Describimos un protocolo para extraer núcleos de alta calidad de tipos de células madre pluripotentes inducidas, estromales/endoteliales y de células sanguíneas criopreservadas para respaldar los análisis de secuenciación de próxima generación de un solo núcleo. La producción de núcleos intactos de alta calidad es imprescindible para los experimentos multiómicos, pero puede ser una barrera de entrada en el campo para algunos laboratorios.
Artículo de método
Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son excelentes plataformas para comprender el desarrollo sanguíneo, y las células sanguíneas derivadas de iPSC tienen utilidad traslacional como reactivos de pruebas clínicas y terapias celulares transfundibles. El advenimiento y la expansión del análisis multiómico, que incluye, entre otros, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq) y el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATACseq), ofrece el potencial de revolucionar nuestra comprensión del desarrollo celular. Esto incluye la biología del desarrollo utilizando modelos hematopoyéticos in vitro . Sin embargo, puede ser técnicamente difícil aislar núcleos intactos de células cultivadas o primarias. Los diferentes tipos de células a menudo requieren preparaciones nucleares personalizadas en función de la rigidez y el contenido celular. Estas dificultades técnicas pueden limitar la calidad de los datos y actuar como una barrera para los investigadores interesados en realizar estudios multiómicos. La criopreservación de muestras suele ser necesaria debido a las limitaciones de la recolección y/o el procesamiento de células, y las muestras congeladas pueden presentar desafíos técnicos adicionales para el aislamiento nuclear intacto. En este manuscrito, proporcionamos un método detallado para aislar núcleos de alta calidad de células derivadas de iPSC en diferentes etapas del desarrollo hematopoyético in vitro para su uso en flujos de trabajo multiómicos de un solo núcleo. Hemos centrado el desarrollo del método en el aislamiento de núcleos de células estromal/endoteliales adherentes derivadas de iPSC y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos celulares muy diferentes en cuanto a identidad estructural y celular. Los pasos de solución de problemas descritos limitaron la aglomeración y los desechos nucleares, lo que permitió la recuperación de núcleos en cantidad y calidad suficientes para los análisis posteriores. Métodos similares pueden adaptarse para aislar núcleos de otros tipos de células criopreservadas.
Introducción
La hematopoyesis es un sistema de desarrollo relativamente bien caracterizado, pero la incapacidad de recapitular la formación de células sanguíneas in vitro demuestra una comprensión incompleta de los factores relacionados. Los modelos de hematopoyesis basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden ayudar a dilucidar los factores clave del desarrollo y la biología relacionada. El sistema iPSC también ofrece un excelente modelo para estudiar los trastornos sanguíneos, y se han desarrollado células sanguíneas basadas en iPSC para producir reactivos relevantes desde el punto de vista traslacional y terapéutico 1,2,3,4. Los estudios de células individuales se han utilizado ampliamente para investigar la biología del desarrollo basada en iPSC, incluidos los tipos de células que se producen durante la hematopoyesis5. En comparación con la secuenciación masiva de ARN, que no puede inferir relaciones entre subpoblaciones celulares6, las modalidades de una sola célula permiten evaluar la heterogeneidad celular y pueden facilitar la identificación y caracterización del desarrollo celular 6,7.
La formación de células hematopoyéticas a partir de iPSC requiere una diferenciación secuencial a través de estados primitivos de raya, mesodermo y endotelial para formar células endoteliales hemogénicas. Las células endoteliales hemogénicas son precursoras directas de las células madre y progenitoras hematopoyéticas8. Estos tipos de células tienen propiedades morfológicas y celulares notablemente diferentes. Existe una comprensión limitada del panorama epigenético y la dinámica del desarrollo de los modelos de células hematopoyéticas derivadas in vitro, aunque este es un conocimiento esencial para desbloquear todo el potencial terapéutico del sistema iPSC. En muchos casos, solo las modalidades de análisis de células individuales permiten la identificación de poblaciones celulares, actividades transcripcionales, paisajes de cromatina y mecanismos reguladores que gobiernan el desarrollo entre preparaciones celulares heterogéneas.
