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Identificación de biomarcadores para la especificidad de género de la enfermedad de Alzheimer basada en los perfiles del transcriptoma glial

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DOI:

10.3791/66552

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20 de mayo de 2024

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1Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Shuangliu Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Automation, Tsinghua University, 4Affiliated Reproductive & Women-Children Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Central Hospital of Dalian University of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio analizó transcriptomas de un solo núcleo de treinta y tres individuos con enfermedad de Alzheimer (EA), revelando DEG específicos del sexo en las células gliales. El análisis de enriquecimiento funcional destacó las vías sinápticas, neuronales y relacionadas con las hormonas. Se identificaron genes clave, a saber, NLGN4Y y sus reguladores, y se propusieron posibles candidatos terapéuticos para la EA específica del género.

Resumen

Recientemente se han revelado muchos biomarcadores específicos del sexo en la enfermedad de Alzheimer (EA); sin embargo, rara vez se informaron células gliales cerebrales. Este estudio analizó 220.095 transcriptomas de un solo núcleo de la corteza frontal de treinta y tres individuos con EA en la base de datos GEO. Se identificaron genes expresados diferencialmente (DEG) específicos del sexo en las células gliales, incluidos 243 en astrocitos, 1.154 en microglía y 572 en oligodendrocitos. Los análisis de anotación funcional de Gene Ontology (GO) y los análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) revelaron concentraciones funcionales en vías sinápticas, neuronales y relacionadas con hormonas. La red de interacción proteína-proteína (PPI) identificó a MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D y NLGN4Y en astrocitos, TREM2, FOS, APOE, APP y NLGN4Y en microglía, y GRIN2A, ITPR2, GNAS y NLGN4Y en oligodendrocitos como genes clave. NLGN4Y fue el único gen compartido por las tres glías y se identificó como el biomarcador de la especificidad de género de la EA. La red correguladora de factor de transcripción génica (TF)-miRNA identificó reguladores clave para NLGN4Y y sus TCM objetivo. Se identificaron Ecklonia kurome Okam (Kunbu) y Herba Ephedrae (Mahuang), y se mostraron los efectos de los ingredientes activos sobre la EA. Finalmente, el análisis de enriquecimiento de Kunbu y Mahuang sugirió que podrían actuar como candidatos terapéuticos para la especificidad de género de la EA.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad mundial con alta incidencia, y representa el 60%-80% de la demencia1. A pesar de su alta incidencia, la patogenia mecanicista de la EA no está claramente delimitada, yhasta ahora no ha habido terapias efectivas 2. Las principales patologías en la EA fueron identificadas como la atrofia neuronal y la acumulación de residuos patológicos, principalmente la proteína Tau asociada a microtúbulos y β-amiloide (Aβ)3,4. La patogenia de la EA se asocia con autofagia anormal, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, inflamación y trastorno del metabolismo energético5. Las encuestas de prevalencia demostraron que dos tercios de los pacientes con EA eran mujeres6. Existen diferencias específicas por sexo en la EA en la etiología, las manifestaciones clínicas, la prevención y el tratamiento. Por lo tanto, revelar el mecanismo biológico que causa las diferencias específicas de sexo en la EA y dirigirse a la medicina tradicional china (MTC) puede proporcionar un marco teórico más completo para comprender la patogénesis de la EA y guiar aún más la estrategia de tratamiento precisa.

Las células neurogliales, especialmente la microglía, los astrocitos y los oligodendrocitos, pueden contribuir a la patogénesis de la EA. En la EA, la microglía se activa y se altera genéticamente, lo que contribuye a la respuesta inflamatoria, la fagocitosis y el aclaramiento de Aβ 7,8; El astrocito está alterado genéticamente, lo que afecta a la actividad sináptica, la homeostasis iónica y el metabolismo energético y lipídico9; Los oligodendrocitos están genéticamente alterados con la especificidad del sexo, lo que contribuye a la pérdida neuronal, ovillos neurofibrilares y lesiones de la sustancia blanca10,11.

En este estudio, empleamos la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) como una técnica superior. En comparación con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), el snRNA-seq ofrece ventajas en términos de riqueza de muestras, integridad del tipo de célula y fiabilidad de los datos12,13. El SnRNA-seq se ha utilizado ampliamente en estudios centrados en la EA y explorando el papel de las células gliales 14,15,16. Su amplia adopción en estas áreas de investigación pone de manifiesto su eficacia a la hora de proporcionar información valiosa sobre las características transcripcionales de las células gliales en la EA. Al aprovechar las ventajas de snRNA-seq, los investigadores han podido descubrir información crucial sobre la participación de las células gliales en la patología de la EA e identificar posibles objetivos terapéuticos. Con el fin de explorar las características transcripcionales neurogliales específicas del sexo en la EA y las posibles MTC para la especificidad sexual de la EA, este estudio analizó los datos de snRNA-seq de la corteza frontal de pacientes con EA de la base de datos pública NCBI GEO. Los genes expresados diferencialmente (DEG) específicos del sexo, la ontología génica (GO), la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), la red de interacción proteína-proteína (PPI) y la red gen-TF-miRNA se analizan más a fondo para revelar biomarcadores clave y una posible patogénesis. Por último, se sugirieron posibles MTC y se mostraron sus ingredientes activos en tablas mediante la búsqueda en las bases de datos Coremine Medical, TCMIP y TCMSP.

