea paralelas o perpendiculares al flujo1. Se utiliza una combinación de cuchillas de vidrio y diamante para producir manualmente una serie de secciones transversales con un estimado del 10%, 25%, 50%, 75% y 90% en el trombo. Lograr secciones transversales completas de trombo requiere obtener imágenes de cientos de fotogramas con una cámara de calidad de microscopio electrónico de 4.000 x 4.000 píxeles. A continuación, se cosen los marcos. Se requieren entre 400 y 800 fotogramas para lograr una imagen de sección transversal completa. WA-TEM se puede complementar con SBF-SEM. SBF-SEM produce una serie de imágenes secuenciales de la cara del bloque a medida que se corta progresivamente en pequeños pasos con un cuchillo de diamante encerrado dentro del vacío de la cámara de imágenes SEM1. Estas imágenes se pueden juntar para dar una representación tridimensional completa del trombo en formación. Debido a que el micrótomo se encuentra dentro de la cámara de imágenes SEM, todos los pasos de tinción para SBF-SEM deben realizarse antes de la incrustación. La combinación de estos dos enfoques de microscopio electrónico permite obtener imágenes con una resolución de ~3 nm o más en un número limitado de secciones transversales, WA-TEM, o en toda la profundidad del trombo de herida punzante de tamaño casi milimétrico, SBF-SEM. La visualización de las imágenes WA-TEM unidas en el software 3DMOD10 permite una manipulación rápida entre varios niveles de zoom, de modo que incluso las vistas de alta resolución se pueden colocar en contexto dentro de la sección transversal de ancho completo del trombo.

En conclusión, presentamos un protocolo probado para producir trombos de heridas punzantes en ratones, fijarlos in situ y procesarlos para microscopía electrónica de una manera en la que el trombo pueda localizarse fácilmente dentro de la vena o arteria y trazar su orientación con respecto al flujo sanguíneo. Se presentan varios puntos de decisión para que el usuario pueda tomar decisiones sobre cómo se analizarán las muestras. Nos centramos en la preparación para la microscopía electrónica que destaca las membranas frente a otros componentes de la célula. Al final, la parte del protocolo que es más general para otras investigaciones es la apreciación por parte de los autores de que la microscopía electrónica de transmisión de área amplia (WA-TEM) es un enfoque de montaje que apoya el conocimiento a nanoescala de las células, es decir, las plaquetas dentro de una estructura grande, de tamaño cercano al milímetro, aquí el trombo en formación. La capacidad resultante de situar los detalles dentro del contexto general es la fuerza central de la combinación de los diversos pasos en un procedimiento completo.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés relacionados con este estudio.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento a los colegas de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (Jerry Ware y Sung W. Rhee), la Universidad de Pensilvania (Tim Stalker y Lawrence Brass), la Universidad de Kentucky (Sidney W. Whiteheart y Smita Joshi), y el Instituto Nacional de Bioimagen y Bioingeniería de los Institutos Nacionales de Salud (Richard D. Leapman y Maria A. Aronova) de quienes hemos aprendido mucho. Los autores expresan su agradecimiento a la Asociación Americana del Corazón y al Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de la Salud (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 a BS y a los subpremios de las subvenciones R01 HL146373 y R35 HL150818) de los NIH por su apoyo financiero.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina normal al 0,9%MedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint set de venas para cuero cabelludoMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint agujas hipodérmicasMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint agujas hipodérmicas especialesMedlineNDA26393
50 mL Tubos CónicosFisher Scientific06-443-20
Almohadillas de preparación con alcohol (70% de alcohol isopropílico)MedlineMDS090670Z
papel de aluminioFisher Scientific01-213-100
Placa calefactora para animalesPhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Microscopía electrónica Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 Cámara de microscopía CarlZeiss426560-9031-000
BD Jeringas Luer-Lok, 20 mLMedlineB-D303310Z
Cloruro de CalcioFisher ScientificC79-500
Placas de Cultivo Celular 35mm x 10mmCorning Inc.
Aplicadores con punta de algodónMedlineMDS202055H
DMP-30Activador Microscopía Electrónica Sciences13600
Anhídrido Dodecenil Sucínico/ DDSAMicroscopía Electrónica Sciences13700
Pinzas de Apósito, 5", curvado, dentado, de punta estrechaIntegra Miltex6-100
, 5", estándar, dentadoIntegra Miltex6-6
EMBED 812 ResinaMicroscopía Electrónica Ciencias14900
Alcohol etílico, anhidro 200 gradosCiencias de Microscopía Electrónica15055
Fisherbrand Rack de tubo de 4 víasFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand Temporizador digitalFisher Scientific14-649-17
Fisherbrand Bomba de infusión de jeringa únicaFisher Scientific7801001
Esponjas de gasa de 2" x 2" - 4 capasMedlineNON26224H
glutaraldehído (solución al 10%)Microscopía electrónica Sciences16120
Anestesia inhalante líquida de isoflurano, 100 mLMedline66794-017-10
Microfino estilo joyero Pinzas, Estilo 5FIntegra Miltex17-305Necesita 2 pares.
Tubo de bomba L/S, silicona, L/S 15; 25 piesVWRMFLX96410-15
Ácido L-aspárticoFisher ScientificBP374-100
Nitrato de plomoFisher ScientificL-62
Verde de malaquita 4Microscopía electrónica Sciences18100
Masterflex L/S Cabezal de bomba Easy-Load IIVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Variador de velocidad digitalVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Cortadores de alambreFisher Scientific50-191-9855
Tetróxido de osmio 4% solución acuosaMicroscopía electrónica Sciences19150
Paraformaldehído (solución al 16%)Microscopía electrónica Ciencias15710
Controladorde temperatura PhysitempPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Ferrocianuro de potasioSigma-AldrichP-8131
Óxido de propileno, reactivo ACSCiencias de la microscopía electrónica20401
Vasos de precipitados de vidrio PyrexFisher Scientific02-555-25B
Sonda de temperatura rectal para ratonesPhysitemp InstrumentsRET-3
Cinta invisible Scotch Magic, 3/4" x 1000"3M Compañía305289
Tampón de cacodilato de sodio 0.2M, pH 7.4Microscopía Electrónica Ciencias11623
SomnoFlo Vaporizador Electrónico de Bajo FlujoKent ScientificSF-01
SomnoFlo Kit de inicio para ratonesKent ScientificSF-MSEKIT
Pines de Minutien de acero inoxidableScience Herramientas26002-10
Microscopio estereoscópico steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopía495015-9880-010
Sylgard 184 Elastómero de siliconaWorld Precision InstrumentsSYLG184estera de silicona
Ácido tánicoMicroscopía electrónica Sciences21700
Tiocarbohidrazida (TCH)Sigma-Aldrich88535
Acetato de uraniloMicroscopía Electrónica Ciencias22400
Vannas Spring Micro TijerasFine Science Tools15000-08
Von Graefe Pinzas de apósito para ojos, 2.75", curvado, dentadoIntegra Miltex18-818Necesita 2 pares.
Tijeras Wagner Herramientas deCiencia Fina14068-12
Wahl MiniFigura Recortadora de AnimalesBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite SoftwareCarl Zeiss Microscopía410135-1001-000
430165 Pinzas de Apósito Fine

Referencias

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