Artículo de método

Papel de las células T CD4 en la encefalomielitis autoinmune experimental remitente-recurrente

DOI:

10.3791/66553

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19 de enero de 2024

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Institute of Neurological Diseases, First People's Hospital of Shizuishan, 4Department of Neurology, Xianyang Hospital of Yan’an University, 5Department of Pharmacy, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, 6Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se empleó un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) en ratones para investigar el papel de las células T CD4 en la introducción y recaída de EAE desde la perspectiva de la fase de activación y la función del efecto inmune.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la infiltración de células inmunitarias y la desmielinización en el sistema nervioso central (SNC). La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como modelo animal prototípico para el estudio de la EM. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar el papel de los linfocitos T CD4 en el inicio y la recaída de la EAE, centrándonos en la fase de activación y la respuesta inmunitaria. Para crear el modelo de ratones EAE, se inmunizaron ratones hembra con glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)35-55 emulsionada con adyuvante de Freund completo (CFA). Las puntuaciones clínicas se evaluaron diariamente y los resultados demostraron que los ratones del grupo EAE presentaban un patrón clásico de recaída-remisión. El análisis de tinción de hematoxilina-eosina (H&E) y luxol fast blue (LFB) reveló una infiltración significativa de células inflamatorias en el SNC y desmielinización en ratones EAE. En cuanto a la fase de activación, tanto los linfocitos T efectores CD4+CD69+ como los linfocitos T (Tem) efectores CD4+CD44+CD62L- pueden contribuir al inicio de la EAE, sin embargo, la etapa de recaída probablemente estuvo dominada por los linfocitos Tem CD4+CD44+CD62L- . Además, en términos de función inmunitaria, las células T (Th)1 colaboradoras están principalmente implicadas en el inicio de la EAE. Sin embargo, tanto las células Th1 como las Th17 contribuyen a la etapa de recaída, y la función inmunosupresora de las células T reguladoras (Treg) se inhibió durante el proceso patológico de EAE.

Introducción

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La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) y la desmielinización 1,2. Un estudio reciente ha demostrado que es la enfermedad discapacitante más común que afecta a los jóvenes, con una incidencia en continuo aumento en todo el mundo3. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal prototípico de EM que simula muchos aspectos de la fase inflamatoria de la EM humana4. Desde el punto de vista de las funciones inmunitarias, las células T CD4 iniciales que aún no han encontrado antígenos se denominan células T(Th) 0 auxiliares. Estas células se someten a procesos de maduración y activación para exhibir diversas funciones. Las células T CD4 se pueden clasificar en varios subconjuntos según sus funciones específicas, que incluyen células Th1, Th2, T reguladoras (Treg), T auxiliares foliculares (Tfh), Th17, Th9 y Th225. Es un consenso común que los subtipos de células Th1 y Th17 son factores de patogénesis cruciales de EAE6. Las células Th1 podrían secretar interferón γ (IFN-γ), y las células Th17 secretan interleucina (IL)-17 y otros factores inflamatorios, que podrían activar otras células inmunitarias como las células microgliales y los astrocitos. Estas células producen citocinas inflamatorias7, como IL-18, IL-12, IL-23 e IL-1β, que podrían inducir aún más la respuesta inmunitaria de las células Th1/Th17, lo que resulta en una desmielinización progresiva y daño axonal. Desde la perspectiva de la fase de activación, las células T CD4 poseen un destino predeterminado para desarrollarse en distintos subconjuntos celulares y estados diferenciados, incluidos los linfocitos T naïve, efector y de memoria8. Las células T CD4 iniciales proliferan y se diferencian en una variedad de subconjuntos efectores con diferentes funciones en diferentes ambientes9. La mayoría de las células efectoras son de vida corta, con una pequeña población de células T que se convierten en células T de memoria que exhiben funciones efectoras rápidas cuando se vuelven a encontrar con los mismos antígenos y proporcionan al huésped una protección altamente potente y a largo plazo10,11.