Protocolo

Los pasos 2 a 9 del análisis se implementaron utilizando el software R (ver Figura complementaria 1 y Archivo complementario 1), mientras que los pasos restantes se ejecutaron en las plataformas en línea. Los detalles de las bases de datos utilizadas en este protocolo (junto con los enlaces web) se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Adquisición de datos

  1. Acceda a la base de datos Ómnibus de Expresión Génica (GEO) disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica.
  2. Busque los datos GEO denominados Enfermedad de Alzheimer en el cuadro de búsqueda.
  3. Seleccione los Organismos superiores como Homo sapiens en el lado derecho.
    NOTA: Los resultados de la búsqueda fueron datos sobre la enfermedad de Alzheimer en Homo sapiens.
  4. Después de filtrar la información buscada, descargue los archivos de datos GSE167490 y GSE183068 , que abarcan features.tsv, barcode.tsv y matrix.mtx para cada muestra individual de núcleos individuales. Los conjuntos de datos comprendieron 34 muestras de EA originadas en la corteza frontal, con una distribución equitativa de 17 muestras de hombres y 17 muestras de mujeres (Tabla complementaria 1).

2. Fusión de muestras

  1. Configure las rutas de datos y los nombres de muestra en consecuencia en el equipo. Importe las 34 muestras descargadas y asigne nombres específicos de género a las muestras utilizando los nombres de función.
  2. Genere objetos Seurat para todas las muestras en un proceso por lotes utilizando la lista de funciones y Read10X, especificando los parámetros como min.cells = 3 y min.features = 200.
  3. Utilice la función RenameCells para agregar identificadores de muestra como prefijos a los códigos de barras de celda para conservar los códigos de barras de celda durante el proceso de combinación. Esto garantizó que cada célula conservara su identidad única y pudiera rastrearse hasta su fuente de muestra original después de la fusión.

3. Control de calidad (QC)

  1. Emplee la función PercentageFeatureSet para calcular las proporciones de genes mitocondriales, las proporciones de genes de eritrocitos y las proporciones de genes de ribosomas para cada célula.
  2. Almacene estas proporciones calculadas en los metadatos utilizando el operador [[ ]] para adjuntar esta información directamente a los metadatos de cada celda.
  3. Utilice la función de subconjunto para realizar la filtración de celdas, especificando los parámetros como nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 y percent. HB < 75.
  4. Excluir GSM5106107 del análisis.

4. Comprobación del efecto batch

  1. Realizar el procesamiento de datos.
    1. Normalice los datos mediante la función NormalizeData .
    2. Identifique las 2000 características de variables principales del conjunto de datos mediante la función FindVariableFeatures .
    3. Realice un análisis de componentes principales (PCA)17 sobre los datos utilizando RunPCA, conservando 50 componentes principales.
    4. Genere un diagrama de codo utilizando la función ElbowPlot para determinar el número óptimo de dimensiones para el análisis posterior. Considere las primeras 50 dimensiones.
    5. Escale los datos con ScaleData para asegurarse de que todas las características estén en una escala comparable.
    6. Identifique a los vecinos más cercanos mediante FindNeighbors en función de 30 dimensiones.
    7. Aplique el algoritmo UMAP mediante RunUMAP para reducir la dimensionalidad de los datos a 30 dimensiones.
  2. Visualice los datos procesados utilizando la función DimPlot con el parámetro de reducción establecido en umap y el parámetro group.by establecido en orig.ident.
    NOTA: Este paso podría generar un gráfico visualizando los datos en el espacio UMAP reducido, agrupados por las identidades de celda originales. Al examinar las parcelas UMAP, se hizo evidente que había una presencia de efecto lote. El agrupamiento o separación de células en función de su origen experimental o por lotes sugirió que los lotes experimentales habían influido en los perfiles de expresión génica.

5. Integración de datos

  1. Normalice y estandarice los datos mediante la función SCTransform .
  2. Aplique el algoritmo de armonía18 para integrar los 33 datos restantes de un solo núcleo. Utilice el ensayo SCT para la integración y establezca el número máximo de iteraciones de armonía en 20.
  3. Utilice la función FindClusters con un parámetro de resolución establecido en 0,07 para identificar clústeres distintos dentro de los datos.
  4. Emplee la función RunUMAP con un número especificado de dimensiones (dims = 30) para reducir aún más la dimensionalidad de los datos y visualizar los clústeres en un espacio de dimensiones inferiores.

6. Anotación del tipo de celda

  1. Recolectar los genes marcadores (Tabla suplementaria 2) de las células a través de una revisión extensa de la literatura existente.
  2. Tras la identificación de la heterogeneidad del grupo celular, clasifique el tipo de cada célula del grupo por los genes marcadores expresados específicamente.
  3. Presentamos varios tipos celulares con visualización UMAP utilizando el paquete ggplot2, donde se resaltó oligodendrocito con el código de color #DB7093, neurona excitadora con #FF69B4, astrocito con #1874CD, microglía con #63B8FF, célula precursora de oligodendrocitos con #DB7093, neurona inhibidora con #FFC0CB y célula endotelial con #FF69B4.
  4. Calcula las proporciones de cada tipo de celda estratificadas por género.

