Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.
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Artículo de método
Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP
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Resumen
Resumen
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) representan las lesiones de ADN más peligrosas, capaces de inducir una pérdida sustancial de información genética y la muerte celular. En respuesta, las células emplean dos mecanismos principales para la reparación de DSB: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Cuantificar la eficiencia de la NHEJ y la HR por separado es crucial para explorar los mecanismos y factores relevantes asociados con cada uno. El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos establecidos que se utilizan para medir la eficiencia de sus respectivas vías de reparación. Estos métodos se basan en plásmidos meticulosamente diseñados que contienen un gen de proteína verde fluorescente (GFP) interrumpido con sitios de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI, que induce DSB. Aquí, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y el ensayo HR, que implican la co-transfección de células HEK-293T con plásmidos EJ5-GFP/DR-GFP, un plásmido que expresa I-SceI y un plásmido que expresa mCherry. Los resultados cuantitativos de la eficiencia de NHEJ y HR se obtienen calculando la proporción de células positivas para GFP y células mCherry positivas, según se cuentan mediante citometría de flujo. A diferencia de los ensayos cromosómicamente integrados, estos ensayos extracromosómicos son más adecuados para realizar investigaciones comparativas que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.
Introducción
Una rotura de doble cadena de ADN (DSB) es la forma más deletérea de daño en el ADN, que puede provocar inestabilidad del genoma, reordenamientos cromosómicos, senescencia celular y muerte celular si no se reparacon prontitud. Dos vías bien establecidas, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), son reconocidas por su eficacia en el tratamiento de los DSB de ADN 2,3. HR se considera un mecanismo libre de errores para la reparación de DSB, utilizando secuencias homólogas en la cromátida hermana como plantilla para restaurar la configuración original de la molécula de ADN dañada3. NHEJ, por otro lado, es una vía de reparación de DSB propensa a errores que se une a los extremos rotos del ADN sin depender de ninguna plantilla2.
El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos clásicos desarrollados originalmente en el laboratorio de Jasin en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center y utilizados para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR, respectivamente 4,5,6,7. Estos ensayos juegan un papel crucial en la investigación de los mecanismos y factores relevantes asociados con NHEJ y HR 8,9,10,11,12,13,14. Ambos ensayos se basan en la implementación de dos reporteros de GFP interrumpidos, EJ5-GFP y DR-GFP, para monitorear la reparación de DSB inducidos por la endonucleasa I-SceI. El reportero EJ5-GFP se emplea en el ensayo NHEJ, mientras que el reportero DR-GFP se utiliza en el ensayo HR. Cada reportero está sutilmente diseñado para que los DSB inducidos por I-SceI solo puedan ser reparados por una vía de reparación específica para restaurar un casete de expresión GFP 4,5.
El ensayo NHEJ y el ensayo de FC se pueden realizar utilizando un abordaje cromosómicamente integrado o extracromosómico15,16. El enfoque cromosómicamente integrado requiere la integración de los reporteros de GFP alterados en el genoma, lo que permite el análisis de la reparación de DSB dentro de un contexto cromosómico 6,15. Sin embargo, este enfoque requiere un paso celular prolongado y no es adecuado para estudios comparativos que involucren múltiples líneas celulares debido a la integración cromosómica arbitraria, lo que introduce un factor de confusión adicional aparte de las diferencias inherentes. En este protocolo, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y los ensayos HR, que implican la transfección transitoria de los plásmidos GFP e I-SceI interrumpidos en células HEK-293T, seguida de un análisis de citometría de flujo (el flujo de trabajo del experimento se muestra en la Figura 1). Estos ensayos reporteros no integrados fueron reportados originalmente por el laboratorio de Jasin para estudiar la reparación de los enlaces cruzados entre hebras de ADN16 y han sido empleados para evaluar la eficiencia de NHEJ y la eficiencia de HR por varios laboratorios 9,10,11,12,13,14,17,18,19, incluido el nuestro 11. Estos enfoques extracromosómicos facilitan el análisis de la reparación de DSB en estudios comparativos que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.