Aunque la investigación actual sugiere que las células T CD4 desempeñan un papel importante en el desarrollo de la EAE, todavía no está claro cómo los diferentes subconjuntos de células T CD4, clasificados en función de su fase de activación y función de efecto inmunitario, contribuyen al inicio y la recaída de la EAE. En el presente estudio, establecimos el modelo EAE en ratones C57BL6/J mediante la inmunización del péptido 35-55 de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) e investigamos el inicio y la recaída de EAE, centrándonos en la fase de activación y la función inmune de las células T CD4.

Protocolo

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Un total de 18 ratones hembra C57BL/6J de entre seis y ocho semanas de edad se dividieron aleatoriamente en un grupo de control (n = 6) y un grupo EAE (n = 12) para este estudio. Los ratones se compraron en el centro de animales de experimentación de la Universidad Médica de Ningxia. Los ratones se alojaron en una habitación con temperatura y humedad controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y libre acceso a agua dulce y alimentos. Se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Ningxia antes de que comenzara el estudio.

1. Desarrollo de EAE remitente recurrente en ratones C57BL/6

  1. Disolución de reactivos
    1. Disuelva 5,4 mg de MOG35-55 (Tabla de materiales) en 1,8 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pesar 12,6 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (Tabla de Materiales) y añadirlo a 1,8 mL de solución completa de adyuvante de Freund (CFA) (Tabla de Materiales). Disuelve 360 μL de toxina pertussis (PTX; Tabla de Materiales) en 7,2 mL de PBS utilizando una pipeta (Tabla de Materiales).
  2. Preparación de la emulsión de MOG35-55 y CFA
    1. Pipetee la solución MOG35-55 y la solución CFA utilizando dos jeringas de 5 mL preparadas en el paso 1.1 y conéctelas con una válvula en T. Mezclar continuamente en hielo durante 1 h hasta obtener una emulsión lechosa de agua en aceite.
      NOTA: La emulsión se prepara con éxito cuando está flotando en la superficie del agua sin dispersarse después de dejarla caer en el agua.
  3. Anestesia del ratón
    1. Desenrosque la tapa del sello de llenado en el extremo delantero del evaporador de la máquina de anestesia. Vierta lentamente 20 ml de isoflurano a lo largo del tornillo de sellado en el centro y bloquee la tapa del sello de llenado. Cambie el interruptor de la válvula en T para asegurarse de que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia se comunique con la caja de inducción de anestesia (Tabla de materiales).
    2. Conecte la fuente de alimentación de la bomba de aire, encienda el interruptor de la bomba de aire y gire y ajuste la válvula de la fuente de aire en el extremo delantero del medidor de flujo de oxígeno para que el flujo de gas de salida sea de 400 mL / min. Abra el evaporador, ajuste la concentración de inducción al 3% y espere a que el anestésico llene la caja de inducción.
    3. Aproximadamente 1 minuto después, coloque a los ratones en la caja de inducción, luego cierre la caja de inducción y espere a que los ratones estén en sueño profundo, relajación muscular y respiración constante; luego, se pudo determinar a los ratones como el estado ideal de anestesia (Tabla de Materiales).
      NOTA: Cambie el interruptor de la válvula en T para asegurarse de que el flujo de aire del evaporador de la máquina de anestesia se comunique con la máscara de anestesia hasta que los ratones estén completamente anestesiados.
  4. Inmunización con ratones
    1. Inyectar por vía subcutánea 200 μL de emulsión preparada en el paso 1.2 con una jeringa de 1 mL con la aguja en cuatro puntos del dorso del ratón, a unos 0,5 cm a ambos lados de la columna vertebral en el plano de la axila e ingle12 en los ratones del grupo EAE. Utilice 50 μL de emulsión en cada sitio (Tabla de Materiales).
  5. Inyección PTX
    1. Saca a los ratones de la jaula atrapando la cola y colócala en el alambre de la jaula. Sostenga la cola de los ratones con los dedos 4º y 5º y tire suavemente hacia arriba para mantener la tendencia del cuerpo y las extremidades hacia adelante. Agarra la cabeza de los ratones y captura la piel de la parte posterior de los ratones con los dedos medio y anular.
    2. A las 0 h y 48 h después de la inmunización en el paso 1.4, inyecte 200 μl de PTX por vía intraperitoneal a una posición de 0,5 cm a lo largo de cada lado de la línea abdominal media con una profundidad de penetración de 1-2 cm utilizando una jeringa de 1 ml con aguja (tabla de materiales).
      NOTA: Antes de inyectar PTX a las 48 h después de la inmunización de MOG35-55, es necesario anestesiar a los ratones utilizando los procedimientos descritos en el paso 1.3. Los ratones deben ser atendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
    3. En el caso de los ratones del grupo de control, se debe tratar con solución salina utilizando el mismo método y evaluar la puntuación clínica diariamente.
      NOTA: Los ratones fueron evaluados para detectar signos de EAE de acuerdo con la siguiente escala13: 0 = sin síntomas de enfermedad, 1 = parálisis completa de la cola, 2 = parálisis/debilidad parcial de la parte posterior, 3 = parálisis completa de las extremidades posteriores, 4 = parálisis de las extremidades delanteras y traseras, y 5 = estado moribundo.

