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las solicitudes de microfluidos para el diagnóstico desechables

En esta entrevista, el Dr. Klapperich discute la fabricación de dispositivos de microfluídica termoplásticos y su aplicación para el desarrollo de nuevos diagnósticos.

Las solicitudes de microfluidos para el diagnóstico desechables

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Mi nombre es Catherine CloudBridge y soy profesora de fabricación, ingeniería e ingeniería biomédica en la Universidad de Boston. Y soy el director del Laboratorio de Micro Dispositivos Biomédicos y Microambientes. Trabajamos principalmente en la fabricación de diagnósticos desechables para aplicaciones en entornos con recursos limitados.Así que usamos la microfluídica para hacer esos dispositivos. En realidad, nos interesan dos campos de estudio. Principalmente, estamos interesados en observar cómo interactúan las biomoléculas y las células con las superficies de los polímeros plásticos.Ese es nuestro principal paraguas. Ese trabajo se materializa en aplicaciones microfluídicas para diagnósticos desechables. Así que en el laboratorio, lo que fabricamos son dispositivos microfluídicos.En los materiales termoplásticos que no utilizamos, normalmente utilizamos PDMS, que es el material gomoso que la mayoría de la gente utiliza para fabricar microfluídica en el laboratorio. Fabricamos nuestros dispositivos con termoplásticos. Estamos interesados en usar esos dispositivos termoplásticos para hacer biología molecular a microescala de tal manera que esa biología molecular se pueda hacer en el campo lejos de un laboratorio centralizado.La forma en que funciona en el laboratorio es que estamos haciendo pequeñas tarjetas de plástico y dentro de esas pequeñas tarjetas de plástico hay columnas de extracción en fase sólida o columnas de lisis celular o columnas de mezcla. También hacemos reacción en cadena de la polimerasa en el chip como técnica de detección. Todas estas cosas están integradas en un pequeño dispositivo que, eventualmente, en la perspectiva a largo plazo de la investigación, terminaría siendo un dispositivo integrado que podría sostenerse con la mano y llevarse al campo o en entornos donde un laboratorio a gran escala con todos los centros asistentes de fusiones e incubadoras de calentamiento, etc., no estaría disponible.Por lo tanto, nos gustaría poder comenzar idealmente con una muestra humana como sangre, orina, heces o un hisopo nasofaríngeo, por ejemplo, que sería moco. Y luego, en la salida del chip, tiene una respuesta que ya sea sí o no, alguien está infectado con un microorganismo en particular. Y la forma en que lo hacemos es buscando el ADN de ese microorganismo en particular o ARN, dependiendo del microorganismo de ese microorganismo en particular en la muestra del paciente.Por lo tanto, los desafíos técnicos que surgen se encuentran en gran medida en el lado de la preparación de muestras de esa ecuación. Por lo tanto, cuando se empieza con sangre, heces u orina, hay que pasar de una situación en la que se tiene una muestra humana desordenada con una gran cantidad de partículas potencialmente inhibidoras a la PCR u otras técnicas de amplificación. Y quieres terminar al final con una muestra muy limpia y eludida de ácidos nucleicos que luego puedes usar para amplificar o buscar un ADN o ARN en particular que te dirá si un microorganismo que estás buscando estaba allí.Entonces, para limpiar esas muestras, debe hacer algunas cosas. En primer lugar, hay que filtrar la muestra, lo que, dependiendo de la muestra, puede implicar una filtración de curso o un paso de centrifugado rápido antes de que la muestra pase al chip. Por lo tanto, siempre tratamos de comenzar con las muestras a medida que provienen del médico.Por lo tanto, con los hisopos de orina, heces y nasofaringe, nuestro objetivo es que el médico haga su trabajo como lo haría normalmente y tome la muestra como lo haría normalmente. Y luego tomamos esa muestra y la ponemos en las fichas. Entonces, si es necesario realizar más filtración en ese paso, esa filtración se produciría en el chip.El segundo paso implica, debido a que estamos haciendo ensayos moleculares, que tenemos que lisar las células y los microorganismos que están en esa muestra. Por lo tanto, realizamos un paso de lisis, que generalmente implica forzar la muestra a través de un filtro que tiene un tamaño de poro pequeño. A veces, ese filtro también tiene nanopartículas como los nanotubos de carbono, que tienen bordes afilados, que se pueden usar para desgarrar algunos de los organismos que tienen paredes celulares más robustas como C difficile, que es una bacteria grampositiva con la que trabajamos, que es muy difícil de lisar.Por lo tanto, tenemos que tener columnas de lisis más robustas. Pero, por lo general, estamos haciendo una lisis química y mecánica combinada dentro del chip. Después de eso, nuestro objetivo es tomar el lisado y luego extraer los ácidos nucleicos purificados.Así que pasamos la lisis, pasamos el lisado sobre una columna de extracción en fase sólida que es resonante en el chip microfluídico. Y esa columna de extracción en fase sólida está hecha de plástico y se fabrica utilizando química fotoiniciada dentro del canal microfluídico después de que ya está fabricada. Y