Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP

Resumen

Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.

Resumen

Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) representan las lesiones de ADN más peligrosas, capaces de inducir una pérdida sustancial de información genética y la muerte celular. En respuesta, las células emplean dos mecanismos principales para la reparación de DSB: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Cuantificar la eficiencia de la NHEJ y la HR por separado es crucial para explorar los mecanismos y factores relevantes asociados con cada uno. El ensayo NHEJ y el ensayo HR son métodos establecidos que se utilizan para medir la eficiencia de sus respectivas vías de reparación. Estos métodos se basan en plásmidos meticulosamente diseñados que contienen un gen de proteína verde fluorescente (GFP) interrumpido con sitios de reconocimiento para la endonucleasa I-SceI, que induce DSB. Aquí, describimos el ensayo extracromosómico NHEJ y el ensayo HR, que implican la co-transfección de células HEK-293T con plásmidos EJ5-GFP/DR-GFP, un plásmido que expresa I-SceI y un plásmido que expresa mCherry. Los resultados cuantitativos de la eficiencia de NHEJ y HR se obtienen calculando la proporción de células positivas para GFP y células mCherry positivas, según se cuentan mediante citometría de flujo. A diferencia de los ensayos cromosómicamente integrados, estos ensayos extracromosómicos son más adecuados para realizar investigaciones comparativas que involucran múltiples líneas celulares estables establecidas.

Introducción

Una rotura de doble cadena de ADN (DSB) es la forma más deletérea de daño en el ADN, que puede provocar inestabilidad del genoma, reordenamientos cromosómicos, senescencia celular y muerte celular si no se repara^con prontitud. Dos vías bien establecidas, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR), son reconocidas por su eficacia en el tratamiento de los DSB de ADN ^2,3. HR se considera un mecanismo libre de errores para la reparación de DSB, utilizando secuencias homólogas en la cromátida hermana como plantilla para restaurar la config....

Protocolo

1. Aislamiento de plásmidos

1. Transformar E. coli competente con los plásmidos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plásmido que expresa I-Sce I) y PCI2-HA-mCherry (plásmido que expresa mCherry) (ver Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo de transformación estándar²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry puede ser sustituido por otros plásmidos que expresen mCherry o DsRed.
2. Cultivar la E. coli transformada en 500 mL de medio LB líquido suplementado con 100 μg/mL de ampicilina durante la noche a 37 °C con agitación.
3. Aísle los plásmidos utilizando un kit de aislamiento maxi d....

Resultados

Para garantizar la precisión de los análisis de NHEJ y RRHH, es necesaria la implementación de una estrategia adecuada de ajuste de compensación y compuertas. Normalmente, la fluorescencia mCherry no se manifiesta en el detector GFP cuando se utiliza un filtro de 530 nm. Sin embargo, en casos de células que exhiben una expresión de GFP extremadamente alta, la fluorescencia de GFP puede contaminar el detector mCherry cuando se usa un filtro de 575 nm. Para abordar estas preocupaciones, se utilizaron muestras de control ne.......

Discusión

El método aquí descrito ha sido empleado en varios trabajos para evaluar la eficiencia de la NHEJ y la eficiencia de la HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método es pertinente para dil.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Platos de 6 cm	BBI	F611202-9001
placas de 6 pocillos	Corning	3516
Ampicilina	Beyotime	ST007	Concentración de trabajo: 100 μ g/mL
DH5 y alfa; Células competentes	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmidio  kit	TIANGEN	DP117	se puede utilizar el kit de extracción de plásmidos alternativo sin endotoxinas
tubos FACS	FALCON	352054
Suero fetal bovino	CLARK	FB25015
Citómetro de flujo	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	puede utilizar el software de análisis alternativo	Treestar
Células HEK-293T	Infraestructura Nacional de Recurso de Líneas Celulares	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	Se pueden utilizar regentes de transfección alternativos
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expresando plásmido
PCI2-HA-mCherry			se pueden utilizar plásmidos alternativos que contienen DsRed
Tripsina	Gibco	25200-056

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