Modelos de heridas en ratones y preparación de suspensiones de células únicas

Resumen

Este estudio presenta dos técnicas experimentales cruciales: la construcción de un modelo de herida murina para evaluar el cierre de la herida y la preparación de suspensiones unicelulares de piel murina para preservar la viabilidad celular.

Resumen

El tratamiento de las lesiones cutáneas agudas de espesor total presenta un desafío considerable en la práctica clínica. La complejidad de la cicatrización de heridas, que involucra diversas poblaciones celulares y el intrincado microambiente de la herida, complica la evaluación de los efectos del tratamiento y sus interacciones utilizando enfoques experimentales tradicionales. La tecnología de secuenciación del transcriptoma de una sola célula ha revolucionado la comprensión de las funciones y mecanismos celulares durante la cicatrización de heridas. Sin embargo, la variabilidad en las metodologías para crear modelos de heridas de ratón introduce factores de confusión que pueden afectar los resultados experimentales. Además, el proceso de disociación de los tejidos de la piel de ratón presenta importantes obstáculos técnicos, lo que pone de manifiesto la necesidad crítica de suspensiones unicelulares de alta calidad para una secuenciación precisa del transcriptoma. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo optimizar la construcción de modelos de heridas en ratones para evaluar con precisión los cambios en el cierre de la herida y eliminar las variables que podrían influir en el resultado de la secuenciación posterior. Además, la preparación de suspensiones unicelulares se realizó utilizando protocolos de preparación de enzimas y protocolos de kits de prueba para optimizar el costo y la efectividad.

Introducción

El ratón es un modelo animal ampliamente reconocido en investigación por su secuencia genética altamente homóloga a la de los humanos, su rápida reproducción, su rentabilidad y su tamaño manejable¹. Sin embargo, existen diferencias en la estructura de la piel entre ratones y humanos. Los ratones tienen una capa de membrana cutánea distinta que contribuye a la contracción de la piel, desempeñando un papel crucial en la cicatrización de heridas en esta especie. Por el contrario, la cicatrización de heridas humanas implica principalmente la reepitelización y la formación de tejido de granulación¹.

A pesar de estas diferencias entre especies en la estructura de la piel, el modelo de ratón sigue siendo la opción preferida en la investigación de reparación de heridas y conserva una importancia significativa en comparación con otros modelos animales^2,3. Cuando se utiliza piel de ratón para imitar los procesos de cicatrización de heridas humanas, es esencial tener en cuenta cuidadosamente los diversos factores que influyen. Estos factores incluyen la selección de sitios apropiados para procedimientos quirúrgicos, la contabilidad del ciclo del folículo piloso del ratón y la comprensión de los efectos de la contracción de la membrana cutánea^4,5. La implementación de las medidas correspondientes es vital para optimizar las condiciones experimentales y mejorar la precisión de los resultados observacionales.

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) secuencia las células a un nivel mucho más refinado que la secuenciación de ARN convencional y tiene un requisito mucho mayor de calidad de muestra con diferencias intragrupo mínimas. Se llevaron a cabo múltiples experimentos para refinar un modelo estable de defecto cutáneo agudo de espesor completo. Estos experimentos utilizaron una combinación de métodos establecidos de la literatura y enfoques innovadores para evaluar la cicatrización de heridas de manera integral^2,5. Para desarrollar el modelo de cicatrización de heridas, se utilizó la escisión de piel de espesor completo en ratones para replicar el proceso fisiológico de reparación y regeneración de heridas. Su objetivo fue evaluar las posibles alteraciones inducidas por diversos tratamientos que utilizan scRNA-seq. La disociación del tejido cutáneo de ratones plantea desafíos, incluyendo baja viabilidad celular y altas tasas de agregación, durante la preparación de suspensiones unicelulares⁶. Estas dificultades pueden dar lugar a problemas como la obstrucción de los instrumentos y la captura de células anómalas, lo que puede comprometer la calidad de los datos. Dado el considerable costo de la secuenciación de una sola célula, la realización de múltiples experimentos preliminares es crucial para garantizar la estabilidad y confiabilidad de la suspensión de una sola célula. Este estudio evaluó la eficacia de la disociación enzimática mixta y el método de disociación del kit de tejido para identificar el enfoque óptimo para la disociación de tejidos^6,7. Este estudio establece una base sólida para investigaciones más profundas.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética del séptimo Centro Médico del Hospital General PLA de China, China. Se utilizaron ratones machos C57/BL6 de 6 semanas de edad.

