Seguimiento de la fibrinólisis de coágulos de sangre entera formados en bucle de Chandler bajo flujo de cizallamiento en un modelo de trombólisis in vitro

Resumen

Los ensayos de trombólisis in vitro a menudo han tenido dificultades para replicar condiciones in vivo, ya sea en el trombo modelo que se está digiriendo o en el entorno en el que se produce la trombólisis. En este artículo, exploramos cómo se utiliza el acoplamiento del bucle de Chandler y el ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (RT-FluFF) para el monitoreo de lisis de coágulos ex vivo de alta fidelidad.

Resumen

La tromboembolia y las complicaciones relacionadas son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, y se han desarrollado varios ensayos para probar la eficacia de los fármacos trombolíticos tanto in vitro como in vivo. Existe una creciente demanda de modelos de coágulos in vitro más relevantes fisiológicamente para el desarrollo de fármacos debido a la complejidad y el coste asociados a los modelos animales, además de su a menudo falta de traducibilidad a la fisiología humana. El flujo, la presión y la velocidad de cizallamiento son características importantes del sistema circulatorio, ya que los coágulos que se forman bajo flujo muestran una morfología y características de digestión diferentes a las de los coágulos formados estáticamente. Estos factores a menudo no están representados en los ensayos convencionales de digestión de coágulos in vitro , lo que puede tener implicaciones farmacológicas que afectan las tasas de éxito de la traducción de fármacos.

El ensayo Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinólisis (RT-FluFF) se desarrolló como una plataforma de pruebas de trombólisis de alta fidelidad que utiliza coágulos marcados con fluorescencia formados bajo flujo de cizallamiento, que luego se digieren utilizando plasma circulante en presencia o ausencia de agentes farmacéuticos fibrinolíticos. La modificación de las tasas de flujo de las etapas de formación y digestión de coágulos permite que el sistema imite las condiciones arteriales, pulmonares y venosas en configuraciones experimentales muy diversas. Las mediciones se pueden realizar de forma continua utilizando un fluorímetro en línea o tomando puntos de tiempo discretos, así como una medición convencional de la masa del coágulo en el punto final. El ensayo RT-FluFF es un sistema flexible que permite el seguimiento en tiempo real de la digestión de coágulos en condiciones de flujo que representan con mayor precisión las condiciones fisiológicas in vivo, al tiempo que conserva el control y la reproducibilidad de un sistema de pruebas in vitro.

Introducción

Las enfermedades derivadas fundamentalmente de etiologías tromboembólicas presentan una fuente importante de morbilidad y mortalidad en la sociedad actual. Las manifestaciones de la patogenia tromboembólica incluyen, entre otras, infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares isquémicos, trombosis venosas profundas y embolias pulmonares¹. Una enorme cantidad de investigación en curso, que abarca múltiples disciplinas, gira en torno al desarrollo de métodos seguros y eficaces para tratar la trombosis patógena. Las variaciones en las manifestaciones arteriales y venosas de la trombosis y las diferentes localizaciones anatómicas han dado luga....

Protocolo

Todos los métodos que se mencionan a continuación están de acuerdo con los protocolos de la junta de revisión institucional (IRB) y el comité institucional de ética de investigación en seres humanos. Todos los voluntarios sanos dieron su consentimiento escrito e informado antes de la donación de sangre. Cabe destacar que todos los materiales a los que se hace referencia en el protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Si bien el WB humano y el plasma se discuten a lo largo de este protocolo, el uso de sangre animal de investigación y productos sanguíneos con factor agotado se pueden comprar y sustituir.

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Resultados

Formación de coágulos en bucle de Chandler
Al formar coágulos, generalmente apuntamos a los cuadruplicados para asegurarnos de que, si existían valores atípicos de coágulos (basados en la morfología macroscópica y la masa), aún teníamos la capacidad de realizar ensayos de trombólisis por triplicado. Suponiendo condiciones de carga óptimas, todos los coágulos deben ser bastante uniformes en longitud (~3,3 cm), peso (~100 mg) y apariencia, como se representa en la Figura 3........

Discusión

Formación de coágulos y etiquetado
Se ha demostrado que el asa de Chandler proporciona un medio fácil y eficaz para generar coágulos de forma reproducible que imitan los trombos in vivo ¹⁶. Los parámetros de ajuste fino, como el tamaño del tubo, las velocidades de rotación, el diámetro del tambor y el tiempo de coagulación, permiten la rápida generación de coágulos en diferentes condiciones de cizallamiento que pueden capturar las características arquitectónicas apreci.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
30 G  Agujas hipodérmicas desechables	Exel International	26439	Otros consumibles
Herramienta de culata de barra de torno HSS de 6 mm 150 mm de largo	uxcell	B07SXGSQ82	bucle Chandler,
Microplaca transparente UV de fondo plano transparente de 96 pocillos	Corning	3635	Otros consumibles, copolímero acrílico no tratado, no estéril
Air-Tite Luer-lock Jeringas no estériles de 60 ml	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Aparato, amortiguadores
Arium Mini Plus Sistema de agua ultrapura	Sartorius	NA	DI Fuente
de agua Cloruro de calcio	Millipore Sigma	C5670	Otros consumibles
Transductores de BP desechables	AD Instruments	MLT0670	Aparato RT-FluFF
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	Aparato RT-FluFF
Drager Monitor de paciente Siemans	Drager	SC 7000	RT-FluFF Tambor
aparato (cilindro, diámetro 120 mm, ancho 85 mm)			Bucle Chandler,Protector
facial	Moxe	SHIELDS10	Bucle de Chandler,
Fibrinógeno de plasma humano, Alexa Fluor 488 Conjugado	Thermo Scientific	F13191	Otros consumibles
Racor, de policarbonato, llave de paso de cuatro vías, Luer macho Bloqueo, no estéril	Masterflex	30600-04	Aparato RT-FluFF
fluoresceína (FITC)	Thermo Scientific	119245000	otros consumibles
Baño de agua de uso general	Thermo Scientific	2839	Bucle de Chandler,
Placa calefactora 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Aparato
Fuente Humana Plasma Fresco-Congelado	Zen-Bio	SER-SPL	Otros Consumibles, CPDA-1 anticoagulante
Sangre entera humana	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Otros consumibles, anticoagulante CPDA-1
Cabezal de bomba L/S Easy-Load II para tubos de precisión de alto rendimiento, carcasa de PPS, rotor SS	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Aparato, cabezal de bomba
L/S Bomba de accionamiento digital de velocidad variable con E/S remotas, de 6 a 600 rpm; 90 a 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Aparato, Controlador
velocidad del motor	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Tubos Nalgene Conectores tipo T Thermo	Scientific	6151-0312	RT-FluFF Aparato Tubo de
bomba peristáltica	Masterflex	06424-15	Otros consumibles
Solución salina tamponada con fosfato	Millipore Sigma	P3813	Otros consumibles, Polvo, pH 7,4, para la preparación de soluciones de 1 L
Fuente de alimentación conmutada	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target Jeringas desechables totalmente de plástico de 10 ml	Thermo Scientific	S751010	Otros consumibles
Activador tisular del plasminógeno, humano	Millipore Sigma	T0831	Otros consumibles
ID del tubo 1/4'', diámetro exterior 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	otros consumibles, cortados en secciones de 1,5 cm se utilizan para conectar el tubo a conectores
tipo TID de tubería 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Otros consumibles
V3 365 nm Mini - Linterna UV de luz negra	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, utilizada para comprobar los coágulos completados
ZGA37RG ZYTD520 motor de CC, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,

de de de la bomba