también está impregnado con partículas de sílice porque queremos unirse y liberar ácidos nucleicos.En algunos casos, hemos incorporado perlas DT de oligonucleótidos si queremos unirnos y liberar ARNm específicamente, por ejemplo, o perlas que tienen anticuerpos particulares, si queremos unirnos y liberar proteínas particulares. Y podemos hacer columnas de extracción que hagan todas esas cosas. Pero hoy te mostraremos cómo hacer la columna de extracción de sase con las perlas de sílice.Entonces, después de haber hecho eso, pase el lisado sobre la columna de sílice, funciona como lo haría un kit de kyogen en el laboratorio a macro escala. Luego nos lavamos para deshacernos de todas las otras cosas que no queremos, todos los carbohidratos y los lípidos y otras cosas en el lisado celular y en el resto de la muestra humana que no queremos. Y luego, al final, estamos aludiendo con el agua.Y lo bueno de estas columnas de extracción en fase sólida a microescala es que podemos eluir con una cantidad muy pequeña de agua, generalmente del orden de uno a cinco microlitros. Y estamos recuperando casi todos los ácidos nucleicos que invertimos. Tenemos una tasa de eficiencia de alrededor del 70 al 90% y los primeros 10 microlitros que obtenemos de ese canal.Entonces, si lavamos dos veces con dos a 10 microlitros, recuperamos casi todos los ácidos nucleicos que ponemos allí. Por lo tanto, no solo es una muestra limpia que puede PCR, sino que también es una muestra mucho más concentrada de lo que podría obtener con un kit de sobremesa estándar. Por lo tanto, el objetivo final de todas estas técnicas de preparación de muestras es hacer cosas que sean compatibles con algunos de los otros trabajos que la gente ha realizado.Muy buen trabajo en el campo que demuestra que se puede hacer amplificación por PCR en un chip. Puedes hacer la reacción de transcriptasa inversa en un chip si estás tratando con un virus de ARN o si quieres hacer un experimento de expresión génica. Nuestras técnicas de preparación de muestras se pueden acoplar directamente con la PCR en un chip, por lo que no tendría que hacer nada de esa limpieza y preparación de muestras en el banco.Y también el paso de concentración que tendría que hacer para obtener los pequeños volúmenes necesarios para hacer PCR multiplexada en un chip pequeño. Así que los experimentos que les mostraremos hoy muestran cómo ensamblamos el chip microfluídico, que está hecho de termoplástico y no de PDMS. Por lo tanto, requiere un proceso de fabricación un poco diferente al que se usa normalmente, cómo se sellan esos chips.Y luego cómo hacemos la química iniciada por la luz dentro del chip para hacer los monolitos de polímero que se utilizan tanto para la lisis celular como para la extracción en fase sólida. Y al final de ese proceso, que ahora mismo son procesos modulares en el laboratorio, pero que se pueden integrar y se han integrado, te dan al final una muestra altamente concentrada de ácidos nucleicos, ARN y ADN en agua, que luego puede ir aguas abajo a un módulo de PCR u otro módulo de amplificación donde se puede producir la identificación de un microorganismo o una infección. Así que en realidad tenemos una subvención en la que estamos trabajando en este momento donde estamos comenzando a recolectar muestras humanas del Centro Médico de Boston de pacientes que pueden o no estar infectados con influenza A.So ya que es temporada de gripe, esas son las muestras que estamos recolectando.Y luego, en el laboratorio, estamos haciendo los ensayos de referencia para ver si alguien está infectado o no con influenza A, que es básicamente un ensayo de cultivo, que tarda varios días en realizarse. Y junto con eso, estamos poniendo estas muestras a través de nuestros, ahora mismo, los módulos de nuestro chip. Así que los pasamos por la columna de lisis, los pasamos por la columna de extracción en fase sólida y luego realizamos la PCR para ver qué tan bien lo hacemos en comparación con los métodos estándar de oro.Así que esa es la etapa en la que estamos ahora. Si esos experimentos dan resultado, creo que en los próximos cuatro a seis años tal vez estemos en una situación en la que tengamos un chip integrado y un ensayo completo para la influenza A y también estemos trabajando en muestras de clostridium difficile y heces. Y también estamos muy cerca de tener no solo el dispositivo integrado, sino también el ensayo integrado.Por lo tanto, tanto el desarrollo del ensayo como el diseño del chip deben ir de la mano. Entonces, para una aplicación en particular, llegar a la cabecera del paciente, es realmente un proceso orientado a objetivos. Tienes que conocer, ya sabes, la muestra con la que estás empezando y el microorganismo que estás buscando para optimizar el chip para su uso en la cabecera del paciente.Así que no creo que estemos tan lejos de hacer que eso suceda de una manera prototipo. Esos son nuestros objetivos finales, así que espero que lo consigamos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

Boston University.  En esta entrevista, el Dr. Klapperich discute la fabricación de dispositivos de microfluídica termoplásticos y su aplicación para el desarrollo de nuevos diagnósticos.

Las solicitudes de microfluidos para el diagnóstico desechables

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