2. Análisis histológico de la tinción

  1. Colección de cerebros
    1. Anestesiar a los ratones siguiendo el paso 1.3. Sacrificar a los ratones por dislocación cervical y abrir el tórax para exponer el corazón por completo. Cortar la aurícula y perfundirla lentamente con una solución salina preenfriada utilizando una jeringa de 20 ml con aguja en el ventrículo izquierdo hasta que el hígado se vuelva gris y blanco.
    2. Perfundir lentamente con paraformaldehído al 4% hasta que la punta de la cola se levante, el cuerpo se vuelva rígido y el hígado se endurezca. Decapitar la cabeza, cortar el cráneo, recoger el cerebro con pinzas y fijarlo en solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h (Tabla de Materiales).
  2. Preparación de secciones de parafina
    1. Deshidratación en gradiente: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.1 sucesivamente en etanol al 70% durante 1 h, etanol al 80% durante 1 h, etanol al 95% durante 1 h, etanol anhidro durante 1 h, reemplácelo con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 1 h (Tabla de materiales).
    2. Transparencia: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.2.1 en xileno durante 30 minutos, reemplácelos con xileno fresco y continúe sumergiendo hasta que los tejidos estén transparentes (Tabla de materiales).
    3. Incrustación: Incrustar los tejidos cerebrales del paso 2.2.2 en parafina durante 1 h, sustituirlos por parafina fresca, continuar incrustando durante 1 h, cortar en rodajas de 6 μm después de la liberación del molde, colocar el portaobjetos en agua caliente, secar a 37 °C, almacenar a temperatura ambiente (Tabla de materiales).
    4. Desparafinado: Sumerja los tejidos cerebrales del paso 2.2.3 en xileno durante 20 minutos, reemplácelos con xileno fresco, continúe sumergiendo durante 20 minutos, colóquelos en etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, sumérjalos durante 5 minutos, etanol al 75% durante 5 minutos, enjuague con agua del grifo (Tabla de materiales).
    5. Tinción con hematoxilina-eosina (H&E): Teñir los tejidos del paso 2.2.4 con una solución de hematoxilina durante 3-5 minutos y luego enjuagar con agua del grifo. Tratar los tejidos con una solución de diferenciación de hematoxilina, brevemente y enjuagar abundantemente con agua del grifo. Trate los tejidos con hematoxilina Scott solución azulada para grifos y enjuague con agua del grifo. Sumergir en etanol al 85% durante 5 min y en etanol al 95% durante 5 min, y teñir los pasos con tinte de eosina durante 5 min (Tabla de Materiales).
    6. Deshidratar: Sumerja los tejidos del paso 2.2.5 sucesivamente en etanol anhidro durante 5 min, reemplácelos con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 5 min, reemplace con etanol anhidro fresco, sumerja durante 5 min, xileno durante 5 min, reemplace con xileno fresco, sumerja durante 5 min, selle con goma neutra (Tabla de materiales).
    7. Observar con un microscopio los tejidos cerebrales y realizar la adquisición y el análisis de imágenes (Tabla de Materiales).

