Análisis de las interacciones ADN-proteína con la interferometría de biocapas basada en estreptavidina

Resumen

Este artículo describe un protocolo para estudiar las interacciones ADN-proteína utilizando un sistema de interferometría de biocapas (BLI) basado en estreptavidina. Describe los pasos y consideraciones esenciales para utilizar la cinética de enlace básica o avanzada para determinar la afinidad de enlace de equilibrio (K_D) de la interacción.

Resumen

Las interacciones proteína-ADN sustentan los procesos celulares esenciales. La comprensión de estas interacciones es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares de varias vías. Factores clave como la estructura, la secuencia y la longitud de una molécula de ADN pueden influir significativamente en la unión de proteínas. La interferometría de biocapas (BLI) es una técnica sin marcadores que mide la cinética de unión entre moléculas, lo que ofrece un enfoque sencillo y preciso para estudiar cuantitativamente las interacciones proteína-ADN. Una gran ventaja de BLI sobre los métodos tradicionales basados en gel es su capacidad para proporcionar datos en tiempo real sobre la cinética de unión, lo que permite una medición precisa de la constante de disociación de equilibrio (K_D) para las interacciones dinámicas proteína-ADN. Este artículo presenta un protocolo básico para determinar el valor K_D de la interacción entre una proteína de replicación de ADN, la proteína de replicación A (RPA), y un sustrato de ADN monocatenario (ssDNA). El RPA se une al ssDNA con alta afinidad, pero también debe desplazarse fácilmente para facilitar las interacciones posteriores de las proteínas dentro de las vías biológicas. En el ensayo BLI descrito, el ssDNA biotinilado se inmoviliza en un biosensor recubierto de estreptavidina. A continuación, se mide la cinética de unión (asociación y disociación) de RPA al ADN unido a biosensores. Los datos resultantes se analizan para derivar valores precisos para la constante de velocidad de asociación (k_a), la constante de velocidad de disociación (k_d) y la constante de enlace de equilibrio (K_D) utilizando el software del sistema.

Introducción

Las proteínas celulares desempeñan un papel fundamental en la orquestación de los complejos procesos biológicos que ocurren dentro de los organismos vivos. El funcionamiento óptimo de estas vías depende de la interacción entre las proteínas y otras biomoléculas dentro de la célula, incluidas las interacciones con las proteínas asociadas y los ácidos nucleicos¹. Por lo tanto, comprender las complejidades de los procesos celulares requiere una comprensión profunda de la dinámica de las interacciones proteína-ácido nucleico.

Tradicionalmente, las interacciones proteína-ácido nucleico se han estudiado utilizando ensayos de desplazamiento de gel de movilidad electroforética (EMSAs)². En este ensayo, las proteínas se incuban con oligonucleótidos sintéticos (ya sea ADN/ARN, que contienen longitudes o secuencias específicas) durante un corto período, y la reacción se electroforeza en un gel de poliacrilamida nativa (PAGE) ^3,4,5. Para permitir la visualización de la interacción proteína-oligonucleótido, los oligonucleótidos suelen marcarse radiactivamente con ³²P o con moléculas fluorescentes. Si la proteína interactúa y se une al oligonucleótido, entonces la unión de la proteína ralentiza la movilidad del ácido nucleico dentro del gel ^6,7. Por lo tanto, este método también se denomina ensayo de desplazamiento de gel o retardo de gel. Aunque este método se ha utilizado ampliamente, existen algunas limitaciones a tener en cuenta al usar este método para obtener valores_{K D}, incluida la baja resolución de la unión débil o dinámica, el requisito de una concentración significativamente alta de proteínas y más esfuerzo. Además, los EMSA no son ensayos en tiempo real y, por lo tanto, no pueden medir con precisión la cinética de unión ^7,8.