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Protocolo
1. Aislamiento de plásmidos
- Transformar E. coli competente con los plásmidos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plásmido que expresa I-Sce I) y PCI2-HA-mCherry (plásmido que expresa mCherry) (ver Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo de transformación estándar20.
NOTA: PCI2-HA-mCherry puede ser sustituido por otros plásmidos que expresen mCherry o DsRed. - Cultivar la E. coli transformada en 500 mL de medio LB líquido suplementado con 100 μg/mL de ampicilina durante la noche a 37 °C con agitación.
- Aísle los plásmidos utilizando un kit de aislamiento maxi de plásmido libre de endotoxinas disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Cuantifique las concentraciones de plásmidos utilizando espectrofotómetros de microvolumen de nanogotas. Ajuste la concentración de plásmido a 1 μg/μL.
2. Preparación y transfección celular
- Cultivo de células HEK-293T en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%. Asegúrese de que las células HEK-293T o las células estables HEK-293T establecidas estén en buen estado de crecimiento.
NOTA: Las células congeladas deben someterse al menos a dos rondas de división antes de la transfección. - El día anterior a la transfección, siembre las células HEK-293T en una placa de 6 pocillos a 2 × 105 células/pocillo para lograr alrededor del 60% de confluencia al día siguiente.
- El día de la transfección, confirme la confluencia celular, con el objetivo de aproximadamente el 60%. Para el ensayo NHEJ, transfecte las células de la muestra experimental en una placa de 6 pocillos con 1 μg de EJ5-GFP, 1 μg de pCBASceI y 1 μg de plásmidos PCI2-HA-mCherry, utilizando un reactivo de transfección comercial siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para el ensayo HR, sustituya el plásmido EJ5-GFP por el plásmido DR-GFP.
- Para los controles de calibración FACS, deje un pocillo de células sin transfectar como control negativo. Transfecte las células en una placa de 6 pocillos con (1) 1 μg de EJ5-GFP (para el ensayo NHEJ) o 1 μg de DR-GFP (para el ensayo HR), junto con 1 μg de pCBASceI como control de GFP de un solo color, o (2) 1 μg de PCI2-HA-mCherry como control de un solo color mCherry.
3. Análisis de las células GFP positivas y mCherry positivas mediante citometría de flujo
- Dos días después de la transfección, confirmar la expresión de las proteínas GFP y mCherry utilizando un microscopio fluorescente.
- Tres días después de la transfección, retire el medio de los pocillos, lávese una vez con PBS y agregue 500 μL de tripsina a cada pocillo. Incubar durante 5 min a 37 °C para separar todas las células de la placa. A lo largo de este y los pasos siguientes, proteja las células de la luz directa.
- Agregue 500 μL de medios DMEM completos a cada pocillo, vuelva a suspender las células, asegurándose de que no se vean grumos.
- Transfiera todas las celdas de cada pocillo a tubos de centrífuga de 1,5 ml, luego centrifugue las celdas durante 2 minutos a 1000 × g a temperatura ambiente.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo y lávese una vez con 1,0 mL de PBS.
- Nuevamente, retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo, vuelva a suspender las células en 500 μL de PBS y transfiera las células a tubos FACS (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Para obtener resultados óptimos, comience el análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la recolección de células. Alternativamente, las células se pueden almacenar en hielo durante varias horas. - Calibre el FACS con células no transfectadas (control negativo), células transfectadas con EJ5-GFP/DR-GPP y pCBASceI (control de un solo color GFP) y células transfectadas con mCherry (control de un solo color mCherry). Ajuste el voltaje y la compensación para minimizar el desbordamiento de fluorescencia entre GFP y mCherry.
- Adquirir y registrar al menos 10.000 células intactas de cada tubo.
4. Análisis de datos
NOTA: Los siguientes pasos se realizan utilizando el software FlowJo (consulte la Tabla de materiales) para analizar los datos FACS. Se pueden ejecutar procedimientos comparables en software de análisis alternativo.