3. Análisis de tinción de LFB

  1. Recolección de la vaina de mielina: Corte la columna vertebral de los ratones desde el terminal de la cabeza hasta 2 segmentos hasta el terminal de la cola 2 segmentos, sople la médula espinal hasta el terminal de la cola y fije la médula espinal en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h.
    NOTA: La vaina de mielina se extrajo de los mismos ratones en el paso 2.1, y los pasos para la perfusión cardíaca son los mismos que en 2.1.
  2. Desparafinación y rehidratación de los trozos de parafina: Coloque los portaobjetos del paso 3.1 sucesivamente en xileno durante 20 minutos, reemplácelos con xileno fresco, continúe sumergiendo durante 20 minutos, etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, sumerja durante 5 minutos, alcohol al 75% durante 5 minutos, lave con agua del grifo.
  3. Tinción azul rápida: Coloque la solución de tinción azul rápida A de luxol en un horno a 60 °C y precaliente durante 30 min. Coloque los portaobjetos del paso 3.2 en la solución A y cúbralos con una membrana de plástico durante 1 h para evitar que las rodajas se sequen, luego saque los portaobjetos y lávelos rápidamente con agua del grifo.
  4. Diferenciación de fondo: Coloque los portaobjetos del paso 3.3 en la solución de tinción azul rápida de luxol B durante 2 s (mientras el tinte está caliente) y sumérjalos directamente en la solución de tinción azul rápida de luxol C para la diferenciación durante 15 s, lave con agua hasta que la vaina de mielina esté azul y el fondo esté casi incoloro.
  5. Contratinción de eosina: Coloque los portaobjetos del paso 3.4 en el horno a 65 °C para su secado. Una vez hechos, retíralos del horno y déjalos enfriar. Coloque los portaobjetos en una contratinción de etanol y eosina al 95% durante 1 min.
  6. Deshidratación y sellado: Coloque los portaobjetos del paso 3.5 sucesivamente en etanol anhidro durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco, continúe sumergiendo durante 5 minutos, reemplácelos con etanol anhidro fresco nuevamente, continúe sumergiendo durante 5 minutos, xileno 5 minutos, reemplácelos con xileno fresco, sumerja durante 5 minutos. Lavar y secar las muestras y sellarlas con goma neutra.
  7. Examen microscópico: Recolectar y analizar imágenes usando un microscopio óptico vertical (Tabla de Materiales).

4. Análisis de citometría de flujo

  1. Abre la cavidad abdominal de los ratones. Extraiga el bazo con unas pinzas y pique en trozos pequeños de 1,5-2,5 cm en PBS sobre hielo con unas tijeras. Muela el bazo en 10 mL de RPMI-1640 que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) usando un pistón de jeringa de 2.5 mL y empújelo a través de un filtro de celdas de 70 μm para obtener una suspensión de una sola celda (Tabla de materiales).
    NOTA: Los bazos se extrajeron de los mismos ratones en el paso 2.1.
  2. Transfiera la suspensión obtenida en el paso 4.1 a tubos de 15 mL y lise usando 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos en hielo durante 10 min. Lavar con RPMI-1640 que contiene 2% de FBS, centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con RPMI-1640 que contiene 2% de FBS.
  3. Cuente las celdas con un contador automático de celdas (Tabla de materiales) y ajuste la concentración a 1 x 106 celdas/mL.
  4. Pipetear 100 μL de suspensión celular en tubos de 1,5 mL e incubar con 1 μL de anticuerpo anti-ratón CD16/3214 (0,5 mg/mL) durante 30 min para bloquear la tinción inespecífica. Lavar con RPMI-1640 y centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 100 μL de RPMI-1640 que contienen 2% de FBS.
  5. Tinción con anticuerpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) y CD69 (BV674) para células Teff15 durante 30 min, 2 μL para cada anticuerpo. Tinción con anticuerpos específicos para CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) y CD62L (PE) para células madre16 durante 30 min, 2 μL para cada anticuerpo. Lavar con RPMI-1640 y centrifugar a 350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 350 μL de PBS. Analice la proporción de celdas utilizando un citómetro de flujo y el software asociado (Tabla de materiales).

