Artículo de método

Separación rápida y visualización de agentes fibrinogenolíticos activos en Sipunculus nudus mediante electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida

DOI:

10.3791/66536

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19 de abril de 2024

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1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo de electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida (PAGE) para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los agentes fibrinogenolíticos que pueden disolver el fibrinógeno directamente se han utilizado ampliamente en el tratamiento de la anticoagulación. En general, la identificación de nuevos agentes fibrinogenolíticos requiere primero la separación de cada componente y luego la verificación de sus actividades fibrinogenolíticas. Actualmente, la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y la cromatografía se utilizan principalmente en la etapa de separación. Mientras tanto, el ensayo en placa de fibrinógeno y los productos de reacción basados en PAGE generalmente se adoptan para mostrar sus actividades fibrinogenolíticas. Sin embargo, debido a la separación espacio-temporal de esas dos etapas, es imposible separar y mostrar los agentes fibrinogenolíticos activos con el mismo gel. Para simplificar los procesos de separación y visualización de la identificación de agentes fibrinogenolíticos, construimos un nuevo método fibrinógeno-PAGE para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de los gusanos del maní (Sipunculus nudus) en este estudio. Este método incluye la preparación de fibrinógeno-PAGE, electroforesis, renaturalización, incubación, tinción y decoloración. La actividad fibrinogenolítica y el peso molecular de la proteína se pueden detectar simultáneamente. De acuerdo con este método, detectamos con éxito más de un agente fibrinogenolítico activo del homogeneato de gusano de maní en 6 h. Además, este método fibrinógeno-PAGE es amigable con el tiempo y el costo. Además, este método podría utilizarse para estudiar los agentes fibrinogenolíticos de los otros organismos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, debido al continuo aumento de las enfermedades trombóticas, las enfermedades trombóticas se han convertido en un nuevo gran problema de salud mundial1. En la actualidad, los fármacos antitrombóticos se clasifican en tres grupos: antiagregación plaquetaria, anticoagulantes y trombolíticos. Entre ellos, los fármacos trombolíticos, como la uroquinasa (UK), el activador tisular del plasminógeno (tPA), etc., son los únicos fármacos clínicamente utilizados que pueden hidrolizar el trombo2. Mientras tanto, se están desarrollando fármacos trombolíticos más seguros y eficaces mediante la identificación de nuevos agentes trombolíticos3.

Sin embargo, la identificación de nuevos agentes trombolíticos requiere mucho tiempo y trabajo, lo que implica principalmente las etapas de separación/purificación y caracterización/comprobación. El primero es para separar cada componente, y el segundo para mostrar sus actividades fibrinos(geno)líticas 4,5. En estudios anteriores, a pesar de que hemos aislado con éxito una nueva enzima fibrinosa (geno)lítica (sFE) del gusano del maní (Sipunculus nudus) mediante cromatografía de afinidad y ensayo de placa de fibrina (ógeno) 6,7,8, estos procesos requieren tanto tiempo y trabajo. En primer lugar, es necesario determinar si los homogeneizados de gusanos de cacahuete tienen actividad fibrinosa (geno)lítica mediante el método de placa de fibrina (ógeno) y productos de reacción basados en PÁGINA9. A continuación, se deben realizar una serie de cromatografías, como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía de afinidad y otros métodos, para la separación y purificación10,11. Posteriormente, se vuelve a realizar el ensayo en placa de fibrina para comprobar la actividad fibrinogenolítica de cada componente separado. Finalmente, se realizan PAGE nativo y dodecil sulfato de sodio (SDS)-PAGE para determinar el peso molecular de los agentes fibrinogenolíticos activos12. Por lo tanto, es fundamental separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos activos.