Dos metodologías, la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq), pueden revelar información transcripcional a nivel de célula individual9. Un factor principal que dicta la validez y fiabilidad de los datos es la necesidad intransigente de muestras que cumplan con estrictos criterios de calidad. Estos incluyen requisitos precisos para la densidad celular/nuclear, viabilidad óptima y aglomeración mínima. La preparación de núcleos individuales puede ser un desafío técnico. Puede haber desafíos adicionales asociados con el uso de células previamente criopreservadas.
Observamos cuatro limitaciones potenciales importantes para los enfoques estándar de scRNAseq. En primer lugar, los protocolos estándar para generar suspensiones celulares a menudo hacen referencia a preparaciones a partir de células o tejidos frescos, en lugar de los recuperados después de la criopreservación10. Esto puede reducir la utilidad de recursos potencialmente valiosos. En segundo lugar, la eficiencia de disociación de diversos tipos de células es variable. Por ejemplo, muchos tipos de células inmunitarias se disocian con relativa facilidad. Por el contrario, las células estromalas, los fibroblastos y las células endoteliales, que normalmente están incrustadas en la matriz extracelular y la membrana basal, tienen propiedades celulares únicas que pueden complicar el aislamiento de los núcleos11,12. Estas propiedades pueden requerir protocolos de disociación agresivos, lo que puede poner en peligro la integridad estructural de las poblaciones celulares más delicadas. En tercer lugar, algunas células (por ejemplo, los megacariocitos) pueden superar los 100 μm de diámetro y plantean dificultades para varias plataformas comerciales unicelulares existentes13. Además, el manejo inadecuado puede provocar daño celular y respuestas de estrés durante los pasos iniciales del aislamiento celular, involucrando hidrólisis enzimática y disociación mecánica, lo que puede afectar los perfiles de expresión génica11,14.
Por estas y otras razones, un enfoque de un solo núcleo puede ser una alternativa preferible a los métodos de una sola célula15. Dada la estabilidad superior de la membrana nuclear en comparación con la membrana celular, la envoltura nuclear puede permanecer intacta incluso después de la criopreservación de tejidos16. Esto puede facilitar la extracción nuclear y mejorar la diversidad de tipos de muestras adecuados para las modalidades de secuenciación de próxima generación. En segundo lugar, los núcleos exhiben una mayor resistencia a las perturbaciones mecánicas y tienden a manifestar menos cambios transcripcionales durante la disociación14. Por lo tanto, los núcleos pueden proporcionar una mayor estabilidad del ARN y perfiles transcripcionales más reproducibles. Una tercera ventaja notable de los métodos de núcleo único es la falta de restricciones de tamaño celular y la aplicabilidad para células más grandes, como cardiomiocitos o megacariocitos12. En cuarto lugar, los núcleos sirven como sustratos adecuados para los análisis multiómicos, que ofrecen una visión ampliada del análisis integrado de la expresión génica, las regiones de cromatina accesibles y otros parámetros17, lo que permite una comprensión más profunda de la heterogeneidad, el desarrollo y los estados funcionales de las células18.
Al perfilar las iPSC durante el desarrollo hematopoyético, los enfoques multiómicos pueden ayudar a definir los procesos de desarrollo en modelos de enfermedades normales o patológicas. Las comparaciones de células derivadas de iPSC con células o tejidos primarios también pueden proporcionar una evaluación de la fidelidad del modelo de iPSC a la biología in vivo , lo que facilita la mejora del modelo de iPSC y el descubrimiento de nuevas poblaciones celulares y factores que impulsan la formación de sangre.
Aunque muchos grupos han navegado con éxito el aislamiento nuclear y el análisis de secuenciación de próxima generación resultante, el aislamiento de núcleos de alta calidad sigue siendo una barrera para algunos laboratorios interesados en realizar análisis basados en un solo núcleo. Este manuscrito detalla un protocolo para aislar núcleos de calidad de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nos hemos centrado en las células estromalas/endoteliales adherentes y en las células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos de células muy diferentes en cuanto a estructura y contenido que exigen modificaciones y resolución de problemas a medida para aumentar la recuperación de núcleos de alta calidad susceptibles de secuenciación de próxima generación u otros experimentos.