5. Análisis de citoquinas por matriz de perlas citométricas

  1. Utilice la matriz de perlas citométricas (Tabla de materiales) para medir IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IFN-γ en cerebros de ratones, métodos como se describe a continuación.
  2. Recoja el cerebro del ratón como se describe en el paso 2.1.
  3. Extracción de proteína total: Cortar y pesar 50 mg de tejido cerebral (tres cerebros en el grupo control, grupo EAE en la etapa pico y etapa RR). Coloque los cerebros en tubos de 1,5 ml y agregue 500 μl de tampón de lisis que contiene PMSF, inhibidor de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa.
  4. Cortar los sesos en trozos pequeños de alrededor de 1 mm3, extraer mediante homogeneizador ultrasónico a 400 W, 5 s ON y 5 s OFF; Repita por 5 veces. Coloque el tubo en hielo durante 10 min, centrifugue a 12000 x g durante 5 min, y recoja el sobrenadante (Tabla de Materiales).
  5. Prepare los patrones de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón como se describe a continuación.
    1. Abra un vial de ratón liofilizado con patrones Th1/Th2/Th17. Transfiera los patrones a un tubo cónico de polipropileno de 15 mL. Etiquete la parte superior del tubo como estándar.
    2. Reconstituya los patrones en 2,0 mL de diluyente de ensayo. Deje que el patrón reconstituido se equilibre durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mezcle suavemente la proteína reconstituida mediante pipeteo.
    3. Etiquete los tubos de 12 mm x 75 mm y colóquelos en el siguiente orden de dilución: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 y 1:256. Pipetear 300 μL de diluyente de ensayo en cada tubo marcado.
    4. Realizar diluciones en serie: Transfiera 300 μL del estándar superior al tubo de dilución 1:2 y mezcle bien mediante pipeteo. Continúe las diluciones en serie transfiriendo 300 μL del tubo 1:2 al tubo 1:4 y así sucesivamente hasta el tubo 1:256. Prepare un tubo de 12 mm x 75 mm que contenga solo el diluyente del ensayo para que sirva como control negativo de 0 pg/mL.
      NOTA: Mezcle bien pipeteando. No haga vórtice para evitar que el acoplamiento de anticuerpos en las microperlas se caiga.
    5. Para mezclar las perlas de captura de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón, prepare 19 tubos, incluidos los estándares, con 3 muestras en cada grupo (grupo de control, grupo EAE en etapa pico y etapa RR) para el experimento. Agite la suspensión de la cuenta de captura vigorosamente durante 5 s antes de mezclar. Agregue 190 μL de cada perla de captura en un solo tubo y etiquételo como perlas de captura mixtas. Agita bien la mezcla de cuentas.
      NOTA: Las perlas conjugadas con anticuerpos se asentarán fuera de la suspensión con el tiempo. Es necesario vórtice el vial antes de tomar una alícuota de suspensión de perlas.
    6. Para realizar el ensayo, haga un vórtice de las perlas de captura de la mezcla. Añada 50 μL de perlas a todos los tubos de ensayo. Añadir 50 μL de diluciones estándar de citocinas Th1/Th2/Th17 de ratón a los tubos de control como se muestra en la Tabla 1.
    7. Añada 50 μL del reactivo de detección de PE Th1/Th2/Th17 de ratón a todos los tubos de ensayo. Incubar los tubos de ensayo durante 2 h a temperatura ambiente y protegerlos de la luz. Añada 1 ml de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugue a 200 x g durante 5 min. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo de ensayo.
    8. Añada 300 μl de tampón de lavado a cada tubo de ensayo para volver a suspender el gránulo de perlas. Analice los datos de citocinas Th1/Th2/Th17 del ratón utilizando el software FCAP Array (Tabla de materiales).