Técnicas innovadoras como la resonancia de plasmones de superficie (SPR) y la interferometría de biocapas (BLI) han surgido para superar estas limitaciones 9,10,11,12. Ambos métodos miden las constantes de tasa de asociación/disociación y las constantes de afinidad entre moléculas de una manera libre de etiquetas. Dado que no es necesario marcar la proteína, estas técnicas eliminan el riesgo de alterar las propiedades de la proteína o bloquear el sitio de unión. En SPR, la luz polarizada interactúa con un sensor (una película conductora de metal, generalmente oro), generando una onda de densidad de carga de electrones llamada plasmón. Esta interacción disminuye la intensidad del haz reflejado y un detector mide el cambio en el ángulo específico, conocido como ángulo de resonancia¹³. Para estudiar las interacciones ligando (ácido nucleico) - analito (proteína), el ligando se inmoviliza en una celda de flujo en el chip sensor y el analito se inyecta en la celda de flujo que contiene el ligando inmovilizado. Al unirse el analito al ligando, se produce un cambio detectable en el índice de refracción cerca de la superficie del sensor, lo que permite medir las interacciones moleculares 14,15,16.

La interferometría de biocapa (BLI) mide el patrón de interferencia de la luz a medida que la luz pasa a través de una fibra óptica con una biocapa, compuesta por un ligando (cebo) y su socio de unión (analito), en la superficie inferior de la punta del biosensor. La luz se transmite a través de la punta y se refleja en ambos extremos de la biocapa debido a las propiedades de la biocapa. El espesor de la biocapa es proporcional al número de moléculas unidas que influyen en el patrón de la luz reflejada. Al comparar el cambio de la curva de intensidad relativa vs. Longitud de onda causada por la interferencia entre la luz reflejada de la interfaz de referencia y de la interfaz biocapa / tampón, se puede determinar el cambio de espesor de la biocapa. Cuando se unen más moléculas, se produce un mayor cambio, lo que convierte a BLI en una poderosa herramienta para estudiar las interacciones biomoleculares en tiempo real. El cambio en el diagrama de interferencia se mide y se representa en un sensorgrama como un desplazamiento espectral^17,18 (Figura 1A). La naturaleza de la interacción de unión se puede determinar con precisión mediante el uso de controles apropiados, como una configuración que carezca de las concentraciones variables de ligando del socio de unión 19,20,21. En comparación con SPR, BLI es rentable y fácil de usar, lo que lo hace accesible a una amplia gama de investigadores. Además, las muestras utilizadas en BLI permanecen intactas si no hay degradación o agregación. Esto permite que puedan ser recuperados y reutilizados, minimizando así los residuos. El instrumento BLI funciona sin el uso de microfluídica, eliminando así las desventajas del sistema de fluídica, como la necesidad de mantenimiento/cuidado, la obstrucción o el uso de tampones desgasificados. También minimiza el riesgo de contaminación del instrumento debido a muestras de proteínas crudas o sin filtrar.

En un experimento BLI, la biocapa se establece inmovilizando la molécula de cebo en el biosensor. La biocapa de los biosensores puede interactuar con varias etiquetas, lo que permite estudiar las interacciones entre moléculas (incluidos ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, virus, moléculas pequeñas, etc.)²². Para establecer esta inmovilización se pueden emplear diversas estrategias de captura, como biotina/estreptavidina, 6X-His-tag/Ni-NTA, FLAG/anti-FLAG, GST/anti-GST y anticuerpos/anti-Fc. Mantener la estructura y la actividad del ligando inmovilizado es crucial a la hora de elegir el biosensor. Los cambios en el patrón de interferencia están influenciados por la cantidad de molécula unida, así como por la matriz²³. Las interacciones proteína-ácido nucleico se estudian utilizando sondas de oligonucleótidos biotinilados que pueden inmovilizarse en biosensores recubiertos de estreptavidina. Las muestras de proteínas que se espera que interactúen con el cebo inmovilizado (oligonucleótido) están en contacto con el oligonucleótido durante un período específico en un tampón de unión para medir la asociación y, posteriormente, se cambian a un tampón de unión en blanco para medir la disociación. En la Figura 1B se muestra una representación esquemática de la unión del analito y los cambios correspondientes en la curva de unión. Además, las interacciones proteína-nucleico también se pueden estudiar mediante una ruta de inmovilización inversa, en la que la proteína (cebo) se captura en el biosensor e interactúa con el ácido nucleico (analito).