Para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos activos en los homogeneizados de gusanos del maní, se desarrolló un nuevo método fibrinógeno-PAGE combinando los métodos PAGE y placa de fibrinógeno, es decir, los sustratos de los agentes fibrinogenolíticos fibrinógeno se agregaron al gel PAGE-nativo. Después de la página nativa, los componentes se separaron por su peso molecular. Mientras tanto, cada componente fibrinogenolítico activo se puede mostrar mediante tinción. Con este método, detectamos con éxito más de un agente fibrinogenolítico activo del homogeneizado del gusano del maní en 6 h. Además, este método fibrinógeno-PAGE es amigable con el tiempo y el costo. Además, este método podría utilizarse para estudiar los agentes fibrinogenolíticos de los otros organismos.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de homogeneizado de gusanos de maní

  1. Añadir 50 g de gusanos de cacahuete y 150 mL de solución salina en el homogeneizador.
  2. Homogeneizar a 24000 rpm durante 60 s.
    NOTA: Repita 3 veces.
  3. Centrifugar el homogeneizado a 9710 x g durante 30 min a 4 °C.
  4. Recoja el sobrenadante como homogeneizado del gusano del maní para su posterior estudio.

2. Preparación del gel Fibrinógeno-PAGE

  1. Pesar 0,01 g de fibrinógeno en un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml.
  2. Agregue 1,9 mL de DDH2O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) y 0,05 mL de SDS (10%, p/v) en el vaso de precipitados; Mezclar bien pipeteando.
  3. Coloque el vaso a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Este paso es para disolver el fibrinógeno.
  4. Añadir 1,7 mL de acrilamida (30%, p/v), 0,05 mL de persulfato de amonio (APS; 10%, p/v), 0,002 mL de TEMED; Mezclar bien pipeteando.
    NOTA: Este es un gel separador.
  5. Vierte el gel separador en un molde de gel de 10 pocillos.
  6. Agregue 2 mL de DDH2O en el molde de gel; Espere 30 min.
  7. Retira bien el agua dando la vuelta al molde.
  8. Añada 1,4 mL de DDH2O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10 % p/v), 0,33 mL de acrilamida (30 % p/v), 0,02 mL de APS (10 % p/v), 0,002 mL de tetrametiletilendiamina (TEMED) en el vaso de precipitados; Mezclar bien pipeteando.
    NOTA: Este es gel de carga.
  9. Vierta el gel de carga en el mismo molde de gel que el paso 2.5; Inserte el peine inmediatamente.
    NOTA: El gel de fibrinógeno-PAGE utilizado aquí estaba compuesto por el fibrinógeno (0,2%) que contenía gel separador y gel de carga. La concentración de fibrinógeno se puede ajustar según sea necesario.

3. Electroforesis

  1. Coloque el gel de fibrinógeno-PAGE preparado junto con el molde de pegamento en el tanque de electroforesis; verter 1300 mL de solución de electroforesis (1,963 g de Tris, 12,22 g de glicina, 0,65 g de SDS y 1300 mL de DDH2O) en el tanque; Saca el peine.
  2. Agregue 5 μL de tampón de carga no desnaturalizante 5x a los 20 μL de sFE y 20 μL de homogeneizado de gusano de maní; mezclar bien por pipeteo; cárguelos en el gel de fibrinógeno-PAGE preparado.
    NOTA: No hierva la mezcla. La sFE es una enzima fibrinosa(geno)lítica identificadapreviamente como 6,7,8 y se utiliza como control positivo en este estudio. El homogeneizado del gusano del cacahuete es la muestra a detectar. Tampón de carga no desnaturalizante sin azul de bromofenol, β-mercaptoetanol y SDS comparado con el tampón de carga SDS-PAGE. Cada línea de muestra está separada con el tampón de carga 1x SDS-PAGE para detectar claramente el movimiento de la proteína.
  3. Realice la electroforesis a 80 V durante 30 min, o a 120 V durante 20 min.
  4. Retire el gel de fibrinógeno-PAGE del molde de pegamento.

4. Renaturalización

  1. Transfiera el gel de fibrinógeno-PAGE a una caja de plástico.
  2. Añada 100 mL de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) y 2 mL de Triton X-100 en la caja. Colócalo en una coctelera a 60-70 rpm durante 10 min.
  3. Retire el tampón de lavado mediante pipeteo.
    NOTA: Repita tres veces.