  

Resultados

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Evaluación de las puntuaciones clínicas
Como se muestra en la Figura 1, los ratones del grupo control no mostraron ningún síntoma clínico. Los ratones del grupo EAE, que fueron inmunizados con MOG35-55, mostraron parálisis de la cola aproximadamente 12 días después de la inmunización. Para el día 16, los síntomas alcanzaron la parálisis completa de las extremidades traseras (definida como etapa máxima, Peak). Después de eso, los síntomas remitir gradualmente. Los síntomas clínicos de los ratones se agravaron alrededor del día 25 y alcanzaron la parálisis completa de las extremidades posteriores aproximadamente el día 30 (definida como una etapa recurrente, RR). En particular, los síntomas duraron más que el tiempo anterior, que desarrolló una característica clásica de recaída-remisión. La principal manifestación de la EAE remitente-recurrente es que los ratones experimentan diferentes estadios de brote, remisión y recaída durante la progresión de la enfermedad, que tienen una cierta periodicidad y fluctuación.

Análisis histológico
Los ratones del grupo de control mostraron una estructura de tejido cerebral intacta con vasos sanguíneos distribuidos uniformemente y claramente definidos, sin ninguna infiltración de células inflamatorias. (Figura 2A). En la etapa máxima de los ratones del grupo EAE, se observó una infiltración significativa de células inflamatorias en el cerebro (Figura 2B), formando cambios en forma de manguito alrededor de los vasos sanguíneos (indicados por flecha roja). Del mismo modo, en los ratones del grupo EAE en el estadio RR, se observó una infiltración evidente de células inflamatorias (Figura 2C), con una agregación predominante alrededor de los vasos sanguíneos (indicada con flecha roja).

Análisis de tinción de LFB
En el grupo de control, la vaina de mielina de la sustancia blanca espinal aparecía azul, lo que indicaba que su estructura estaba intacta y compacta (Figura 3A). En la etapa máxima del grupo EAE, la sustancia blanca espinal exhibió un color azul claro o blanco; la estructura parecía estar suelta y discontinua, con una presencia significativa de degeneraciones vacuolares indicadas por una flecha roja (Figura 3B). En la etapa RR del grupo modelo EAE, se observó una pérdida extensa de mielina de sustancia blanca en la médula espinal. La estructura parecía estar suelta y se pudo observar un número significativo de degeneraciones vacuolares (indicadas por flechas rojas; Figura 3C).

Ensayo de citometría de flujo
Los resultados representados en la Figura 4A, B demostraron un aumento significativo en la proporción de células Teff CD4 + CD69+ en ratones EAE en la etapa máxima en comparación con el grupo control (P < 0.0001). Además, la proporción de estas células también aumentó durante la etapa RR, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). La Figura 4C,D reveló un aumento notable en la proporción de células Tem CD4 + CD44 + CD62L- en ratones EAE en las etapas pico y RR, en comparación con el grupo control (P < 0,0001).

Citocina medida por matriz de perlas citométricas
Los resultados mostrados en la Figura 5 demuestran que, en comparación con el grupo control, los niveles de IL-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), IFN-γ (P < 0,0001) y TNF-α (P < 0,0001) se elevaron significativamente en el grupo EAE en la etapa pico. Si bien la expresión de IL-17A también aumentó, la diferencia no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). Además, el nivel de IL-2 no mostró cambios durante la etapa pico de los ratones EAE (P > 0,05); sin embargo, aumentó significativamente durante la etapa RR (P < 0,01). Además, las expresiones de TNF-α (P < 0,001) e IL-17A (P < 0,01) en el estadio RR fueron significativamente mayores que las observadas en el grupo control. Por el contrario, la expresión de IL-10 en el grupo EAE fue significativamente menor que en el grupo control, tanto en el estadio pico como en el RR (P < 0,0001).