En la actualidad, existen múltiples instrumentos disponibles comercialmente que funcionan según el principio de la interferometría de biocapas. Un instrumento sencillo y rentable se conoce como el sistema Octet N1, que cuenta con un solo canal para el rendimiento de datos. Requiere operación manual, consume un volumen mínimo de muestra (4 μL) y realiza análisis de muestras a temperatura ambiente ^9,23. Este instrumento monocanal puede detectar eficiencias de unión de proteínas mayores de 10 kDa y mide afinidades en el rango de micromolares (μM) a nanomolares (nM)^11,12. También están disponibles algunos instrumentos con 2, 8, 16 y 96 canales para la lectura automática de datos, que son compatibles con los formatos de 96 o 384 pocillos^19,20. Algunos de estos instrumentos también pueden operar entre 4 °C y 40 °C, detectar biomoléculas con un peso molecular tan bajo como 150 Da y medir afinidades dentro del rango de milimolares a picomolares^19,21. Si bien el sistema descrito es rentable, los instrumentos más caros con múltiples canales ofrecen un procesamiento automático de alto rendimiento. Estos sistemas avanzados se emplean comúnmente en la caracterización y desarrollo de moléculas biológicas de fármacos ^9,23.

El protocolo actual describe los pasos necesarios para medir los parámetros de unión de la proteína de replicación A (RPA) al ADN monocatenario (ss-DNA) utilizando el sistema de interferometría de biocapa manual de un solo canal. RPA es un complejo proteico heterotrimérico de unión al ADNs que desempeña un papel fundamental en casi todos los aspectos del metabolismo del ADN, incluida la replicación, reparación y^{recombinación del} ADN. Debido a su alta afinidad con el ssDNA (medido en el rango subnanomolar), puede unirse rápidamente al ssDNA generado durante varias transacciones de ADN, protegerlo de la degradación nucleolítica y evitar la unión improvisada de otras proteínas posteriores. La RPA también desempeña un papel fundamental en la prevención de la formación de estructuras secundarias y terciarias no canónicas, como los G-cuádruples²⁵. La RPA humana se compone de tres subunidades: RPA70 (70 kDa), RPA32 (32 kDa) y RPA14 (14 kDa), también llamadas RPA 1, RPA 2 y RPA 3, respectivamente 24,26,27. Estas subunidades albergan seis pliegues de unión a oligonucleótidos/oligosacáridos (pliegues OB) marcados de la A a la F. Entre estos, los dominios de unión al ADN (DBD) se encuentran en las subunidades RPA1 (DBD-A, DBD-B, DBD-C) y RPA2 (DBD-D)²⁸. Al principio se pensó que, dependiendo de la longitud del ADN, el RPA exhibe diferentes modos de unión en los que diferentes DBD se acoplan a^{longitudes específicas} de ADN. Los datos de estudios estructurales y de moléculas individuales recientes han ayudado a refinar estos modelos para sugerir que la unión de diferentes DBDs de RPA es más dinámica de lo que se sugirió inicialmente 30,31,32,33,34,35,36. Esta característica de la propiedad de unión dinámica es esencial para la función de RPA porque RPA debería ser capaz de unirse estrechamente al sustrato de ADN durante ciertas transacciones de ADN; Sin embargo, también debería ser capaz de desplazarse del sustrato para ceder el sustrato a la siguiente proteína durante el proceso biológico. Utilizando diferentes técnicas bioquímicas, se ha determinado que el K_D para RPA es de aproximadamente 0,4 nM para un sustrato de ss-(polydT)₃₀, y de 80 nM y 200 nM para sustratos de ss-(polydA)₂₅₇ y dG-(polydG)₆₀₂ respectivamente, medido por anisotropía de polarización por fluorescencia (FPA)^37,38. La RPA también muestra una preferencia 50 veces mayor por la unión a secuencias ricas en pirimidina en comparación con las purinas. Aunque diferentes técnicas bioquímicas han determinado diferentes mediciones de KD para RPA, todas las mediciones se han realizado en el rango nanomolar, lo que sugiere la alta afinidad de unión de RPA para el ssDNA. Empleando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), se descubrió que, en base a la longitud del ADN, el RPA se asoció con al menos dos modos de unión: uno que se definió en el complejo de disociación rápida (K_d, 680 pM) y otro de disociación lenta (K_d, 60 pM)^33,39. Dada su participación fundamental en casi todas las vías metabólicas del ADN, ha habido un gran interés en la creación de inhibidores que puedan dificultar la interacción entre el RPA y el ADN monocatenario (ssDNA). Estos inhibidores químicos son vitales para interrumpir la respuesta al daño del ADN, lo que hace que las células cancerosas sean más susceptibles a los agentes que dañan el ADN empleados en las terapias clínicas. El uso del ensayo BLI permite una evaluación cuantitativa precisa de la eficacia del inhibidor en la modulación de la función de unión de RPA^40,41.