1. Modelo de cicatrización de heridas de ratón

1. Agrupamiento de animales
   1. Asigne aleatoriamente ratones a grupos experimentales y de control (6 cada uno). Ratones domésticos en una instalación de animales libres de patógenos específicos (SPF), con una temperatura mantenida a 23-25 °C, humedad al 50%-60% y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h.
   2. Proporcione a los ratones acceso sin restricciones a alimentos estándar y agua del grifo esterilizada en autoclave.
2. Preparación preoperatoria
   1. Sujete suavemente el ratón con un sujetador o sujetándolo de forma segura en posición prona. Cargue la jeringa con pentobarbital sódico al 1% restaurado a temperatura ambiente, administrado a una dosis de 0,1 mL/20 g de peso corporal.
      NOTA: La solución de pentobarbital sódico al 1% debe almacenarse en un ambiente oscuro a 4 °C.
   2. Limpie el abdomen del ratón con hisopos de algodón con alcohol. Inserte la jeringa en un ligero ángulo dentro del abdomen. Aspire antes de la inyección para evitar la administración inadvertida en la vejiga o los intestinos. Espere 10 min.
   3. Después de que el ratón deje de temblar y ya no responda a los estímulos, aplique vaselina blanca en ambos ojos para evitar la sequedad. Usa una afeitadora para recortar el pelaje dorsal más largo.
   4. Aplique la crema depilatoria en la espalda, espere 2 minutos y limpie suavemente con una gasa húmeda para evitar dañar la piel del ratón. Asegúrese de que la crema depilatoria no se deje actuar durante un período prolongado.
   5. Desinfecte suavemente la piel circundante con tres hisopos alternos de betadine y alcohol al 70%.
   6. Punzón de biopsia de piel en autoclave, tijeras, fórceps y otros instrumentos para la esterilización. Mantenga un espacio de trabajo estéril. Realizar la cirugía posterior con un paño quirúrgico nuevo.
3. Escisión cutánea de espesor completo
   NOTA: Se utilizó el modelo de férula para heridas para evaluar la efectividad del tratamiento para la cicatrización de heridas.
   1. Con un rotulador permanente, marque la zona central superior de la región dorsal del ratón con un círculo de 8 mm de diámetro.
   2. Levante la piel dorsal con pinzas limpias y haga el primer corte con unas tijeras quirúrgicas finas. Después del primer corte, sostenga el área de la piel parcialmente eliminada con pinzas y corte con cuidado los círculos marcados.
   3. Utilice un anillo de acero inoxidable diseñado a medida (diámetro interno 15 mm, diámetro externo 18 mm). Sutura el anillo metálico a la periferia del sitio de la incisión con suturas no absorbibles 5-0, evitando la contracción de la piel del sitio de la incisión (Figura 1A). Utilice acero inoxidable como material del anillo para evitar la oxidación y la deformación.
   4. Administrar una única inyección subcutánea de 0,1 mL de dilución de clorhidrato de buprenorfina al 10% cerca de la herida para tratar el dolor postquirúrgico.
   5. Vuelva a introducir el ratón para limpiar jaulas individuales. Coloque el ratón en posición prona. No deje al ratón desatendido antes de que recupere la conciencia.
   6. Observe y fotografíe la herida del ratón cada 2 días para medir el tamaño de la herida después de la anestesia como se describe en el paso 1.2.
4. Marcado de sellos de heridas para obtener tejido de biopsia
   1. Prepárese para el experimento como se describe en los pasos 1.1 y 1.2.
   2. Cree sellos de marcado personalizados para heridas de ratón con un diámetro de círculo de 8 mm y una longitud de lado cuadrado de 10 mm (Figura 1B).
   3. Coloque al ratón en una postura prona y desinfecte la piel dorsal con hisopos de algodón con alcohol. Sumerge el sello en tinta. Haz una marca en la parte media-superior de la parte posterior del ratón con el sello.
   4. Extirpe con cuidado toda la capa de piel de la espalda a lo largo de la marca circular con unas tijeras quirúrgicas, exponiendo la capa muscular por completo. Deje la herida abierta sin apósito para evitar interferir con el estado de la herida. Mantenga la esterilidad de la herida colocando al ratón en un entorno limpio y desinfectado y permitiendo que la herida forme una costra de forma natural.
   5. Administrar una única inyección subcutánea de 0,1 mL de dilución de clorhidrato de buprenorfina al 10% cerca de la herida para tratar el dolor postquirúrgico.
   6. Vuelva a introducir el ratón para limpiar jaulas individuales. Coloque el ratón en posición prona. No deje al ratón desatendido antes de que recupere la conciencia.
   7. Observe y fotografíe la herida del ratón cada 2 días para medir el tamaño de la herida después de la anestesia como se describe en el paso 1.2.
   8. Realizar la administración del tratamiento como se describe en 1.4
5. Administración del tratamiento
   1. A las 4 h después de que el ratón recupere la conciencia, realice la anestesia como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.3.
   2. Inyecte por vía subcutánea el tratamiento deseado, en este caso 100 μg de exosoma derivado de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (hucMSC-Exo) disuelto en 200 μL de PBS alrededor del sitio de la incisión para el grupo de tratamiento.
   3. Inyecte por vía subcutánea 200 μL de PBS alrededor del sitio de la incisión para el grupo de control.
   4. Repita los pasos 1.5.2 y 1.5.3 cada dos días durante un máximo de 14 días. Inspeccione el sitio de la inyección en busca de hinchazón, enrojecimiento o signos de infección.