5. Incubación

  1. Agregue 50 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) en la caja de plástico.
  2. Incubar a 37 °C durante 4 h.
    NOTA: El tiempo de incubación se puede ajustar de acuerdo con la fuerza de la actividad fibrinogenolítica.

6. Manchas

  1. Retire el tampón de incubación mediante pipeteo.
  2. Agregue 50 mL de solución de tinción Coomassie Brillant Blue en la caja y coloque la caja en un agitador a 60-70 rpm durante 30 min.

7. Decoloración

  1. Retire la solución de tinción mediante pipeteo.
  2. Agregue 50 mL de DDH2O en la caja.
  3. Coloque la caja en una coctelera a 60-70 rpm durante 30 min.
    NOTA: Aquí se utilizó DDH 2O como solución destaining. El tiempo de agitación se puede ajustar de acuerdo con la fuerza de la actividad fibrinogenolítica.

Resultados

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Después de la electroforesis, se mostraron claramente todas las bandas del marcador. Los carriles de carga 1x SDS-PAGE solo mostraron bandas de 10 kDa (azul de bromofenol). Las muestras de sFE y gusano del maní no mostraron ninguna banda observable (Figura 1). Aunque las bandas de las muestras no son visibles, el rendimiento del marcador y del azul de bromofenol indicó que la electroforesis fue exitosa y las muestras se separaron según su peso molecular.

Aunque todo el gel se volvió azul debido a la tinción, la decoloración hizo que el área donde el fibrinógeno fue degradado por los agentes fibrinogenolíticos fuera transparente. En comparación con el marcador, el sFE indicó una banda fibrinogenolítica activa cercana a 25 kDa. El homogeneizado del gusano del maní mostró 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa y una serie de bandas mayores de 70 kDa (Figura 2). Los resultados indicaron que el sFE solo contenía un componente fibrinogenolítico de 25 kDa, pero el homogeneizado del gusano del maní contenía componentes de sFE y otros agentes fibrinogenolíticos. La Figura 1 complementaria es un ejemplo de una imagen en gel que muestra el marcador en azul profundo y las muestras objetivo como bandas brillantes.

figure-results-1
Figura 1: Gel después de la electroforesis. M: Marcador; Carril 1: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 2: sFE; Carril 3: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 4: homogeneizado de gusanos de maní; Carril 5: 1x búfer de carga SDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Gel después de la decoloración. M: Marcador; Carril 1: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 2: sFE; Carril 3: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 4: homogeneizado de gusanos de maní; Carril 5: 1x búfer de carga SDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Imagen de gel que muestra el marcador en azul profundo y las muestras objetivo como bandas brillantes. M: Marcador; Carril 1: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 2: sFE; Carril 3: 1x búfer de carga SDS-PAGE; Carril 4: homogeneizado de gusanos de maní; Carril 5: 1x búfer de carga SDS-PAGE. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sFE es una nueva enzima fibrino(geno)lítica aislada de gusanos del cacahuete por nuestro equipo previamente 3,6,8,13. Sin embargo, los procesos de identificación de sFE requirieron mucho tiempo y trabajo, e involucraron la detección de la actividad fibrinogenolítica, la separación de componentes proteicos y las etapas de confirmación de la actividad. Como método simple, el ensayo en placa de fibrinógeno se utiliza principalmente en la etapa de selección preliminar para verificar la actividad fibrinogenolítica de las muestras. Sin embargo, el método de ensayo en placa de fibrinógeno no puede separar qué componente está activo. Por lo tanto, se debe utilizar la cromatografía y la cromatografía nativa/SDS-PAGE para separar sus componentes después de la detección de la actividad. A continuación, los productos de reacción se resuelven de nuevo mediante el SDS-PAGE para confirmar la degradación del fibrinógeno del sustrato. En este trabajo, el sustrato fibrinógeno se añadió al gel PAGE para detectar el agente fibrinogenolítico. Después de la electroforesis, la renaturalización, la incubación, la tinción y la decoloración, el peso molecular y la actividad fibrinogenolítica de los agentes fibrinogenolíticos activos se mostraron claramente con el mismo gel. Con este método, detectamos con éxito más de un agente fibrinogenolítico activo a partir de homogeneizado de gusano de maní en 6 h.