La configuración de BLI permite distintos ajustes: cinética básica y avanzada. En el modo cinético básico, el ensayo comprende tres etapas principales: establecimiento de referencia, asociación y disociación. Sin embargo, antes de realizar este ensayo, los biosensores deben recubrirse por separado, utilizando el instrumento o manualmente en la mesa de laboratorio. Por el contrario, el modo cinético avanzado se extiende más allá de los tres pasos fundamentales, lo que permite la incorporación de pasos adicionales. Estos pasos complementarios pueden servir para diversos propósitos, como acondicionar el biosensor a las alteraciones del tampón o facilitar la detección de interacciones proteicas posteriores. La cinética avanzada también permite despojar al biosensor del analito mediante un buen método de regeneración para su posible reutilización, siempre que el cebo y el biosensor permanezcan intactos. Por lo general, la cinética avanzada se utiliza en lugar de la cinética básica cuando el ensayo implica varios pasos o cuando el ensayo debe realizarse en un formato más complejo.

Este protocolo describe ambos métodos utilizando el mismo cebo [3'Bio-ss-poly (dT)₃₂] y analito (RPA). Se utilizará un biosensor recubierto de estreptavidina para inmovilizar el cebo y se obtendrán mediciones de K_D para el analito. Este protocolo describe un enfoque completo para realizar un ensayo BLI utilizando una interferometría de biocapa de instrumento de un solo canal, que cubre la preparación del cebo con biosensores, consideraciones de tampón y un esquema paso a paso del procedimiento.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de cebo, analito, tampones y limpieza de portagotas

1. Configuración del instrumento: Encienda el instrumento al menos 1 h antes de comenzar el experimento. Esto permitirá que la lámpara se caliente.
2. Preparación de tampones de decapado y limpieza
   1. Tampón de decapante: Preparar 50 mL de ácido fosfórico 0,15 M [pH 2,0]).
   2. Tampón de limpieza: Preparar 10 mL de HCl 0,5 N.
3. Preparación del tampón BLI
   1. Prepare 50 mL de tampón BLI 1x (50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 0.05% Tween 20). Almacene este tampón a 4 °C. Antes de configurar este ensayo, lleve el tampón a temperatura ambiente.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente que se preparen tampones nuevos para el ensayo, ya que los tampones envejecidos pueden sufrir alteraciones del pH o formación de agregados y pueden tener contaminaciones microbianas, lo que podría comprometer la reproducibilidad y precisión de los resultados. No se recomienda utilizar tampones que se hayan almacenado durante más de dos semanas.
4. Preparación del cebo/sustrato
   1. Prepare 12,5 nM de sustrato 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ (5' TTT, TTT, TTT, TTT, TT, 3'Bio) utilizando tampón BLI.
5. Preparación de stocks de concentración de proteínas
   1. Prepare cuatro concentraciones de RPA (5 nM, 10 nM, 20 nM, 40 nM) utilizando tampón BLI. La concentración más alta de la proteína (40 nM) se obtiene diluyendo la proteína madre en tampón BLI. Las diluciones posteriores se preparan mediante dilución en serie de la solución de trabajo de 40 nM. Asegúrese de que todas las reservas de proteínas se mantengan en hielo durante todo el experimento para mantener la estabilidad.
6. Limpieza del portagotas
   1. Agregue 4 μL de agua destilada y limpie el soporte de gotas con una toallita sin pelusa (repita 3 veces). A continuación, repita este paso con 4 μL de etanol al 70% y limpie con una toallita sin pelusa. Este paso asegura la eliminación de los contaminantes de la superficie y las partículas de polvo.
   2. Añade 4μL de HCl 0,5N y déjalo en el soporte durante 1 min. Límpialo con una toallita sin pelusa y repite este paso una vez más. Esto asegura una limpieza profunda del portacaídas. La limpieza profunda es especialmente útil para limpiar el soporte de gotas secas de uso anterior.
   3. 1Repita el paso 1 para lavar el soporte de gotas con agua destilada y etanol al 70 % y séquelo con una toallita sin pelusa. El soporte de caída ya está listo para ser utilizado.