7. Extracción de datos de células gliales

  1. Extraiga los datos de astrocitos de los datos masivos integrados utilizando la función de subconjunto.
  2. Extraiga los datos de la microglía de los datos masivos integrados mediante la función de subconjunto.
  3. Extraiga los datos de oligodendrocitos de los datos masivos integrados mediante la función de subconjunto.

8. Captura de genes expresados diferencialmente (DEGs) específicos del sexo glial

  1. Identifique los DEG específicos del sexo de los astrocitos utilizando la función FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = femenino, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: valor p < 0,05 y |avg_log2FC| > 30. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
    1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando el avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron con el color PaleVioletRed, los genes regulados a la baja con Pink y los genes estables con DodgerBlue3.
  2. Identifique los DEG específicos del sexo de la microglía utilizando la función FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = femenino, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: valor p < 0,05 y |avg_log2FC| > 1. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
    1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando el avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron utilizando el color OrangeRed, los genes regulados a la baja con LightSalmon y los genes estables con SteelBlue1.
  3. Identifique los DEG específicos del sexo de los oligodendrocitos utilizando la función FindMarkers (ident.1 = macho, ident.2 = hembra, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: p-valor < 0,05 y |avg_log2FC| > 10. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
    1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando la avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron con el color DeepPink, los genes regulados a la baja con HotPink y los genes estables con DeepSkyBlue3.

9. Análisis de enriquecimiento funcional de DEGs específicos por sexo

  1. Realice análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) en DEG específicos del sexo para cada tipo de célula glial utilizando la función enrichGO . Establezca los siguientes parámetros: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 y qvalueCutoff = 0,05.
  2. Convierta los símbolos de genes en identificadores de genes correspondientes utilizando function bitr. Llevar a cabo un análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) sobre DEG específicos del sexo para cada tipo de célula glial mediante el uso de la función enrichKEGG . Ajuste la configuración de la siguiente manera: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0.01 y qvalueCutoff = 0.05.

10. Estadísticas de frecuencia de DEGs gliales en las vías go y kegg, diagramas de Venn de cada DEGs específico del sexo glial y construcción de redes PPI

  1. Calcule la frecuencia de DEGs específicas del sexo glial en las vías GO y KEGG utilizando un histograma de frecuencia.
  2. Acceda a la base de datos STRING para construir las redes PPI.
  3. Elija las proteínas múltiples. Busque la lista de nombres en el cuadro de búsqueda. Establecer "Organismos" como Homo sapiens.
  4. Revise la lista de proteínas obtenidas de la búsqueda. Haga clic en Continuar para continuar.
  5. Exporte las redes PPI seleccionando la opción de descarga , preferiblemente en formato PNG con mayor resolución.
  6. Visualice la distribución de la coexpresión de los principales genes específicos del sexo mediante el uso de los diagramas de Venn.
  7. Identifique los genes compartidos como genes clave en el estudio basándose en el análisis del diagrama de Venn.

11. Construcción de redes reguladoras multifactoriales

  1. Acceda a NetworkAnalyst.
  2. Haga clic en Entrada de lista de genes y especifique el organismo como H. sapiens (humano). Establezca el tipo de identificación como símbolo genético oficial. Ingrese el nombre del gen en el campo de búsqueda y luego haga clic en Cargar y continuar.
  3. Seleccione Interacciones gen-miRNA y elija miRTarBase v8.0. Confirme la selección haciendo clic en Aceptar.
  4. Vaya a Interacciones TF-gen y seleccione la base de datos ENCODE . Haga clic en Aceptar para confirmar la selección.
  5. A continuación, navegue hasta la red correguladora TF-miRNA y haga clic en Aceptar para continuar.
  6. Por último, elija Proceder para generar la red reguladora multifactorial incorporando interacciones gen-miRNA e interacciones TF-gen.

12. Análisis de genes y dianas de la MTC

  1. Acceda a la base de datos en línea de Coremine Medical.
  2. Ingrese el nombre del gen específico y seleccione el gen correspondiente con el sufijo gen/proteína, humano en el cuadro de búsqueda en la sección Explorar .
  3. Navegue por la sección Medicamentos e identifique las MTC asociadas con los medicamentos buscados.
    NOTA: Los fármacos estadísticamente significativos se marcaron en azul.
  4. Determine los cinco principales MTC en función de su valor de "importancia" como MTC terapéuticas.

13. Resumen de la investigación de los ingredientes de la MTC en la selección de genes clave

  1. Acceda a la Plataforma de Investigación Integral basada en Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMIP) y a la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP). Ingrese los nombres de las hierbas en la barra de búsqueda para recuperar sus ingredientes correspondientes.
  2. Recupere los ingredientes en la base de datos de PubMed con un límite de tiempo hasta el 10 deabril de 2023. Los términos de búsqueda utilizados incluyeron el nombre de la molécula en TCMSP y los componentes químicos en TCMIP como términos de búsqueda, y se limitaron a artículos publicados en inglés.
  3. Resumir y analizar las hierbas y sus ingredientes correspondientes que actúan sobre la EA.