Para lograr los resultados óptimos, se debe prestar más atención a la preparación, renaturalización e incubación del gel de fibrinógeno-PAGE. En términos generales, cuanto menor es la concentración de fibrinógeno, más incolora es la zona fibrinogenolítica, lo que indica la actividad fibrinogenolítica de los agentes. Sin embargo, cuanto menor es la concentración de fibrinógeno, más incoloro es el fondo y más difícil es distinguir la zona fibrinogenolítica del fondo. El tiempo de renaturalización afectará significativamente la actividad fibrinogenolítica de los componentes. Si este tiempo es demasiado corto para lavar la SDS en el gel PAGE, la actividad fibrinogenolítica de los componentes será inhibida por la SDS remanente. Del mismo modo, si el tiempo de incubación es demasiado corto, la reacción fibrinogenolítica no es completa. Si bien el tiempo de incubación es demasiado largo, el marcador utilizado para indicar el peso molecular se eliminará. En este estudio, aunque esas condiciones se han optimizado, estas condiciones se establecieron para separar y mostrar los agentes fibrinogenolíticos de los gusanos del maní. Por lo tanto, las condiciones personalizadas de esos pasos críticos deben establecerse de acuerdo con agentes fibrinogenolíticos específicos.

Es importante mencionar que este fibrinógeno-PAGE solo es adecuado para el cribado de los agentes fibrinogenolíticos con actividad lítica de fibrinógeno, pero no para los agentes con actividad lítica de fibrinógeno o actividad de activación del plasminógeno. Si queremos mostrar esas actividades, el método se puede optimizar reemplazando el fibrinógeno por fibrina o plasminógeno. Otro punto a destacar es que los agentes fibrinogenolíticos activos probados en este estudio fueron monómeros, que no se vieron afectados bajo la condición de electroforesis SDS. Por lo tanto, si los agentes probados son polímeros, este método debe ajustarse a una condición de PAGE nativo que no pueda mostrar el peso molecular. Por lo tanto, el método fibrinógeno-PAGE presentado aquí era solo una versión básica general, que se puede optimizar para detectar rápidamente los otros agentes fibrinogenolíticos.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (No. 3502Z20227197), la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Fujian (No. 2019J01070; No. 2022J01311), y Proyecto de Innovación y Emprendimiento de Talentos de Alto Nivel del Plan de Ciencia y Tecnología de Quanzhou (No. 2022C015R). Agradecemos a Fucai Wang (Universidad de Huaqiao) y Lei Tong (Universidad de Huaqiao) por su asistencia técnica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1  M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010
30% Acrilamida/Bis-acrilamidaBiosharpBL513B
Persulfato de amonioXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
Vaso de precipitadosPYREX2-9425-02
Tubo de centrífuga (1.5 mL)BiosharpBS-15-M
Incubadora de temperatura constanteJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Solución de tinciónBeyotimeP0017F
Balanza analítica electrónicaDENVERTP-213
FibrinógenoSolarbioF8051
Puntas de pipeta de carga de gel, a granelBiosharpBS-200-GTB
HomogeneizadorAHS ATS-1500
Oscilador de rotación horizontalNuoMiNMSP-600
Milli-Q ReferenciaMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetrametiletilendiaminaSigmaT9281
Punta de pipeta (1 mL)PuntaAxygene T-1000XT-C
(10 µ L)AxygeneT-10XT-C
(200 y micro; L)Pipeta AxygeneT-200XT-C
(1 mL)Pipeta Thermo Fisher ScientificZY18723
(10µ L)Pipeta Thermo Fisher ScientificZX98775
(200 y micro; L)Pipeta Thermo Fisher ScientificZY20280
(50 y micro; L)Thermo Fisher ScientificZY15331
Centrífuga refrigeradacenceH1650R
Dodecil sulfato de sodioSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200
de pipeta Punta de pipeta

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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