- Arrastre todos los archivos FACS al panel de control. Haga doble clic en uno de los archivos para mostrar el gráfico FSC/SSC.
- Cree una puerta de polígono para seleccionar celdas intactas, excluyendo los residuos en la esquina inferior izquierda. Asigne a esta subpoblación el nombre "Células intactas" y arrastre esta puerta a la barra "Todas las muestras". Desplácese por cada muestra con el botón Siguiente muestra para asegurarse de que la compuerta sea adecuada para cada muestra (Figura 2A).
- Haga doble clic en la subpoblación de células intactas de la muestra de control negativa (células no transfectadas) para que aparezca una nueva gráfica. Cambie los ejes a FL1-H (eje x, GFP) y FL2-H (eje y, mCherry).
- Seleccione la herramienta Quad Gating y haga clic en el extremo superior derecho de la población de celdas negativas (Figura 2B). Arrastre las cuatro puertas rectangulares a la barra "Celdas intactas". Desplácese por las muestras de control de un solo color de GFP o control de un solo color mCherry utilizando el botón Siguiente muestra para garantizar la compuerta adecuada para distinguir las celdas de control positivas para GFP o positivas para mCherry de las negativas (Figura 2C, D). Ajuste la compuerta de cuadrante si es necesario y aplique esta compuerta a todas las poblaciones de "Células Intactas".
- Haga clic en el editor de diseño. Haga clic con el botón derecho del ratón en los trazados representativos y elija Copiar al editor de diseño. Seleccione todos los gráficos representativos y, a continuación, haga doble clic para abrir Definición de gráfico. Ajuste la etiqueta, la anotación y la leyenda del eje como desee.
- El porcentaje de células mCherry positivas en las muestras experimentales sirve como control de la eficiencia de la transfección. Calcule la eficiencia relativa de la reparación del ADN comparando el número de células positivas para GFP con el número de células positivas para mCherry en la misma parcela.
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Resultados
Para garantizar la precisión de los análisis de NHEJ y RRHH, es necesaria la implementación de una estrategia adecuada de ajuste de compensación y compuertas. Normalmente, la fluorescencia mCherry no se manifiesta en el detector GFP cuando se utiliza un filtro de 530 nm. Sin embargo, en casos de células que exhiben una expresión de GFP extremadamente alta, la fluorescencia de GFP puede contaminar el detector mCherry cuando se usa un filtro de 575 nm. Para abordar estas preocupaciones, se utilizaron muestras de control ne...
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Discusión
El método aquí descrito ha sido empleado en varios trabajos para evaluar la eficiencia de la NHEJ y la eficiencia de la HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método es pertinente para dil...
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Heilongjiang de China (YQ2022C036) y la Fundación de Innovación para Graduados de la Universidad Médica de Qiqihar (QYYCX2022-06). Figura 1 producida con MedPeer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Platos de 6 cm | BBI | F611202-9001 | |
| placas de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Ampicilina | Beyotime | ST007 | Concentración de trabajo: 100 μ g/mL |
| DH5 y alfa; Células competentes | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| EndoFree Maxi Plasmidio kit | TIANGEN | DP117 | se puede utilizar el kit de extracción de plásmidos alternativo sin endotoxinas |
| tubos FACS | FALCON | 352054 | |
| Suero fetal bovino | CLARK | FB25015 | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
| FlowJo V.10.1 | puede utilizar el software de análisis alternativo | Treestar | |
| Células HEK-293T | Infraestructura Nacional de Recurso de Líneas Celulares | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | Se pueden utilizar regentes de transfección alternativos |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI expresando plásmido |
| PCI2-HA-mCherry | se pueden utilizar plásmidos alternativos que contienen DsRed | ||
| Tripsina | Gibco | 25200-056 |
Referencias
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
- Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
- Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
- Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
- Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
- Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
- Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
- Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
- Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
- Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
- Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
- Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
- Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
- Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
- Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
- Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).
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