Protocolo
1. Criopreservación de células
- Congele >1 x 106 células aisladas derivadas de iPSC por ml en 1 ml de 90 % de FBS y 10 % de DMSO. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación a -80 °C para reducir la velocidad de congelación y optimizar la recuperación de células viables (Tabla de materiales). Anticipe una pérdida celular considerable, que puede variar según las condiciones de cultivo y la identidad celular.
- Pase de -80 °C al almacenamiento de nitrógeno líquido en 24 h.
2. Descongelación de células
- Recupere el criovial del almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 °C durante 2 minutos. Retirar del baño de agua mientras aún sean visibles los pequeños cristales de hielo.
- Transfiera las células del criovial a un tubo vacío de 15 mL y agregue lentamente 10 mL de medio precalentado (RPMI 1640 + 10% FBS) mientras mezcla con cuidado. Centrifugar a 400 x g durante 3 min a 25 °C.
- Aspirar el sobrenadante y reconstituir en 1 mL de DPBS suplementado con 2% de FBS y 1 mM de CaCl2 (Tabla de Materiales). Mezcle cuidadosamente pipeteando 3x con una micropipeta de 1000 μL. Transfiera a un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo.
3. Eliminación de células muertas
- Añadir 50 μL de cóctel de eliminación de células muertas (Tabla de Materiales) a 1 mL de suspensión celular. Añadir 50 μL de cóctel de selección de biotina a la mezcla de células. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Estos pasos etiquetan las células muertas de Anexina V+ contenidas dentro de la suspensión celular con biotina.
- Vigorosamente vórtice durante 30 s, las perlas de dextrano diseñadas para el agotamiento de tipos celulares no deseados marcados con biotina (Tabla de Materiales). Agregue 100 μL de perlas de dextrano a la suspensión celular y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una micropipeta de 1000 μL (Tabla de materiales).
- Añada 1,3 mL de DPBS que contenga un 2% de FBS y 1 mM de CaCl2 a la suspensión celular y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una micropipeta de 1000 μL. Coloque el tubo en el imán (Tabla de Materiales) e incube a temperatura ambiente durante 3 min.
- Invierta el imán y el tubo para verter la suspensión de células vivas enriquecida en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 400 x g durante 3 min a 4°C. Retirar la mayor parte del sobrenadante y volver a suspender en 1 mL de DPBS + 0,04% BSA. Mezclar suavemente pipeteando 3 veces con una micropipeta de 1000 μL.
4. Aislamiento de núcleos
- Centrifugar la suspensión de células vivas a 460 x g durante 5 minutos a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante, asegurándose de que no se interrumpa el pellet de la célula.
- Añadir 100 μL de tampón de lisis 0,5x recién preparado y enfriado con hielo (Tabla 1) y mezclar suavemente pipeteando 10x con una micropipeta de 100 μL. Incubar 3 min en hielo.
- Añadir 500 μL de tampón de lavado refrigerado (Tabla 2) al tubo sin mezclar. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Lavado y valoración de núcleos
- Aspire el sobrenadante y añada 500 μL de tampón de lavado frío para disolver el pellet intacto restante sin mezclar. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Retire todo el sobrenadante sin alterar la pellets de núcleo.
- Volver a suspender en 120 μL de tampón de núcleos diluidos refrigerados (Tabla 3). Filtre la suspensión celular con un filtro celular de 40 μm (Tabla de materiales).
- Teñir con azul de tripano al 0,4% y evaluar visualmente la calidad de los núcleos aislados con un microscopio de 10x (Tabla de materiales).
6. Procesamiento de núcleos aislados
- Mantenga los núcleos en hielo. Proceda al procesamiento posterior de inmediato, ya que la aglomeración nuclear puede ocurrir con el tiempo y requerir pasos de filtración adicionales.
Resultados
Empleamos el protocolo mencionado anteriormente para extraer núcleos de células estromalas/endoteliales adherentes derivadas de iPSC criopreservadas y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes (flotantes). En la Figura 1 se puede encontrar una representación esquemática detallada del procedimiento de aislamiento nuclear.
Para el examen morfológico, los núcleos aislados se tiñeron con azul de tripano y se visualizaron bajo un microscopio. El examen morfológico nuclear es fundamental inmediatamente antes del procesamiento, ya que los desechos o los núcleos agrupados pueden disminuir o impedir la generación de datos de calidad debido a obstrucciones en los instrumentos microfluídicos de precisión. El examen microscópico de los núcleos aislados de una muestra que se preparó utilizando un protocolo de kit convencional mostró la presencia de escombros y ≥1 agregado nuclear por campo visualizado (Figura 2A-B). Estas muestras fueron descartadas debido a su calidad inferior.