2. Preparación para la secuenciación de ARN unicelular

1. Recolección y preparación de tejidos
   1. Realice la anestesia como se describe en los pasos 1.2.2-1.2.3.
   2. Levante la piel dorsal con pinzas limpias y retire las costras. Corta aproximadamente 2^cm2 de piel cerca de la herida, recortando el tejido adiposo y los vasos sanguíneos grandes.
   3. Transfiera la biopsia de piel con pinzas estériles a un pocillo de una placa de 6 pocillos llena de 4 mL de PBS preenfriados.
   4. Lavar con PBS transfiriendo secuencialmente la biopsia a nuevos pocillos (placa de 6 pocillos) llenos de 4 mL de PBS hasta que no haya sangre visible.
   5. Cortar la piel con un bisturí en trozos de aproximadamente 2 mm, lavándola posteriormente con DPBS que contenga un 0,04% de BSA y eliminando cualquier residuo.
2. Disociación enzimática (Figura 2)
   1. Combine 1 mL de colagenasa I (10 mg/mL), 1 mL de colagenasa IV (5 mg/mL), 1 mL de colagenasa D + Dispasa II (15 mg/mL), 1 mL de DNasa I (5 mg/mL) y 6 mL de DPBS en un tubo cónico estéril para preparar la solución de digestión. Mezcle bien los componentes para garantizar la homogeneidad.
   2. Coloque el tubo cónico en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos para precalentar la solución de digestión.
   3. Añadir 2,5 mL de solución de digestión al tejido y digerir a 37 °C durante 70 min, volteando el tubo de ensayo cada 10 min para una mezcla completa.
   4. Humedecer previamente un colador de 70 μm con tampón de lavado (0,2% BSA en PBS). Transfiera la mezcla de reacción, incluidas las células disociadas y los fragmentos de tejido residual, utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho de 1 mL en el colador.
   5. Filtre esta mezcla a través del filtro de celdas prehumedecido de 70 μm en un tubo de centrífuga de 15 mL.
   6. Centrifugar la mezcla de reacción con tejido digerido a 300 x g, temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet (células) para el siguiente paso de disociación.
3. Lisis de glóbulos rojos
   1. Diluir la solución de lisis de glóbulos rojos (10x) en una proporción de 1:10 con agua bidestilada. Diluir las células con 1x solución de lisis de glóbulos rojos en una proporción de 1:10 en un tubo cónico.
   2. Agitar la mezcla durante 5 s, incubar a temperatura ambiente durante 2 min y luego centrifugar a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en DPBS de igual volumen y almacenarlas en hielo.
4. filtración
   1. Recupere la suspensión celular y fíltrela a través de un filtro de 40 μm en un nuevo tubo cónico.
   2. Enjuague el tubo 2 veces con 4,5 mL de RPMI (10% FCS) para asegurar la recolección de las células restantes.
   3. Proceda a centrifugar la suspensión de la célula a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
   4. Deseche el sobrenadante, agite suavemente el pellet y vuelva a suspender las células con puntas de diámetro ancho en 50 μL de 0,04% BSA PBS. Mantenga las células en hielo durante todo este proceso.
5. Eliminación de células muertas
   1. Mezcle el kit de eliminación de células muertas 20x tampón de stock con agua sin nucleasas en una proporción de 1:20 para obtener un tampón de unión 1x.
   2. Centrifugar la muestra a 300 x g, eliminar el sobrenadante y añadir 10 μL de microperlas de eliminación de células muertas para obtener 60 mg de muestra de piel.
   3. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Añada el tampón de stock hasta que alcance los 500 μL. Cargue la muestra en la columna preparada del kit y conéctela al disociador.
   4. Ejecute el programa disociador para separar las células vivas. Una vez finalizado el programa, filtre la suspensión a través de un filtro de 30 μm y dilúyala con un volumen igual de D-PBS.
      NOTA: Si la velocidad de goteo disminuye notablemente, reemplace rápidamente la columna para evitar que las impurezas bloqueen los poros y afecten la recuperación celular.
   5. Realice la tinción y el recuento de células con naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) mediante un contador de células automatizado. Utilice los siguientes criterios de aceptación: viabilidad celular ≥ 85%, tasa de agregación celular < 20% y ausencia de glóbulos rojos o fragmentos de células visibles.
6. Procedimiento de disociación para el kit de disociación multitejido (Alternativa)
   1. Mezcle 2,5 ml de RPMI 1640, 100 μl de enzima D, 50 μl de enzima R y 12,5 μl de enzima A1 en un tubo MACS C suave (componentes del kit de disociación de tejidos múltiples).
   2. Transfiera el tejido al tubo suave MACS C que contiene la mezcla de enzimas y ciérrelo herméticamente.
   3. Coloque el tubo a 37 °C en un baño de agua durante 90 minutos con una inversión suave cada 10 minutos para garantizar una exposición adecuada del tejido a la solución de disociación.
   4. Deseche la solución de disociación y lave los tejidos con DPBS.
   5. Pase secuencialmente suspensiones unicelulares a través de filtros celulares de 70 μm y 40 μm y centrifugar a 4 °C durante 10 min a 300 x g.
   6. Lisar los glóbulos rojos utilizando el reactivo de lisis de glóbulos rojos siguiendo el mismo procedimiento que el paso 2.3.
   7. Elimine las células muertas utilizando el kit de eliminación de células muertas siguiendo el mismo procedimiento que en el paso 2.5⁸.
   8. Realice la tinción AO/PI y el recuento de células mediante un contador de células automatizado. Utilice los siguientes criterios de aceptación: viabilidad celular ≥ 85%, tasa de agregación celular < 20% y ausencia de glóbulos rojos o fragmentos de células visibles.

