Describimos un protocolo para extraer núcleos de alta calidad de tipos de células madre pluripotentes inducidas, estromales/endoteliales y de células sanguíneas criopreservadas para respaldar los análisis de secuenciación de próxima generación de un solo núcleo. La producción de núcleos intactos de alta calidad es imprescindible para los experimentos multiómicos, pero puede ser una barrera de entrada en el campo para algunos laboratorios.
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Artículo de método
Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son excelentes plataformas para comprender el desarrollo sanguíneo, y las células sanguíneas derivadas de iPSC tienen utilidad traslacional como reactivos de pruebas clínicas y terapias celulares transfundibles. El advenimiento y la expansión del análisis multiómico, que incluye, entre otros, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNAseq) y el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (snATACseq), ofrece el potencial de revolucionar nuestra comprensión del desarrollo celular. Esto incluye la biología del desarrollo utilizando modelos hematopoyéticos in vitro . Sin embargo, puede ser técnicamente difícil aislar núcleos intactos de células cultivadas o primarias. Los diferentes tipos de células a menudo requieren preparaciones nucleares personalizadas en función de la rigidez y el contenido celular. Estas dificultades técnicas pueden limitar la calidad de los datos y actuar como una barrera para los investigadores interesados en realizar estudios multiómicos. La criopreservación de muestras suele ser necesaria debido a las limitaciones de la recolección y/o el procesamiento de células, y las muestras congeladas pueden presentar desafíos técnicos adicionales para el aislamiento nuclear intacto. En este manuscrito, proporcionamos un método detallado para aislar núcleos de alta calidad de células derivadas de iPSC en diferentes etapas del desarrollo hematopoyético in vitro para su uso en flujos de trabajo multiómicos de un solo núcleo. Hemos centrado el desarrollo del método en el aislamiento de núcleos de células estromal/endoteliales adherentes derivadas de iPSC y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes, ya que representan tipos celulares muy diferentes en cuanto a identidad estructural y celular. Los pasos de solución de problemas descritos limitaron la aglomeración y los desechos nucleares, lo que permitió la recuperación de núcleos en cantidad y calidad suficientes para los análisis posteriores. Métodos similares pueden adaptarse para aislar núcleos de otros tipos de células criopreservadas.
Introducción
La hematopoyesis es un sistema de desarrollo relativamente bien caracterizado, pero la incapacidad de recapitular la formación de células sanguíneas in vitro demuestra una comprensión incompleta de los factores relacionados. Los modelos de hematopoyesis basados en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden ayudar a dilucidar los factores clave del desarrollo y la biología relacionada. El sistema iPSC también ofrece un excelente modelo para estudiar los trastornos sanguíneos, y se han desarrollado células sanguíneas basadas en iPSC para producir reactivos relevantes desde el punto de vista traslacional y terapéutico ....
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Protocolo
1. Criopreservación de células
- Congele >1 x 106 células aisladas derivadas de iPSC por ml en 1 ml de 90 % de FBS y 10 % de DMSO. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación a -80 °C para reducir la velocidad de congelación y optimizar la recuperación de células viables (Tabla de materiales). Anticipe una pérdida celular considerable, que puede variar según las condiciones de cultivo y la identidad celular.
- Pase de -80 °C al almacenamiento de nitrógeno líquido en 24 h.
2. Descongelación de células
- Recupere el criovial del almacenamien....
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Resultados
Empleamos el protocolo mencionado anteriormente para extraer núcleos de células estromalas/endoteliales adherentes derivadas de iPSC criopreservadas y células progenitoras hematopoyéticas no adherentes (flotantes). En la Figura 1 se puede encontrar una representación esquemática detallada del procedimiento de aislamiento nuclear.
Para el examen morfológico, los núcleos aislados se tiñeron con azul de tripano y se visualizaron bajo un microscopio. El examen morfoló.......
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Discusión
Pasos críticos dentro del protocolo
El aislamiento de núcleos de alta calidad es esencial para la implementación exitosa de las modalidades actuales de secuenciación de próxima generación basadas en un solo núcleo, que están evolucionando rápidamente. En reconocimiento de las barreras existentes para los laboratorios interesados en estos enfoques, particularmente para los especímenes criopreservados, nuestra intención era diseñar una técnica de aislamiento nuclear adaptada para células previamente con.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Jason Hatakeyama (10x Genomics) y Diana Slater (Centro de Genómica Aplicada del Hospital Infantil de Filadelfia) por su orientación y sugerencias. Este estudio contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (HL156052 a CST).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo celular fuerte | |||
| sulfóxido de dimetilo fuerte (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Suero fetal bovino (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| fuertes< / células | |||
| N | /A | N/A | Las iPSC utilizadas en este estudio se obtuvieron a través de los |
| reactivos de tinción > células fuertes de CHOP < CHOP; Solución de azul de | |||
| tripano | Corning | 25900CI | |
| reactivos > eliminación de células muertas fuertes | |||
| calcio fuerte (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Kit de eliminación de células muertas (anexina V) | StemCell Technologies | 17899 | Este kit está diseñado para el agotamiento de los tipos de células no deseadas marcadas con biotina. El kit incluye el cóctel de eliminación de células muertas (anexina V), el cóctel de selección de biotina y las perlas de dextrano. Este kit se dirige a la fosfatidilserina en la valva externa de la membrana celular de las células apoptóticas que utilizan anexina V. Las células no deseadas se marcan con anexina V, anticuerpos biotinilados y partículas magnéticas, y se separan sin columnas con un imán EasySep. Las células deseadas simplemente se vierten en un nuevo tubo. |
| Materiales | |||
| 10 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231606 | ||
| 100 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231598 | ||
| 1000 y micro; l Punta universal extendida | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 y micro; l Micropipeta | Wards science 470231602 | ||
| 2.0 ml Viales criogénicos | Corning | 431386 | |
| 20 y micro; l Micropipeta | Wards ciencia 470231608 | ||
| 200 y micro; l Micropipeta | Wards science 470231600 | ||
| 5ml Poliestireno Tubo de fondo redondo | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 y micro; l Estación | de punta de pipeta Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l Estación | de punta de pipeta Corning | 4144 | |
| Cámara de recuento | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Contenedor de congelación | Nalgene | 51000001 | |
| aislamiento de núcleos fuertes< / | lisis, Tampón de lavado, tampón de núcleos diluidos y tampón de dilución de lisis. La constitución de estos tampones se encuentra en la Tabla 1, 2 y 3. Nuestro método de aislamiento de núcleos mejoró el aislamiento de los protocolos estándar del kit (por ejemplo, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Guide [CG000338]). Este protocolo se puede utilizar con varios kits comerciales, incluido el Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Kit de eliminación de células muertas | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS albúmina sérica bovina (BSA) Solución | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| solución de cloruro de magnesio, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Sustituto | Sigma | 74385 | |
| Sin nucleasas Agua | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Tampón de núcleos (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector Inhibidor de la RNasa | Sigma | 3335399001 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Solución de cloruro de sodio, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Clorhidrato de Trizma Soultion, pH 7.4 | Sigma | T2194 | |
| Clorhidrato de Trizma (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Otros equipos | |||
| Contador celular automatizado | CytoSMART | ||
| Zeiss Primostar | 3 |
Referencias
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.....
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Reimpresiones y permisos
