Se logró un registro simultáneo de la actividad autonómica y el comportamiento materno detallado de las madres ratones desde el embarazo hasta la lactancia utilizando un sistema de telemetría. Este método ayuda a comprender la dinámica de las características fisiológicas y conductuales de las madres desde el embarazo hasta el destete.
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Artículo de método
Análisis de Electrocardiogramas y Comportamiento en Ratones desde el Embarazo hasta el Periodo de Lactancia
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Resumen
Resumen
Los cambios en la relación madre-hijo van presumiblemente acompañados de cambios dinámicos en el sistema nervioso autónomo. Aunque se han realizado mediciones temporales de la actividad autonómica en madres y lactantes humanos, el análisis de los cambios a largo plazo sigue sin explorarse. Las madres de ratón pueden formar vínculos sociales con sus crías y tienen un corto período de embarazo y lactancia, lo que las hace útiles para el examen de los cambios fisiológicos desde el embarazo hasta la crianza de las crías. Por lo tanto, se utilizó un sistema de telemetría durante varias semanas para medir los cambios en el sistema nervioso autónomo y el comportamiento de las madres de ratón. Los resultados actuales mostraron que un electrocardiograma (ECG) puede registrarse de manera estable independientemente de los movimientos de las madres y el parto. El análisis de ECG mostró que la frecuencia cardíaca disminuyó gradualmente desde el embarazo hasta la lactancia, y la actividad simpática aumentó bruscamente a medida que las crías se desarrollaban. Además, el registro simultáneo de la conducta y el ECG en la jaula doméstica nos permitió comprender las influencias dependientes del comportamiento en el ECG, revelando así las características de la actividad nerviosa autónoma durante cada comportamiento. Por lo tanto, el presente método experimental ayuda a comprender cómo cambian las características fisiológicas de las madres desde el embarazo hasta la crianza de las crías, apoyando el desarrollo saludable de las crías.
Introducción
La relación madre-cría es única entre las relaciones establecidas por diversas especies animales debido a su gran impacto en el futuro de la descendencia1. En los seres humanos, el desarrollo y los comportamientos internos/externos de los niños están influenciados por el estilo de crianza, así como por el grado de abuso y negligencia 2,3. De manera similar, en roedores, la calidad del comportamiento materno tiene un impacto significativo en el desarrollo y el comportamiento de las crías 4,5,6. Por lo tanto, el seguimiento y el examen detallados de los comportamientos de crianza de las madres pueden proporcionar información sobre los mecanismos de las diferencias individuales en el desarrollo y el apoyo saludable de su descendencia.
Los estudios conductuales y fisiológicos han demostrado que las madres mamíferos experimentan cambios dinámicos de comportamiento y fisiológicos desde el embarazo hasta la lactancia. Cuando las hembras de mamíferos quedan embarazadas, la secreción de estrógenos y otras hormonas cambia en el comportamiento materno7. A medida que la descendencia crece y la frecuencia de lactancia disminuye, la secreción hormonal cambia dinámicamente hacia el estado pre-embarazo, poniendo fin a la expresión del comportamiento materno 8,9,10. Estos hallazgos sugieren que la interacción entre el sistema endocrino, el comportamiento materno y el desarrollo de la descendencia juega un papel importante en los cambios que experimentan las madres mamíferos durante el embarazo y la lactancia.
Los cambios conductuales y fisiológicos en las madres mamíferos desde el embarazo hasta la lactancia están estrechamente relacionados no solo con el sistema endocrino, sino también con el sistema nervioso autónomo11,12. Los estudios en humanos sugieren que el contacto madre-hijo induce cambios en el sistema nervioso autónomo tanto de las madres como de los bebés13. Varios estudios han medido la variabilidad del electrocardiograma (ECG) y de la frecuencia cardíaca en madres y lactantes humanos, demostrando que cada comportamiento altera la frecuencia cardíaca y el intervalo RR de los demás 14,15,16. Sin embargo, no está claro cómo los tres factores (sistema nervioso autónomo, comportamiento materno y desarrollo de la descendencia) interactúan entre sí desde el embarazo hasta la lactancia. Además, es difícil monitorear estas interacciones en humanos durante un largo período de tiempo porque el período de lactancia humana es de aproximadamente dos años.
A menudo se utilizan roedores en lugar de humanos en este tipo de estudios. El sistema nervioso autónomo de los roedores se ha medido bajo anestesia o cuando se aísla de las crías para evitar el registro inestable y el daño al dispositivo de medición; Por lo tanto, la medición es temporal en situaciones de comportamiento restringido 17,18,19. Es esencial observar el sistema nervioso autónomo en un ambiente donde los roedores puedan moverse libremente y comunicarse con otros, ya que las interacciones madre-cachorro pueden alterar el comportamiento y la fisiología de las madres 8,9,10,15.