14. Confirmación de la función del tratamiento de las MTC dirigidas a la especificidad sexual de la EA

  1. Importe hierbas en el TCMIP y navegue hasta la página de descripción correspondiente.
  2. Utilice la función Exportar datos y seleccione el formato CSV para descargar los términos de enriquecimiento de GO - Proceso biológico, GO - Componente celular, GO - Función molecular y Vía del reactoma.
  3. Visualice los términos de enriquecimiento descargados para cada hierba utilizando gráficos de barras.

Resultados

Análisis de secuenciación de SNNnARN de los perfiles del transcriptoma glial frontal y la anotación de los tipos celulares
En total, se obtuvieron 220.095 núcleos y 32.077 genes en la corteza frontal de 17 hombres y 17 mujeres (Figura 1A). El diagrama UMAP visualizó el total de transcriptomas frontales de un solo núcleo que mostraban distintos tipos de núcleos después del análisis de reducción de dimensiones (Figura 1B). Se mostró el número total de núcleos anotados capturados por género, lo que hizo la suma de 58.902 astrocitos, 14.265 microglías, 77.466 oligodendrocitos, 3.520 endoteliales, 25.252 neuronas excitadoras, 31.268 neuronas inhibidoras y 9.422 células progenitoras de oligodendrocitos (Figura 1C). Las expresiones promedio de los marcadores de tipo celular conocidos para cada glía se proyectaron en los gráficos UMAP para identificar las poblaciones celulares (Figura 1D).

Las DEGs específicas del sexo en los astrocitos
Se analizaron 58.902 núcleos astrocíticos (Figura 2A), de los cuales 27.504 correspondieron a hombres (46,69%) y 31.398 a mujeres (53,31%). Los DEG específicos del sexo revelaron una regulación positiva de 138 genes, incluidos DST, CACNA2D3 y AC016831.7, una regulación negativa de 105 genes, incluidos CNTN5, RORA, RASSF8 y CADM2, y 4995 genes sin cambios (Figura 2B). Además, los análisis de GO y KEGG identificaron que esos DEG se concentraban principalmente en las vías de las neuronas, las sinapsis y las hormonas, con vías neuronales que incluían la regulación del desarrollo del proyecto de neuronas, la columna vertebral de las neuronas, etcétera, vías sinápticas que incluían la organización sináptica y la sinapsis glutamatérgica/colinérgica, y vías hormonales que incluían la síntesis de hormonas tiroideas y la secreción de insulina (Figura 2C, D). Se obtuvieron treinta genes con alta frecuencia (Figura 2E), siendo PLCB1 el primero. Se construyeron redes PPI para explorar la relación entre estos genes (Figura 2F) y se identificaron DLG2, CAMK2D, CALM2 y PRKACB como genes centrales. Los gráficos UMAP mostraron diferencias con los DEG seleccionados: KCND2, CAMK2D, MT3, LINC00278 y XIST fueron mayores en la EA femenina y menores en la EA masculina, mientras que NLGN4Y, DLG2, PRKACB, CALM2, UTY y TTTY14 fueron opuestos (Figura 2G). MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PRKACB, CAMK2D y NLGN4Y se determinaron finalmente como DEG específicos del sexo de los astrocitos, como se muestra en la Tabla 1.

Los DEG específicos del sexo en la microglía
Se analizaron 14.265 núcleos microgliales (Figura 3A), de los cuales 5.327 (37,34%) procedían de la EA masculina y 8.938 (62,66%) de la EA femenina. Los DEG específicos del sexo revelaron una regulación positiva de 224 genes, incluidos KCNIP4 y LRRTM4, y una regulación negativa de 930 genes, incluidos APOE, MT-CO3 y FTL, y 13.111 genes sin cambios (Figura 3B). Además, los análisis de GO y KEGG identificaron que esos DEG se concentraban principalmente en las vías de las neuronas, el fagosoma, las hormonas y otros, con vías neuronales que incluían la sinapsis de neurona a neurona, vías fagocíticas que incluían el fagosoma y la regulación de la fagocitosis, vías hormonales que incluían la vía de señalización de estrógenos, vías de señalización de oxitocina, etcétera, y otras que incluían la regulación de la respuesta inflamatoria, el aprendizaje o la memoria, la eliminación de beta amiloide, etcétera. (Figura 3C,D). Se obtuvieron treinta genes con mayor frecuencia, con TLR2 y TREM2 empatados en el segundo lugar (Figura 3E). Se construyeron redes PPI para explorar la relación entre estos genes (Figura 3F) e identificaron a ACTB, APP y FYN como genes centrales. Los gráficos UMAP mostraron diferencias entre los DEG seleccionados: APP, FOS, XIST y CTSD fueron mayores en la EA femenina y menores en la EA masculina, mientras que NLGN4Y, TREM2, LINC0028, APOE, UTY y TTTY14 fueron opuestos (Figura 3G). Finalmente, se determinó que TREM2, FOS, APOE, APP y NLGN4Y eran DEG específicos del sexo de la microglía, como se muestra en la Tabla 2.