Los núcleos de alta calidad son redondos e intactos, con grumos mínimos o nulos, como los que observamos después de la optimización del método (Figura 2C-D). No observamos agregados ni aglomeraciones en estas muestras. Estos núcleos tenían la calidad y cantidad suficientes para soportar el procesamiento y el análisis posteriores. La resolución de problemas y la optimización de protocolos similares pueden extenderse potencialmente a otros tipos de células criopreservadas.
Figura 1: Diagrama que ilustra la extracción de núcleos de células criopreservadas. Representación visual que detalla los pasos involucrados en el aislamiento nuclear de células criopreservadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Núcleos aislados de células humanas criopreservadas derivadas de iPSC. Los núcleos aislados de las células estromalas/endoteliales adherentes teñidas con azul de tripán muestran residuos significativos (A) partículas pequeñas y (B) agregados nucleares (partículas grandes) que impidieron los análisis posteriores. Después de realizar las modificaciones técnicas presentadas aquí, se aislaron núcleos de alta calidad de (C) células progenitoras hematopoyéticas humanas derivadas de iPSC criopreservadas o poblaciones de células estromales/endoteliales (D) en cantidades suficientes para respaldar los análisis posteriores. Como referencia, estas células progenitoras hematopoyéticas no adherentes se recolectaron en el día 9 + 8 y las células estromalas/endoteliales adherentes en el día 9 + 7 de diferenciación hematopoyética como se describe en4. Tenga en cuenta que la morfología nuclear puede diferir según el tipo de célula. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Preparación del tampón | |||
| Tampón de lisis 0.5X | Acción | Final | 2 mL |
| 1X Tampón de lisis | 1X | 0.5X | 1 mL |
| Tampón de dilución de lisis | 1 mL | ||
| Tampón de lisis | Acción | Final | 2 mL |
| BSA | 10% | 1% | 200 μL |
| Digitonina | 5% | 0.01% | 4 μL |
| TDT | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 6 μl |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 4 μL |
| Sustituto Nonidet P40 | 10% | 0.10% | 20 μL |
| Agua libre de nucleasas | 1,67 mL | ||
| Inhibidor de la ARNasa | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 M | 10 mM | 20 μL |
| Preadolescente-20 | 10% | 0.10% | 20 μL |
| Tampón de dilución de lisis | Acción | Final | 2 ml |
| BSA | 10% | 1% | 200 μl |
| TDT | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 6 μL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 4 μL |
| Agua libre de nucleasas | 1,72 mL | ||
| Inhibidor de la ARNasa | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 M | 10 mM | 20 μl |
Tabla 1: Preparación de tampón de lisis 0,5x. Esta solución se designa para el procedimiento de aislamiento de núcleos en el paso 4.2. El tampón de lisis y el tampón de dilución de lisis se mezclan para preparar un tampón de lisis 0,5x. Es imperativo preparar un tampón fresco inmediatamente antes de cada experimento y mantenerlo en hielo. Tenga en cuenta que la resolución de problemas para algunos tipos de células puede implicar diluciones 1x, 0,5x o inferiores de tampón de lisis para facilitar el aislamiento del núcleo intacto.
| Preparación del tampón | |||
| Tampón de lavado | Acción | Final | 4 mL |
| BSA | 10% | 1% | 400 μL |
| TDT | 1000 mM | 1 mM | 4 μL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 12 μL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 8 μL |
| Agua libre de nucleasas | 3.40 mL | ||
| Inhibidor de la ARNasa | 40 U/μl | 1 U/μl | 100 μL |
| Tris-HCl (pH 7.4) | 1 M | 10 mM | 40 μL |
| Preadolescente-20 | 10% | 0.10% | 40 μL |
Tabla 2: Preparación del tampón de lavado. Esta solución se utiliza durante el aislamiento de núcleos. Esto debe prepararse fresco antes de cada experimento y mantenerse en hielo.
| Preparación del tampón | |||
| Tampón de núcleos diluidos | Acción | Final | 1 mL |
| TDT | 1000 mM | 1 mM | 1 μL |
| Agua libre de nucleasas | 924 μL | ||
| Búfer de núcleos | 20 veces | 1X | 50 μL |
| Inhibidor de la ARNasa | 40 U/μL | 1 U/μL | 25 μL |
Tabla 3: Preparación de tampón de núcleos diluidos. Esta solución se utiliza en el paso 5.2. Debe prepararse fresco antes de cada experimento y mantenerse en hielo.