Este método experimental se desarrolló para permitir el libre movimiento de la madre. En este método, se colocó un telémetro de ECG por vía subcutánea a una madre embarazada para evitar daños en el dispositivo y permitir un registro de ECG estable a largo plazo desde el embarazo hasta la lactancia. Las madres de ratones pueden exhibir comportamientos generales (autoaseo, ingesta de alimentos, etc.) y comportamientos maternos habituales en su jaula doméstica; por lo tanto, cada comportamiento y ECG se pueden observar y comparar fácilmente en el mismo ratón. Un grabador de unidades registró el comportamiento del ratón durante 24 horas durante un período de cuatro semanas. Este protocolo experimental nos permitió rastrear los cambios dinámicos en la actividad autonómica y el comportamiento desde el embarazo hasta el período de maternidad.
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Azabu (#210319-30). Para el presente estudio se utilizaron ratones C57B/6J en el día de gestación (GD) 14 con un peso superior a 22 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Los reactivos y el equipo necesarios para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación experimental
- Encienda el panel calefactor y cúbralo con papel de aluminio. Limpie todas las superficies con etanol al 70%.
- Todos los instrumentos quirúrgicos (tijeras, fórceps, pinzas finas y pinzas) se esterilizaron en autoclave con anticipación.
- Prepare las suturas estériles a la longitud deseada y manténgala lista.
- Cubra las mascarillas de anestesia con mascarillas de goma para garantizar la esterilidad y la comodidad del paciente.
- Inspeccione el telémetro de biopotencial del ratón (Figura 1A) para detectar cualquier anomalía o daño utilizando las aplicaciones tBase y LabChart (el software de análisis de datos fisiológicos) instaladas en una computadora capaz de registrar.
2. Implantación del telémetro
- Coloque el ratón en una caja de anestesia de inducción con isoflurano al 4%.
- Después de alcanzar el plano quirúrgico de anestesia, coloque el mouse en posición prona sobre el panel calentador. Colocar la máscara de anestesia en el ratón, manteniendo un nivel de isoflurano de 1%-2,0% y un flujo de oxígeno de 0,5-2 L/min.
NOTA: En este protocolo no se utilizaron analgésicos, teniendo en cuenta sus efectos sobre el feto y las observaciones conductuales. - Use un cortaúñas para quitar el pelo entre las orejas y desinfecte la piel tres veces con desinfectantes a base de yodo y alcohol al 70%.
- Para confirmar el plano quirúrgico de la anestesia, pellizque los dedos de las patas traseras del ratón con una pinza. Haga una incisión (2-3 cm) en la piel entre las orejas con unas tijeras. Inserte pinzas en la incisión para separar la piel y el músculo alrededor del cuello y el lado ventral, creando espacio en el lado ventral específicamente para la colocación de telemetría.
- Inserte el telémetro a través de la incisión entre las orejas y colóquelo en el espacio lateral ventral.
- Use pinzas para enrollar y agrupar los cables positivos y negativos. Coloque los cables en el espacio del cuello (Figura 1B).
- Suturar la incisión con una aguja de 13 mm y una sutura de 20 cm, teniendo cuidado de no dañar los electrodos.
- Coloque el ratón en posición supina y arranque el pelo alrededor de la clavícula con un cortaúñas. Desinfectar la piel tres veces alternando desinfectantes a base de yodo y alcohol al 70%.
- Haz un pequeño corte alrededor de la piel de la clavícula con unas tijeras y separa los músculos de la piel del cuello. Extraiga los cables positivo y negativo de la parte posterior del cuello con pinzas.
- Use fórceps para separar las glándulas salivales y exponer la apariencia en forma de "V" del músculo esternocleidomastoideo (SCM), que se origina en la clavícula y viaja oblicuamente a través de cada lado del cuello (Figura 1C, D).
- Ajuste la longitud del cable negativo para llegar al SCM cerca de la clavícula. Retire con cuidado el tubo de cable del cable negativo, asegurándose de que el electrodo de acero inoxidable enrollado en el interior se estire con pinzas finas.
- Pase la aguja de sutura (7 mm) con una sutura de 10 cm a través de la curva en forma de V del SCM para crear un bucle. Pase el electrodo de acero inoxidable desde el cable negativo a través de este bucle y colóquelo debajo del SCM cerca de la clavícula.
- Ate ligeramente el lazo para evitar dañar el SCM y repita tres veces para asegurar el electrodo de acero inoxidable. Asegure aún más el cable negativo colocando la segunda sutura en el lado craneal del SCM y atándola alrededor del tubo del cable negativo (Figura 1E).