Los DEG específicos del sexo en los oligodendrocitos
Se analizaron 77.466 núcleos oligodendrocitos (Figura 4A), de los cuales 42.469 correspondieron a la EA masculina (54,82%) y 34.997 a la femenina (45,18%). Los DEG específicos del sexo revelaron una regulación positiva de 384 genes, incluidos PCDH9, MT-CO1, NEAT1 y NPAS3, una regulación negativa de 188 genes, incluidos FRMD4A, PLP1 y LSAMP, y los 76.894 genes restantes sin cambios (Figura 4B). Además, los análisis de GO y KEGG identificaron que esos DEG se concentraban principalmente en las vías de las neuronas, las sinapsis y las hormonas, con vías neuronales que incluían la columna vertebral de las neuronas, vías sinápticas que incluían la sinapsis de neurona a neurona y la sinapsis glutamatérgica/dopaminérgica, y vías hormonales que incluían la vía de señalización de neurotrofinas, la síntesis y secreción de aldosterona, la vía de señalización del calcio, etcétera (Figura 4C, D). Se obtuvieron treinta genes con mayor frecuencia (Figura 4E), con GRIN2A y PSEN1 empatados en el segundo lugar. Se construyeron redes PPI para explorar la relación entre estos genes (Figura 4F) e identificaron a GRIN2A y GRIA2 como genes centrales. Los gráficos UMAP mostraron diferencias en los DEG seleccionados: GRIN2A, ITPR2, GNAS y XIST fueron mayores en la EA femenina y menores en la EA masculina, mientras que NLGN4Y, UTY y TTTY14 fueron opuestos (Figura 4G). GRIN2A, ITPR2, GAS y NLGN4Y se determinaron finalmente como DEG específicos del sexo de los oligodendrocitos, como se muestra en la Tabla 3.

Interacción entre genes clave y los 30 genes principales de las células gliales, y NLGN4Y como el gen común compartido
Los diagramas de Venn y las redes PPI proporcionaron una visión general de la estrecha interacción entre los genes clave (Figura 5A, B) y los 30 genes principales (Figura 5C, D) de cada célula glial. Los resultados mostraron que ACYB, APP, JUN, PRKACB y DLG2 estaban en el núcleo de la red PPI, y NLGN4Y era un gen compartido común para DEG específicos del sexo en todas las células gliales.

Construcción de redes Gen-TF-miRNA
La red NLGN4Y-TF-miRNA contenía 13 nodos y 12 bordes (Figura 6A). NLGN4Y fue regulado por 1 TF, a saber, CTCF, y 11 miRNAs, incluyendo has-miR-185, has-miR-137 y has-miR-9.

Visualización del fármaco objetivo y las MTC de NLGN4Y con la red
Un total de 1 fármaco diana NLGN4Y y 64 MTC diana indirecta se recuperaron en Coremine Medical. Las MTC con significación estadística en los resultados se marcaron con azul. Se visualizó el fármaco Antitrombina III y cinco MTC con la red, a saber, Heikunbu, Wulingzhi, Xiazhicao, Shuizhi y Mahuang, que se consideraron estadísticamente significativas (Figura 6B).

Efectos de las MTC objetivo y los ingredientes activos correspondientes sobre la EA
En el caso de Kunbu, se recuperaron 10 ingredientes del TCMIP y 48 ingredientes del TCMSP. A través de la búsqueda en la base de datos PubMed, se recuperaron 5 ingredientes relacionados con la EA: fucosterol, saringosterol, tiamina, ácido estearidónico y phlorofucofuroeckol-A, de los cuales la biodisponibilidad oral (OB) de los dos primeros fue ≥30% y similar al sexo del fármaco (DL) fue de ≥0,18. Los detalles se muestran en la Tabla 4. En cuanto a Mahuang, se recuperaron 28 ingredientes en TCMIP y 363 ingredientes en TCMSP. Con el mismo método que el Kunbu, se recuperaron 25 ingredientes relacionados con la EA. Entre ellos, 6 ingredientes con OB ≥30% y DL ≥0.18: quercetina, eriodictyol, naringenina, taxifolina, estigmasterol y luteolina, se enumeran en la parte superior de la Tabla 5.

Red de enfermedades genéticas de Hurb y análisis de enriquecimiento
La red de enfermedades genéticas de Hurb se muestra en la Figura 6C. El gen diana compartido por Kunbu y Mahuang era el ACHE, cuyas enfermedades asociadas eran la EA y los déficits cognitivos. Los genes diana de Kunbu por sí solos fueron ALKBH3 y ELOVL4, enfermedades relacionadas con el envejecimiento y la atrofia cerebral, respectivamente.

Los resultados de los enriquecimientos de GO (BP, MF y CC) para Kunbu (Figura 7A, Figura 8A, Figura 9A) y Mahuang (Figura 7B, Figura 8B, Figura 9B) se muestran con gráficos de barras. También se muestran las vías del reactoma para Kunbu (Figura 10A) y Mahuang (Figura 10B). Los términos enriquecidos marcados con flechas estaban relacionados con el eje "hormona-sinapsis-neurona", como la actividad del receptor de hormonas esteroides, la proyección de neuronas y la vía de señalización mediada por hormonas esteroides en Kunbu y la transmisión sináptica química, la expresión génica dependiente de estrógenos y el proceso del sistema nervioso en Mahuang.