Discusión
Pasos críticos dentro del protocolo
El aislamiento de núcleos de alta calidad es esencial para la implementación exitosa de las modalidades actuales de secuenciación de próxima generación basadas en un solo núcleo, que están evolucionando rápidamente. En reconocimiento de las barreras existentes para los laboratorios interesados en estos enfoques, particularmente para los especímenes criopreservados, nuestra intención era diseñar una técnica de aislamiento nuclear adaptada para células previamente congeladas. A menudo es necesario aislar los núcleos de las muestras criopreservadas para las muestras clínicas y para las poblaciones celulares raras derivadas de iPSC.
Es importante adaptar la dilución del tampón de lisis, el tiempo de lisis y la frecuencia de filtración para poblaciones celulares específicas. Hemos observado tipos de células particularmente sensibles, como las células progenitoras hematopoyéticas derivadas de iPSC humanas criopreservadas, que se sobrelisan en menos de un minuto con tampón de lisis 1x. Este exceso de lisis no es simplemente un mal funcionamiento técnico u operativo. Más bien, la lisis excesiva y la aglomeración pueden indicar fugas de materiales nucleares adhesivos. En el caso de las células estromales y endoteliales adherentes con una arquitectura citoesquelética robusta y membranas propensas a formar fuertes adherencias célula-célula, fue necesaria una doble filtración para eliminar los núcleos agrupados. Los agregados nucleares pueden obstruir los canales microfluídicos, lo que presenta riesgos tangibles para la integridad experimental y potencialmente impide cualquier salida de datos.
También descubrimos que la incorporación de un paso de eliminación de células muertas aumentaba drásticamente la recuperación de los núcleos intactos al tiempo que limitaba la aglomeración y los desechos. Al inicio del experimento ha sido necesario procesar muestras que contenían un >70% de células viables mediante tinción con azul de tripano. Mantener todos los amortiguadores en hielo también puede ayudar a mantener la viabilidad.
Limitaciones de la técnica
El método descrito fue diseñado para optimizar la recuperación nuclear a partir de tipos de células derivadas de iPSC cultivadas4. Es posible que procedimientos similares de resolución de problemas se extiendan más allá de las células inducidas por iPSC para incluir otros tipos de células criopreservadas, pero es algo difícil predecir las necesidades específicas para muestras individuales o tipos de células sin pruebas. Independientemente de la muestra o el tipo de célula, el objetivo de preparaciones nucleares con un <5% de células enteras viables restantes, minimizando la agregación y reduciendo los núcleos sobrelisados debería correlacionarse directamente con el éxito experimental.
Importancia con respecto a los métodos existentes
Los sistemas de diferenciación basados en iPSC traslacionalmente relevantes pueden producir una multitud de tipos de células y progenitores. Este protocolo se centra en las células estromalas/endoteliales adherentes derivadas de iPSC y las células progenitoras hematopoyéticas no adherentes como tipos de células ejemplares que tenían diferentes requisitos metodológicos para optimizar el aislamiento nuclear. Anticipamos que este protocolo se puede adaptar y aplicar a otros tipos de células derivadas de iPSC para interrogar las etapas fundamentales del desarrollo, reconociendo que es necesario ajustar los métodos de aislamiento en función del contenido de proteínas, la estructura de la membrana y la rigidez celular. Sin embargo, la metodología descrita aquí puede permitir la recuperación de núcleos de alta calidad de un amplio espectro de tipos de células criopreservadas.
Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Jason Hatakeyama (10x Genomics) y Diana Slater (Centro de Genómica Aplicada del Hospital Infantil de Filadelfia) por su orientación y sugerencias. Este estudio contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (HL156052 a CST).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo celular fuerte | |||
| sulfóxido de dimetilo fuerte (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Suero fetal bovino (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| fuertes< / células | |||
| N | /A | N/A | Las iPSC utilizadas en este estudio se obtuvieron a través de los |
| reactivos de tinción > células fuertes de CHOP < CHOP; Solución de azul de | |||
| tripano | Corning | 25900CI | |
| reactivos > eliminación de células muertas fuertes | |||
| calcio fuerte (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Kit de eliminación de células muertas (anexina V) | StemCell Technologies | 17899 | Este kit está diseñado para el agotamiento de los tipos de células no deseadas marcadas con biotina. El kit incluye el cóctel de eliminación de células muertas (anexina V), el cóctel de selección de biotina y las perlas de dextrano. Este kit se dirige a la fosfatidilserina en la valva externa de la membrana celular de las células apoptóticas que utilizan anexina V. Las células no deseadas se marcan con anexina V, anticuerpos biotinilados y partículas magnéticas, y se separan sin columnas con un imán EasySep. Las células deseadas simplemente se vierten en un nuevo tubo. |
| Materiales | |||
| 10 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231606 | ||
| 100 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231598 | ||
| 1000 y micro; l Punta universal extendida | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 y micro; l Micropipeta | Wards science 470231602 | ||
| 2.0 ml Viales criogénicos | Corning | 431386 | |
| 20 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231608 | ||
| 200 y micro; l Micropipeta | Wards science 470231600 | ||
| 5ml Poliestireno Tubo de fondo redondo | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 y micro; l Estación | de punta de pipeta Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l Estación | de punta de pipeta Corning | 4144 | |
| Cámara de recuento | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Contenedor de congelación | Nalgene | 51000001 | |
| aislamiento de núcleos fuertes< / | lisis, Tampón de lavado, tampón de núcleos diluidos y tampón de dilución de lisis. La constitución de estos tampones se encuentra en la Tabla 1, 2 y 3. Nuestro método de aislamiento de núcleos mejoró el aislamiento de los protocolos estándar del kit (por ejemplo, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Guide [CG000338]). Este protocolo se puede utilizar con varios kits comerciales, incluido el Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Kit de eliminación de células muertas | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS albúmina sérica bovina (BSA) Solución | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| solución de cloruro de magnesio, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Sustituto | Sigma | 74385 | |
| Sin nucleasas Agua | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Tampón de núcleos (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector Inhibidor de la RNasa | Sigma | 3335399001 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Solución de cloruro de sodio, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Clorhidrato de Trizma Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Clorhidrato de Trizma (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Otros equipos | |||
| Contador celular automatizado | CytoSMART | ||
| Zeiss Primostar | 3 |
Referencias
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine. Blood. 140 (15), 1723-1734 (2022).
- Zeng, J., Tang, S. Y., Toh, L. L., Wang, S. Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rep. 9 (6), 1796-1812 (2017).
- Pavani, G., et al. Modeling primitive and definitive erythropoiesis with induced pluripotent stem cells. Blood Adv. , (2024).
- Chen, X., et al. Integrative epigenomic and transcriptomic analysis reveals the requirement of JUNB for hematopoietic fate induction. Nat Comm. 13 (1), 3131(2022).
- Yu, X., Abbas-Aghababazadeh, F., Chen, Y. A., Fridley, B. L. Statistical and bioinformatics analysis of data from bulk and single-cell RNA sequencing experiments. Methods Mol Biol. 2194, 143-175 (2021).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Curr Protoc. 1 (5), e132(2021).
- Del-Aguila, J. L., et al. A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain. Alzheimer's Res Ther. 11 (1), 71(2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS one. 13 (12), e0209648(2018).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
- Maciejowski, J., Hatch, E. M. Nuclear membrane rupture and its consequences. Ann Rev Cell Dev Biol. 36, 85-114 (2020).
- Fang, R., et al. Comprehensive analysis of single cell ATAC-seq data with SnapATAC. Nat Comm. 12 (1), 1337(2021).
- Baysoy, A., Bai, Z., Satija, R., Fan, R. The technological landscape and applications of single-cell multi-omics. Nat Rev. Mol Cell Biol. 24 (10), 695-713 (2023).
Reimpresiones y permisos