- Realice secciones alrededor de la apófisis xifoides y separe cuidadosamente la piel del músculo de la apófisis xifoides hasta la clavícula.
- Extienda el cable positivo para alcanzar el proceso xifoides. Al igual que el cable negativo, retire el tubo del cable positivo, asegurándose de que el electrodo de acero inoxidable enrollado en el interior se estire con pinzas finas.
- Use una aguja de 18 G para crear un túnel debajo del músculo alrededor de la apófisis xifoides, luego coloque el electrodo de acero inoxidable en una aguja y páselo a través del músculo alrededor de la apófisis xifoides.
- Después de retirar la aguja, suturar ligeramente el electrodo de acero inoxidable enrollado al músculo alrededor de la apófisis xifoides con una aguja de sutura (7 mm) con una sutura de 10 cm (Figura 1D). Para asegurar aún más el cable positivo, coloque la segunda sutura en el lado craneal de la apófisis xifoides y átela alrededor del tubo del cable positivo.
- Cierre todas las incisiones con una aguja de sutura (13 mm) con una longitud de sutura de 20 cm (Figura 1E,F).
- Después de la implantación, coloque el ratón en una jaula limpia y coloque la jaula en la tBase, que actúa como receptor para la telemetría del ratón (Figura 1G). Encienda la computadora grabable y use la aplicación de software de análisis de datos instalada para recopilar datos de ECG. Compruebe que los datos del ECG muestren formas de onda normales (Figura 2A,B).
NOTA: En caso de formas de onda anormales o ruido (como se muestra en la Figura 2C), vuelva a conectar los cables negativo y positivo bajo anestesia. - Durante el período de recuperación de dos días, asegúrese de que el ratón reciba el tratamiento adecuado colocando gel de agua y comida en el fondo de la jaula. Registre solo el comportamiento de la jaula de inicio con una grabadora de unidad durante este período de recuperación.
3. Registro de los electrocardiogramas y del comportamiento en la jaula doméstica desde el embarazo hasta el destete
- Encienda las luces rojas durante la fase oscura porque la grabadora de la unidad no puede funcionar sin luz. Coloque la grabadora de unidad junto a la jaula de inicio para registrar el comportamiento. Registre el ECG utilizando la aplicación LabChart en la PC grabable. Antes de recopilar los datos de ECG, verifique la frecuencia de muestreo de ECG en LabChart.
NOTA: En este protocolo, se eligió la grabadora de unidad porque se puede colocar en cualquier lugar. Además, en comparación con una cámara de vídeo, las grabadoras de unidad pueden grabar en un gran angular y utilizar menos capacidad de almacenamiento de datos (por ejemplo, grabar 24 horas con una grabadora de unidad utiliza unos 70 GB). En esta demostración, la frecuencia de muestreo de ECG en el software de análisis de datos se establece en 1 k/s. - Después de encender la grabadora de la unidad, inicie LabChart en la computadora para registrar el comportamiento y el ECG.
NOTA: En esta demostración, se utilizó una macro para registrar continuamente el ECG y guardar automáticamente los archivos cada 2 h. Este proceso repetitivo se ejecutó durante todo el experimento. Además, se seleccionó una tarjeta SD de 256 GB para fines de grabación, lo que permite aproximadamente 24 horas de recopilación de datos por día. - Revise el mouse en busca de parto y anomalías corporales y muestree los datos de la grabadora de la unidad y la computadora grabable. El día en que la rata dio a luz a sus crías se considera como el día postnatal (DP) 0. Mida el peso de las crías todos los días después del nacimiento.
NOTA: En este estudio, se recopiló el video de grabación de la grabadora de la unidad y el archivo de datos de ECG de la PC grabable todas las mañanas de 7:30 a 8:30. Además, para evitar el ruido del ECG de las vibraciones causadas por múltiples crías tocando a la madre, la camada se sacrificó a cuatro crías (la mitad de ellas eran machos y la otra mitad eran hembras). - Después de revisar el mouse y recopilar los datos, devuelva todo a su posición original. Encienda la grabadora de la unidad y la computadora grabable. Inicie la aplicación LabChart.
NOTA: Si se utiliza una macro para registrar el ECG, haga clic en el botón de macro e inicialice la macro seleccionando el botón de ejecución de la opción de administración . - Una vez a la semana, reemplace la jaula por una nueva. Durante este proceso, incluya la ropa de cama, la mitad de la cual se usó anteriormente y la otra mitad es nueva.
NOTA: Este proceso, que incluyó el muestreo de datos y los controles con ratones, se repitió desde el día 17 hasta el día postnatal (DP) 21.