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Figura 1: Adquisición de datos de expresión génica, perfil de secuenciación de ARN de un solo núcleo y caracterización del tipo de célula. (A) Muestras obtenidas de conjuntos de datos GEO para la preparación del análisis. (B) Diagrama UMAP de 2 dimensiones de núcleos de suma (N = 116,101 para hombres; N = 103.994 para mujeres). (C) Proporciones para cada tipo de celda dividida por género. (D) Expresión promedio de 5 marcadores de tipo celular bien establecidos proyectados en el gráfico UMAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Los astrocitos son heterogéneos y tienen cambios transcriptómicos específicos del sexo en la enfermedad de Alzheimer. (A) Diagrama UMAP de núcleos astrocíticos (N = 59,010). (B) DEG específicos por sexo. (C,D) Los diagramas circulares ilustraron los términos funcionalmente enriquecidos significativos de las DEG astrocíticas obtenidos de las bases de datos GO y KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Las 30 DEG de sexo de astrocitos más frecuentes en las vías GO y KEGG. (F) Red PPI de los 30 DEG de sexo de astrocitos más frecuentes en las vías GO y KEGG. (G) Expresión promedio de DEGs notables específicos por sexo proyectados en las parcelas UMAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Las microglías son heterogéneas y tienen cambios transcriptómicos específicos del sexo en la enfermedad de Alzheimer. (A) Gráfico UMAP de núcleos microgliales (N = 14,265). (B) DEG específicos por sexo. (C,D) Los diagramas circulares ilustraron los términos funcionalmente enriquecidos significativos de las DEG microgliales obtenidos de las bases de datos GO y KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Las 30 DEG de microglía más frecuentes en las vías GO y KEGG. (F) Red PPI de los 30 DEG de microglía y sexo más frecuentes en las vías GO y KEGG. (G) Expresión promedio de DEGs notables específicos por sexo proyectados en las parcelas UMAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Los oligodendrocitos son heterogéneos y tienen cambios transcriptómicos específicos del sexo en la enfermedad de Alzheimer. (A) Diagrama UMAP de núcleos oligodendrocitos (N = 77,466). (B) DEG específicos por sexo. (C,D) Los diagramas circulares ilustraron los términos funcionalmente enriquecidos significativos de las DEG oligodendrocitas obtenidas de las bases de datos GO y KEGG (GO: C, KEGG: D). (E) Las 30 DEG de sexo oligodendrocito más frecuentes en las vías GO y KEGG. (F) Red PPI de los 30 DEG de sexo oligodendrocito más frecuentes en las vías GO y KEGG. (G) Expresión promedio de DEGs notables específicos por sexo proyectados en las parcelas UMAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Superposiciones de DEGs y redes PPI de DEGs de alta frecuencia. (A,B) Diagrama de Venn que ilustra los genes clave para cada glía y la red PPI correspondiente. (C,D) Diagrama de Venn que ilustra los 30 DEG específicos del sexo más frecuentes para cada glía enriquecida en las vías GO y KEGG y la red PPI correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Diagrama de red con NLGN4Y y sus TCMs objetivo como núcleo. (A) Red correguladora gen-TF-miRNA. (B) Red gen-fármaco-TCM para NLGN4Y. (C) Red de enfermedades genéticas de la MTC de Kunbu y Mahuang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Análisis de enriquecimiento de GO (BP) para Kunbu y Mahuang. (A) Los 20 principales procesos biológicos enriquecidos de Kunbu. (B) Los 20 principales procesos biológicos enriquecidos de Mahuang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis de enriquecimiento de GO (MF) para Kunbu y Mahuang. (A) Las 20 funciones moleculares enriquecidas principales de Kunbu. (B) Las 20 funciones moleculares enriquecidas principales de Mahuang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Análisis de enriquecimiento de GO (CC) para Kunbu y Mahuang. (A) Los 20 principales componentes celulares enriquecidos de Kunbu. (B) Los 20 principales componentes celulares enriquecidos de Mahuang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10: Vías del reactoma para Kunbu y Mahuang. (A) Vías del reactoma del Kunbu. (B) Vías del reactoma de Mahuang. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Genes clave de los DEGs específicos del sexo en los astrocitos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Genes clave de los DEG específicos del sexo en la microglía. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Genes clave de los DEGs específicos del sexo en oligodendrocitos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Ingredientes activos de Kunbu' en AD. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Ingredientes activos de Mahuang' en AD. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Captura de pantalla del uso del software R. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Ejemplo de información. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Genes marcadores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Fichero complementario 1: El código R. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Se ha identificado especificidad de género en epidemiología, patología y manifestación clínica de la EA19. Aquí, confirmamos el posible mecanismo patológico del "eje hormona-sinapsis-neurona" a partir de genes gliales específicos de género y vías relacionadas en pacientes con EA. NLGN4Y fue el único gen compartido en las tres glías y fue elegido como biomarcador para la especificidad de género de la EA. TF y miRNAs que regulan NLGN4Y estaban fuertemente relacionados con las diferencias de género y el desarrollo del sistema nervioso. Además, se consideró que las MTC diana Kunbu y Mahuang podían afectar al eje "hormona-sinapsis-neurona" y se identificó que actuaban como candidatas terapéuticas para la EA mediante la regulación de la especificidad de género.