2. Cinética básica

1. Configuración del instrumento y del software
   1. Abra el software y seleccione Basic Kinetics en el panel izquierdo (Figura complementaria 1).
   2. Retire el bastidor de biosensores de la bandeja (obtenidos de fuentes comerciales) y coloque una placa de 96 pocillos en la bandeja. Agregue 200 μL de tampón BLI al primer pocillo. A continuación, vuelva a colocar la bandeja de biosensores en la parte superior de la placa de 96 pocillos, asegurándose de que cada biosensor se inserte en su pocillo correspondiente. El primer biosensor ahora debe estar sumergido en el tampón BLI en el primer pozo.
   3. En el software, haga clic en Hidratar y encienda el temporizador durante 10 minutos, permitiendo que el biosensor se hidrate durante al menos 10 minutos. El paso hidrata el biosensor para prepararlo para el ensayo BLI.
   4. Mientras se hidrata el biosensor, pipetee 250 μL de tampón BLI en dos tubos de 0,5 mL. Etiqueta uno como "A" (asociación) y el otro como "D" (disociación).
   5. Rellene los detalles del software (Nombre: Recubrimiento de sustrato y descripción del ensayo: RPA- 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂: Cinética básica).
   6. Ajuste la configuración de ejecución para cada paso: Línea de base (30 s), Asociación (120 s), Disociación (120 s) (Tabla 1). Mantenga el agitador puesto para el tubo y el soporte de caída. La velocidad del agitador se establece en 2200 rpm (rango, 1000–2600 rpm), lo que evita los efectos del transporte de masa causados por la difusión limitada cerca de la superficie del biosensor.
      NOTA: Se recomienda optimizar la duración de cada paso (línea base, carga, asociación, disociación) al configurar un ensayo cinético de unión para mejorar la adquisición de datos.
2. Establecimiento de una curva de referencia
   1. Coloque el tubo A en el soporte del tubo y conecte el biosensor hidratado al sistema BLI. Deslice el soporte del tubo debajo del biosensor (posición A, Figura 2).
      NOTA: Los biosensores no deben secarse completamente en ningún momento durante el experimento. Si se deja secar, las lecturas del experimento pueden estar significativamente sesgadas.
   2. Pulsa Ejecutar y sigue las instrucciones del mensaje de mensaje.
   3. Después de completar la línea de base inicial, abra la tapa y agregue 4 μL de tampón BLI al soporte de caída. Deslícelo hacia la derecha debajo del mismo biosensor (posición B, Figura 2). Cierre la tapa y controle la curva BLI en el software (Figura 3, curva azul).
   4. Una vez finalizado, abra la tapa para reemplazar el tubo 'A' por 'D' y deslícelo debajo del biosensor (posición A, Figura 2). Cierre la tapa y continúe con el paso de disociación. Una vez finalizado, abra la tapa, separe el biosensor, vuelva a colocarlo en la bandeja y asegúrese de que el biosensor esté sumergido en tampón BLI.
   5. Retire la muestra/tampón, limpie el soporte de gotas con un tampón antes de secarlo con toallitas sin pelusa y retire el tubo 'D' del soporte del tubo.
3. Recubrimiento de sustrato
   1. Coloque el tubo A en el soporte del tubo y conecte el biosensor hidratado al sistema BLI. Deslice el soporte del tubo debajo del biosensor y presione Ejecutar.
   2. Después del paso inicial de referencia, agregue 4 μL de sustrato de 12,5 nM [3'Bio-ss-poly (dT)₃₂] al soporte de caída y deslícelo debajo del biosensor. Cierre la tapa y controle la curva BLI en el software. Asegúrese de que esta respuesta sea superior a la línea de base (Figura 3).