4. Análisis de los ECG
- Para analizar los datos de ECG, utilice el software de análisis de datos. Inicie LabChart y abra el archivo de datos para el período de registro. Para analizar la variabilidad de la frecuencia cardíaca (VFC), haga clic en el botón VFC y ajuste la configuración de detección de latidos.
NOTA: En esta demostración, seleccione la configuración personalizada y cambie la altura mínima del pico a 1,2 para el ajuste de la detección. - Después de ajustar la configuración, revise todos los tiempos y elimine cualquier dato de ruido (como se muestra en la Figura 2C).
NOTA: Si no se detecta una onda R, agréguela o modifíquela usando el botón HRV . - Haga clic en el botón HRV y seleccione la vista del clasificador de ritmos. Elija todos los tiempos en la vista del clasificador de tiempos y, a continuación, seleccione la vista del informe en el botón HRV . Copie los datos de la vista del informe y péguelos en Excel.
NOTA: Los resultados de la VFC, como se muestra en la Tabla 1, muestran los dominios de tiempo y espectro a través del software de análisis de datos, lo que permite la observación.
5. Categorización del etograma del comportamiento en jaulas caseras
- Revise todos los videos grabados para verificar si hay anomalías, como que la luz roja no se encienda durante la fase oscura y que la grabadora de la unidad no funcione.
NOTA: El video se graba de la misma manera que los ECG, con clips de video capturados cada 2 h. - Clasifique el etograma en función de parámetros como la postura de la madre durante el comportamiento, el tiempo dedicado al comportamiento y la ubicación donde ocurrió el comportamiento (Tabla 2) y, a continuación, observe el video de la grabadora de la unidad.
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Resultados
Después de implantar el telémetro en la rata preñada, registramos los electrocardiogramas desde el embarazo hasta la lactancia en una jaula casera. La frecuencia de muestreo se estableció en 1 k/s. Para comparar el ECG de cada estado fisiológico de la madre rata evitando la influencia del ritmo circadiano, se analizaron los datos de 10 min de 23:32 a 23:42 en GD 17, parto, PD 0 y PD 21 del archivo de datos de 2 h (Figura 3, Tabla 1). Se eligió el tiempo comprendido entre las...
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Discusión
En este método, en el que el telémetro se implantó en ratones preñados, el ECG pudo ser rastreado continuamente en el mismo ratón desde el embarazo hasta la lactancia. El ratón exhibió etogramas que incluían movimiento, indicando vigilia durante todos los períodos de análisis (23:32-23:42) desde GD 17 hasta PD 21. Además, los resultados presentados mostraron que la frecuencia cardíaca disminuyó gradualmente desde el embarazo hasta la lactancia. Se considera que esta disminución se debe a...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio contó con el apoyo de JSPS KAKENHI (números de subvención JP 21H04981 y 30974521) y el Centro para la Diversidad, la Equidad y la Inclusión de la Universidad de Azabu.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| temporizador de repetición de 24 horas | Panasonic | WH3311BP | |
| 5-0 Sutura de nylon | Natsume Seisakusho | Co-23s-N2 | |
| Caja de anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1010 | W110× D110&veces; Máscara de anestesia H110mm |
| Natsume Seisakusho Co | KN-1019-1 | ||
| Máquina de anestesia | Natsume Seisakusho Co | KN-1071-E | |
| C57BL6 / J ratones | Clea Japan, Inc | Ratón de embarazo a los 14 días | |
| Clip light | Yazawa Corporation | CLX60X02WH | |
| Configurator System | Adinstuments | TR190 | |
| grabadora de accionamiento | Transcend | TS-DP250A-32G | |
| Soporte para alimentos | Clea Japan, Inc | CL-2802 | |
| Isoflurano | FujiFilM | 099-06571 | |
| LabChart Pro V8 | Adinstuments | MLU260/8 | |
| LabChart8 | Adinstuments | MLS060/8 | |
| Mouse Biopotential Telemeter | Adinstuments | MT10B | |
| Aguja 18 G 1 1/2 | Terumo | NN-1838R | |
| Calentador de panel | SANKO | 4976285145407 | |
| PowerLab 4/26 | Adinstuments | PL2604 | |
| Computadora grabable | Ratón mouse de computadora | K7-H | |
| bombilla de luz roja | ELPA | LDG1R-G-GWP254 | |
| Máscara de goma | Natsume Seisakusho Co | Tarjeta SD KN-1019-M | |
| (256GB) | Transcend | TS256GUSD350V | Puede grabar aproximadamente 24 h |
| Aguja de sutura 13 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0 | |
| Aguja de sutura 7 mm | Natsume Seisakusho Co | C-24-540-NO.0000 | |
| tBase | Adinstuments | MT110 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