El algoritmo Harmony proporcionó claras ventajas sobre otros algoritmos de integración al integrar datos en células raras, optimizar el uso de la memoria y la velocidad computacional para muestras grandes, y acomodar diseños experimentales complejos con diversas fuentes celulares y plataformas tecnológicas18. Las secciones de control de calidad e integración de datos fueron componentes críticos para mejorar la precisión y la fiabilidad del análisis, lo que permitió a los investigadores obtener conocimientos más profundos sobre la biología de la EA y otras enfermedades neurodegenerativas. La ejecución meticulosa de estos pasos es fundamental para lograr la calidad general y la validez de los resultados derivados de los experimentos de secuenciación de ARN de un solo núcleo.

Una de las modificaciones realizadas en este protocolo fue el uso de la función SCTransform para normalizar y estandarizar los datos20. Este paso garantizó que los datos fueran comparables y estandarizados para su posterior análisis. Para mitigar el efecto de lote, se tomó un paso adicional de integración de datos, lo que ayudó a corregir el efecto de lote y mejorar la precisión de los resultados. La resolución de problemas se llevó a cabo cuando una de las muestras (GSM5106107) mostró un rendimiento inusual en comparación con las otras muestras, y se excluyó del análisis.

Una limitación de este estudio se refiere al tamaño relativamente pequeño de la muestra empleada, lo que puede restringir la representatividad de los hallazgos a la población en general. Además, la utilización de datos de múltiples laboratorios y grupos de investigación introdujo una heterogeneidad inherente, lo que podría limitar la reproducibilidad y generalización de los resultados. Aunque la identificación de los factores reguladores clave para NLGN4Y se logró a través de una red correguladora gen-TF-miRNA, fue necesaria una verificación experimental adicional para determinar los roles funcionales y los mecanismos subyacentes atribuidos a estos factores reguladores. Si bien el análisis de enriquecimiento sugirió que Mahuang y Kunbu eran candidatos potenciales para el tratamiento de la EA específico de género, confiar únicamente en las predicciones bioinformáticas fue insuficiente para establecer su eficacia y seguridad. Experimentos y estudios clínicos adicionales fueron imprescindibles para validar los efectos terapéuticos de estos prometedores fármacos.

El enfoque delineado en este estudio exhibió un potencial considerable para diversos dominios de investigación, particularmente en el discernimiento de DEG específicos del sexo dentro de las células gliales en la EA. Estas investigaciones son prometedoras para dilucidar las disparidades patogénicas matizadas entre hombres y mujeres, lo que facilita la formulación de intervenciones terapéuticas específicas para cada sexo. Además, la aplicabilidad del método se extendió a otras enfermedades neurodegenerativas, ofreciendo oportunidades para identificar DEG específicos del sexo y aumentar la comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades.

En conclusión, el estudio presentó un protocolo completo y sólido para analizar los datos de secuenciación de ARN de un solo núcleo de pacientes con EA, lo que podría allanar el camino para el desarrollo de intervenciones terapéuticas personalizadas. Además, la metodología empleada en este estudio puede extenderse a otras enfermedades neurodegenerativas, ofreciendo oportunidades para descubrir patrones de expresión génica específicos del sexo y profundizar en la comprensión de estas enfermedades complejas.