      NOTA: La concentración de sustrato se puede optimizar recubriendo los biosensores con diferentes concentraciones (solo una concentración por biosensor) y observando las curvas de unión. Una curva de unión con una señal visiblemente más alta en comparación con la línea de base es suficiente para confirmar el recubrimiento del sustrato. La sobrecarga del biosensor puede provocar un obstáculo estérico o apiñamiento en la superficie. La Figura 3muestra las curvas para cinco concentraciones de sustrato biotinilado 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ . Además, una vez completado el paso de carga del cebo, los biosensores se pueden sumergir en tampón bloqueador de estreptavidina (biocitina) durante 30 s, seguido de un lavado en tampón BLI. Esto bloqueará la superficie no unida de la estreptavidina y evitará la unión inespecífica.
   3. Después de completar el paso de asociación, abra la tapa y reemplace el tubo 'A' por el tubo 'D'. Deslícelo debajo del biosensor y cierre la tapa.
   4. Una vez completado el paso de disociación, abra la tapa, separe el biosensor y colóquelo en la bandeja del biosensor que contiene el tampón BLI. Asegúrese de que el biosensor esté completamente sumergido en el tampón y esté adecuadamente hidratado para los siguientes pasos. Limpie el soporte de gotas con tampón de ensayo, séquelo con toallitas sin pelusa y retire el tubo 'D' del soporte de tubos. El biosensor ahora está recubierto con el sustrato 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ .
4. Unión de proteínas
   1. Pipetear 250 μL de tampón BLI en diez tubos de microfuga negra de 0,5 mL. etiquételos de A1 a A5 y de D1 a D5.
   2. En otra placa de 96 pocillos, agregue 200 μL de tampón de extracción en el pocillo, correspondiente a la posición del biosensor hidratado.
   3. Antes de comenzar el ensayo, limpie el soporte de caída 3 veces con tampón BLI.
   4. Abra un nuevo archivo en el software y seleccione Basic Kinetics en el panel izquierdo. Asigne un nombre al ensayo y agregue la descripción según sea necesario (Figura complementaria 2). Ajuste la configuración de ejecución según sea necesario (Tabla 1).
   5. Coloque el tubo etiquetado como A1 en el soporte del tubo y conecte el biosensor recubierto de 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ al sistema BLI. Deslice el tubo debajo del biosensor y presione Ejecutar.
   6. Después de completar el paso inicial de referencia, abra la tapa, agregue 4 μL del tampón BLI al soporte de gotas y deslícelo debajo del biosensor. Esta será la concentración de proteína de 0 nM y servirá como curva de referencia.
   7. Después de completar el paso de asociación, reemplace el tubo A1 por D1 y deslícelo debajo del biosensor.
   8. Una vez completado el paso de disociación, retire el biosensor y vuelva a colocarlo en su bandeja. Asegúrese de que el biosensor esté completamente sumergido en el tampón y adecuadamente hidratado para los siguientes pasos. Retire el tubo D1, limpie el soporte de gotas con tampón de ensayo y séquelo con una toallita sin pelusa.
   9. A continuación, se obtendrá la curva de enlace para el stock de RPA de 5 nM. Rellene los detalles de la muestra (Concentración: 5 nM, Peso molecular: 116 KDa) y pulse Calc. Esto calculará la concentración de proteína en μg/μL.
   10. Coloque el biosensor recubierto de 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ y coloque el tubo A2 en el soporte del tubo. Deslízalo debajo del biosensor y presiona Ejecutar.
   11. Después de la línea de base, agregue 4 μL de RPA de 5 nM en el soporte de caída y deslícelo debajo del biosensor. Cierre la tapa y controle la curva de asociación. La unión de proteínas al cebo se puede visualizar mediante una curva que va más alta que la curva de referencia. Después del paso de asociación, reemplace A2 por D2, deslícelo debajo del biosensor y complete el paso de disociación.
   12. Retire el biosensor, sumérjalo en el tampón de extracción durante 30 s y, a continuación, sumérjalo en el tampón BLI durante 3 minutos.