Resultados

Se exploraron múltiples variaciones del procedimiento. Se prefirieron los protocolos de tipo "stamp" porque presentan una interferencia mínima en el proceso de cicatrización y mantienen la integridad de la herida frente a factores como el rascado o los puntos de sutura. Esto permite evitar la introducción de ruido a nivel de célula individual en el secuenciamiento posterior. Colocar heridas en ambos lados de un ratón dio lugar a diferencias notables en el área de la herida debido a la elasticidad inherente de la piel del...

Discusión

Varios pasos cruciales fueron esenciales para el éxito del protocolo. Estos pasos incluyeron una preparación precisa del área de la herida mediante un afeitado y limpieza a fondo, la creación de heridas estandarizadas de tamaño y profundidad específicos, y un cuidado diligente posterior a la herida para controlar las infecciones y administrar los tratamientos adecuados. La estandarización de estos procedimientos aseguró la consistencia en todas las condiciones experimentales, mejorando así la confiabilidad y reproducibil...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
75% Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
ratones C57/BL6J	Charles River Laboratories
Colagenasa D + Dispasa II	Roche	11088858001
Colagenasa I	Roche	5349907103
Colagenasa IV	Roche	5267439001
Hisopos de algodón	Haishi	MIANQIAN
Kit de eliminación de células muertas	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNasa I	Roche	10104159001
gentleMAC Disociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Hilo de nylon médico	Jinlong	HM507
Kit de disociación multitejido 1	punzón Miltenyi Biotec	130-110-201
aguja de biopsia	Integra Miltex
solución de lisis de glóbulos rojos	Miltenyi Biotec	130-094-183
tijera quirúrgica	Jinglu	JIANDAO
Vaselina blanca	Shangyuan	BAIFANSHILIN