Divulgaciones

No hay conflicto de intereses en este manuscrito y todos los autores han aprobado el envío para su publicación.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Jessica S. Sadick, Michael R. O'Dea, Philip Hasel, etcetera., por proporcionar el GSE167490 conjunto de datos. Los autores aprecian que Faten A Sayed, Lay Kodama, Li Fan, etcetera., ofrezcan el conjunto de datos GSE183068. Los autores agradecen a Shuqing Liu por la ayuda con el análisis de datos y a Wen Yang por proporcionar la plataforma de análisis de datos. Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82174511), los becarios de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, el Programa de Mejora de la Investigación del Talento Disciplinario (QJJJ2022001), el Programa de Talentos de Revitalización de LiaoNing (XLYC 1807083), el Fondo de Medicina y Hierbas Chinas de la Oficina de Administración de Sichuan (2023MS578), el Proyecto Nacional de Capacitación en Innovación y Emprendimiento de Pregrado (202310633003X) y Temas innovadores de la práctica de investigación científica para estudiantes universitarios en la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (ky-2023100). Hanjie Liu y Hui Yang contribuyeron al diseño del estudio, la recopilación, la interpretación de los datos, la redacción y la revisión del manuscrito. Shuqing Liu y Siyu Li participaron en el diseño del estudio, la recopilación de datos y la redacción del manuscrito. Wen Yang y Anwar Ayesha fueron responsables de la recopilación e interpretación de los datos. Xin Tan preparó figuras y/o tablas. Cen Jiang, Yi Liu y Lushuang Xie concibieron el estudio y revisaron/editaron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión presentada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Database
Coremine Medical databaseDesarrollado conjuntamente por Noruega, la Academia China de Ciencias, la Academia China de Ciencias Médicas, la Biblioteca Médica Nacional de los Estados Unidos y otras institucionesCuando explora conceptos en CoreMine Medical, accede a una base de datos que está estructurada para relacionar conceptos importantes, clasificados por relevancia estadística, a su tema. Por ejemplo, si escribe "enfermedad de Alzheimer", además de recuperar documentos y recursos que tratan sobre la enfermedad, podrá ver redes y listas que muestran cómo se relaciona su concepto de consulta con otros conceptos biomédicos. Esto proporciona una visión general de los conceptos que se relacionan con su búsqueda, además de ser una interfaz para navegar por la información sobre estos conceptos.
Enlace web: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)Centro Nacional de Información Biotecnológica en los Estados Unidos (NCBI)GEO es un repositorio público de datos genómicos funcionales que admite presentaciones de datos que cumplen con MIAME. Se aceptan datos basados en matrices y secuencias. Se proporcionan herramientas para ayudar a los usuarios a consultar y descargar experimentos y perfiles de expresión génica seleccionados.
Enlace web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Plataforma de Investigación Integrada de Medicina Tradicional China basada en Farmacología (TCMIP, versión: 2.0)NingunoIntroducción a la Plataforma de Investigación Computacional en Red Integrada Basada en Farmacología para la Medicina Tradicional China [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) Es una minería de datos inteligente plataforma basada en la base de datos en línea de la Enciclopedia de Medicina Tradicional China (ETCM), que integra la gestión de big data médico y los servicios de computación farmacológica. Su objetivo es revelar la connotación científica de la teoría de la medicina tradicional china y el valor científico del pensamiento original en la medicina tradicional china, resumir y transmitir la experiencia de médicos famosos, controlar la calidad de la medicina tradicional china, explicar los principios de la acción de la medicina tradicional china, la investigación y el desarrollo de la nueva medicina china, especialmente el descubrimiento y la optimización de combinaciones de medicamentos modernos, Proporcionar una base de datos sólida y herramientas analíticas. Sobre la base de TCMIP v1.0, se implementa una actualización integral, que incluye cinco bases de datos principales y siete módulos funcionales. A través de la integración de sistemas y la integración de módulos, se puede lograr rápidamente un análisis exhaustivo de la correlación multinivel de la red de interacción de "prescripción de síndrome de enfermedad". Como plataforma inteligente de minería de datos, TCMIP v2.0 proporcionará una sólida base de datos y una plataforma de análisis para revelar la connotación científica de la teoría de la medicina tradicional china y el valor científico del pensamiento original en la medicina tradicional china, resumiendo y heredando la experiencia de médicos famosos, control de calidad de la medicina tradicional china, dilucidando los principios de la acción de la medicina tradicional china, investigación y desarrollo de nuevos medicamentos de medicina tradicional china, especialmente el descubrimiento y la optimización de combinaciones de medicamentos modernos.
Enlace web: http://www.tcmip.cn/TCMIP 
NetworkAnalystNoneNetworkanalyze es una plataforma de análisis de visualización en línea para el análisis y metaanálisis de la expresión génica. Puede realizar análisis comparativos, cuantitativos, diferenciales y de enriquecimiento de la expresión génica, análisis de interacción proteína-proteína, análisis de integración de múltiples conjuntos de datos, y también puede dibujar imágenes de alto valor como PCA, diagrama de red de interacción proteína-proteína, mapa de calor, diagrama de volcanes, diagrama de Wayne, etc.
Weblink: Base
de datos https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ PubMedCentro Nacional de Información Biotecnológica en los Estados Unidos (NCBI)La base de datos Pubmed es una base de datos de literatura biomédica mantenida por la Biblioteca Nacional de Medicina (NLM) en los Estados Unidos, destinada a proporcionar los últimos resultados de investigación médica a científicos, médicos, investigadores y estudiantes de todo el mundo. Esta base de datos recopila literatura biomédica de todo el mundo, incluidos artículos de revistas, documentos, libros, etc. Hasta ahora, la base de datos Pubmed ha recopilado más de 30 millones de artículos y se actualiza continuamente cada semana.
Enlace web: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R softwareRoss Ihaka y Robert Gentleman Res un lenguaje y un entorno para la computación estadística y los gráficos. Es un proyecto GNU que es similar al lenguaje y entorno S que se desarrolló en los Laboratorios Bell (anteriormente AT& T, ahora Lucent Technologies) de John Chambers y colegas. R se puede considerar como una implementación diferente de S. Hay
algunas diferencias importantes, pero gran parte del código escrito para S se ejecuta sin alteraciones en R.
Weblink: https://www.r-project.org/
Plataforma de análisis y base de datos de farmacología de sistemas de medicina tradicional china (TCMSP)Zhejiang Jiuwei Health Co., LtdTCMSP no es solo un repositorio de datos, sino también una plataforma de análisis para que los usuarios estudien exhaustivamente las medicinas tradicionales chinas (MTC): incluida la identificación de los componentes activos, el cribado de las dianas farmacológicas y la generación de redes de compuestos-dianas-enfermedades, así como la información farmacocinética detallada sobre la similitud con los fármacos (DL), la biodisponibilidad oral (OB), la barrera hematoencefálica (BBB), la permeabilidad epitelial intestinal (Caco-2), ALogP, el área de superficie fraccional negativa (FASA-) y el número de   Enlace H  donante/aceptante   (Hdon/Hacc). Hasta ahora, TCMSP ha atraído una amplia atención y varios grupos han publicado más de 10 artículos utilizando nuestra base de datos TCMSP en aproximadamente un año.
Weblink: https://tcmsp-e.com

Referencias

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