       NOTA: La eficiencia de regeneración depende del cebo inmovilizado y del analito interrumpido. Algunos biosensores inmovilizados pueden soportar diez o más ciclos de regeneración. Pudimos eliminar el sustrato biotinilado 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ más de tres veces (Figura suplementaria 3) sin observar un cambio notable en la respuesta.
   13. Repita los pasos 2.4.9 a 2.4.12 para las otras tres concentraciones de RPA 10 nM, 20 nM y 40 nM. Asegúrese de quitar el biosensor para cada concentración.
       NOTA: Para los ensayos BLI, los expertos recomiendan utilizar cuatro concentraciones (excluyendo la curva de referencia), que abarcan aproximadamente de 0,1x a 10x el K_D esperado para obtener mediciones cinéticas precisas. En este caso, las cuatro concentraciones se obtuvieron mediante diluciones seriadas.
5. Análisis de datos y cálculo de valores K_D
   1. Antes de calcular el valor K_D , es necesario inspeccionar visualmente el sensorgrama para cada concentración de unión de RPA en el sustrato 3'Bio-ss-poly (dT)₃₂ . Asegúrese de que la señal BLI aumente con el aumento de la concentración de RPA hasta que el ADN inmovilizado esté saturado (Figura 4).
      NOTA: Para obtener resultados fiables, asegúrese de que al menos cuatro concentraciones de proteínas se unan correctamente al sustrato, excluyendo la concentración de analito de 0 nM. Consulte la sección de discusión para solucionar posibles errores.
   2. En la tabla 'Lista de ejecución', marque Ref para la concentración de analito de 0 nM para que sirva como curva de referencia. Marque Analizar para todas las concentraciones del analito.
   3. A continuación, seleccione Inicio de asociación e Inicio de disociación para la corrección de pasos. Esto alineará el comienzo de la asociación con el final de la línea de base y el comienzo de la disociación con el final de la asociación, que generalmente es causada por diferentes patrones de reflexión entre el soporte de caída y el tubo si el tampón coincide bien.
   4. Seleccione Ajuste global (1:1) para este ensayo. El análisis global calcula los valores de K_D para un conjunto completo de concentraciones de proteínas, mientras que el análisis local es para una sola concentración de proteínas.
      NOTA: El software que acompaña al instrumento solo permite el ajuste 1:1. Esto podría ser una posible advertencia cuando se espera que el cebo y el analito encajen en otros modelos adecuados. Los datos de este software pueden exportarse a otro software de trazado y ajustarse a los modelos de ajuste requeridos.
   5. A continuación, seleccione Analizar. Esto calculará los valores de K_D, k_a/k_d (Tabla 2). El error k_a y k_d dentro del 10% del valor generalmente se considera aceptable.
      NOTA: Asegúrese de que estos valores estén dentro de límites razonables. Si el error es inferior al 10%, sugiere que el ajuste de los datos es fiable para estudiar las interacciones entre moléculas biológicas. Además, la K_D (constante de disociación de equilibrio) calculada utilizando estos valores k_a y k_d debería ser suficientemente precisa para la mayoría de las aplicaciones prácticas¹⁸.
   6. Para exportar los datos ajustados, haga clic con el botón derecho del ratón en el gráfico generado con los datos analizados. Selecciona "Exportar datos" y, a continuación, selecciona "Texto/Datos". Haga clic en Archivo y examinar para guardar los datos en formato '.dat'. Este archivo se puede abrir en Microsoft Excel y utilizar en otro software para el trazado de gráficos.
      NOTA: El ajuste global considera todos los datos de la curva de unión dentro del grupo, mientras que el ajuste local se centra únicamente en los parámetros cinéticos para cada concentración de analito individual.

3. Configuración del instrumento para ejecutar cinética avanzada

1. Abra el software y seleccione Advanced Kinetics en el panel izquierdo (Figura complementaria 1).
2. Coloque una placa de 96 pocillos en la bandeja que contiene los biosensores. Añadir 200 μL de tampón BLI en cinco pocillos. Coloque la bandeja de biosensores en la placa de 96 pocillos de modo que cinco biosensores se sumerjan en el pocillo que contiene el tampón.
3. En el software, haga clic en Hidratar y encienda el temporizador durante 10 minutos, permitiendo que el biosensor se hidrate durante al menos 10 minutos.
4. Mientras los biosensores se hidratan, pipetee 250 μL de tampón BLI en diez tubos de centrífuga negra de 0,5 mL. etiquételos como A1 a A5 y D1 a D5.
5. Rellene los datos del software (Nombre: Recubrimiento de sustrato y descripción del ensayo: RPA-3'Bio-ss-poly (dT)₃₂: Cinética avanzada).
6. Introduzca la duración de cada paso (Figura complementaria 4). Línea de base inicial (30 s), Carga (120 s), Línea de base (30 s), Asociación (120 s), Disociación (120 s). Ajuste la configuración de ejecución según sea necesario (Tabla 1).
   1. Rellene los datos en el software (Concentración: 0 nM, Peso molecular: 116 kDa) y pulse Calc.
7. Coloque el tubo A1 en el soporte del tubo y conecte el biosensor. Deslice el soporte del tubo debajo del biosensor y presione Run para obtener la línea de base inicial.
8. Añada 4 μL de sustrato de 12,5 nM en el soporte de caída y deslícelo por debajo del biosensor. Cierre la tapa. Esto cargará el sustrato en el biosensor. Reemplace A1 por D1 en el soporte del tubo y deslícelo debajo del biosensor. Esto dará la curva de referencia.
9. Limpie el soporte de caída con una toallita sin pelusa y cargue 4 μL del tampón BLI. Deslícelo debajo del biosensor y cierre la tapa. Esta será la concentración de proteína 0 nM y servirá como curva de referencia.
10. Después de completar el paso de asociación, deslice el tubo D2 debajo del biosensor. Continúe con el paso de disociación. Permita que se complete la disociación.
11. Separe el biosensor, retire el D2 del soporte del tubo y limpie el soporte de caída con una toallita sin pelusa.
12. Introduzca los detalles (Concentración: 5 nM, Peso molecular: 116 kDa) para la siguiente ejecución y pulse Calc.
13. Conecte el segundo biosensor al sistema BLItz, coloque el tubo A2 en el soporte del tubo y deslícelo debajo del biosensor.
14. Después de establecer la línea de base inicial, agregue 4 μL de sustrato de 12,5 nM en el soporte de caída. Deslícelo debajo del biosensor y cierre la tapa. Reemplace el tubo A2 por el D3 y deslícelo debajo del biosensor. A continuación, añada 4 μL de 10 nM de RPA en el soporte del tubo y deslícelo por debajo del biosensor.
15. Después de la asociación, deslice D4 debajo del biosensor para la disociación.
16. Repita los pasos 3.1.12 a 3.1.15 para las tres concentraciones siguientes de RPA (10 nM, 20 nM, 40 nM). Las curvas de unión para estas concentraciones se muestran en la Figura 5.
17. El análisis de datos y el valor_{K D} se pueden ajustar en el mismo procedimiento que la cinética básica de BLI (paso 2.5, Tabla 2).

Resultados

En BLI, la luz blanca se refleja desde la interfaz de biocapa/tampón y la interfaz de referencia interna al espectrómetro. Se registra el diagrama de interferencia resultante, y el desplazamiento espectral se mide a lo largo de un período de tiempo y se representa como la respuesta de las curvas de enlace en nm. En la Figura 1 se muestra una figura representativa que muestra la punta del biosensor con y sin unión al analito y el correspondiente desplazamiento de la longitud de onda espectral...

Discusión

La capacidad de analizar la cinética de unión de cualquier proteína a su sustrato utilizando BLI proporciona los medios para aislar y caracterizar los factores específicos (como la secuencia, la estructura o la longitud de un ADN) que gobiernan las interacciones proteína-ADN dentro de^{la célula}. El sistema Octet N1, que se basa en los principios de la interferometría de biocapas, permite la medición cuantitativa de las interacciones proteína-proteína y proteína-áci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 mL Micro Tubos de Centrífuga	Globe Scientific	111554A
96 Pocillos Microplaca Negra Estándar	Dot Scientific	4TI-0223
Biotinilado Poly dT Oligonucleótido	IDT
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Ditiotritol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000-10
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020-500
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144-500
Kimtec Science Kimwipes	Kimtech	34120
Octeto N1 Software	Sartorius	1.4.0.13
Octeto SA Biosensor	Sartorius	18-5019
PBS pH 7.2 (10x)	Gibco	1666711
Sistema de Octeto de Ensayo Personal N1	Sartorius
Ácido fosfórico	Ward's Science	470302-024
Cloruro de sodio (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020-5000
Tris Base	Dot Scientific	DST60040-5000
Tween20	Bio-RAD	170-6531