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Figura 1: Evaluación de la puntuación clínica. La puntuación clínica se evaluó diariamente y muestra que los ratones desarrollaron un EAE recurrente-remitente clásico inmunizado por MOG35-55. (A) El diagrama de la progresión de los síntomas de los ratones EAE. (B) La evaluación de los ratones EAE a través de puntuaciones clínicas medias. Los datos se expresan como media ± SEM, n = 6. Los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones post-hoc para evaluar las diferencias estadísticamente significativas. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Mapa microscópico de la tinción de H&E cerebral. (A) Cerebro de ratones en el grupo de control. (B) Cerebro de ratones EAE en etapa máxima. Las células inflamatorias se infiltraron en el cerebro en la etapa máxima en los ratones del grupo EAE y se distribuyeron alrededor de los vasos sanguíneos para formar un cambio similar a un manguito (flecha roja). (C) Cerebro de ratones EAE en estadio RR. Células inflamatorias en ratones del grupo EAE del estadio RR agregadas alrededor de los vasos sanguíneos (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Mapa microscópico de la tinción de LFB de la vaina de mielina. (A) Vaina de mielina de ratones en el grupo control. (B) Vaina de mielina de ratones EAE en etapa pico. La sustancia blanca de la columna vertebral era de color azul claro o blanco, la estructura era suelta y discontinua, y aparecían un gran número de degeneraciones vacuolares (flecha roja). (C) Vaina de mielina de ratones EAE en estadio RR. La mielina de la médula espinal se perdió ampliamente, la estructura estaba suelta y aparecieron una gran cantidad de degeneraciones vacuolares (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: La inmunización con MOG35-55 indujo la regulación al alza de la proporción de células CD4 Teff y Tem tanto en la etapa pico como en la RR en ratones EAE. (A) Gráfico de flujo ilustrativo que muestra la inmunotinción de las células CD4 + CD69+ . (B) Porcentaje de células Teff CD4+CD69+ . (C) Gráfico de flujo ilustrativo que muestra la inmunotinción de las células CD44+CD62L+ (puerta en las células T CD4). (D) Porcentaje de células Tm CD44+CD62L+ . Los datos se expresan como media ± SEM, n = 5. Los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones post-hoc para evaluar las diferencias estadísticamente significativas. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Nivel de citoquinas en el cerebro de ratones analizado por matriz de perlas citométricas. Los datos se expresan como media ± SEM, n = 3. Los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones post-hoc para evaluar las diferencias estadísticamente significativas. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etiqueta de tuboConcentración (pg/mL)Dilución estándar de citocinas
10 (control negativo)sin dilución estándar (solo diluyente de ensayo)
2201:256
3401:128
4801:64
51561:32
6312.61:16
76251:8
812501:4
925001:2
105000Estándar superior

Tabla 1: Lista de diluciones estándar de citocinas en los tubos de control.

Discusión

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La EM es la enfermedad desmielinizante autoinmune más prevalente del SNC, que afecta a millones de personas en todo el mundo17. EAE es el modelo animal típico para simular las características clínico-patológicas de la EM18. Los estudios han demostrado que las personas con EM experimentan deterioro cognitivo y otras discapacidades debido a la degeneración de los axones y las neuronas en el SNC 19,20,21. En la etapa pico y RR del modelo EAE, los ratones mostraron parálisis en la cola y las extremidades traseras. Además, se observó que las células inflamatorias se infiltraban en el SNC, lo que provocaba diversos grados de pérdida de la vaina de mielina. Estos hallazgos indicaron el establecimiento exitoso del modelo EAE en este experimento.

El proceso de emulsificación de MOG35-55 y CFA debe realizarse en hielo para evitar la degradación de MOG35-55 causada por la generación de calor durante el proceso de homogeneización. El PTX se administra por vía intraperitoneal para mejorar la permeabilidad vascular, permitiendo que las células T atraviesen fácilmente la barrera hematoencefálica y lleguen a la vaina de mielina que rodea a las neuronas22. Lo que requiere especial atención es que en los casos en que los ratones se paralizan y no pueden soportar comer o beber por sí mismos, es importante proporcionar bandejas de comida y agua en su jaula o alimentarlos manualmente para evitar la sed y el hambre excesivas.

Se utilizó citometría de flujo para analizar la proporción de células Teff CD4+CD69+ y células Tem CD4+CD44+CD62L- . La proporción de células Teff CD4+CD69+ en el bazo de los ratones EAE se reguló notablemente en la etapa máxima. Además, fue superior a la del grupo control en la etapa de recaída, aunque esta diferencia no alcanzó significación estadística. Por otro lado, la proporción de células madre CD4+CD44+CD62L- fue significativamente mayor en los ratones EAE en comparación con el grupo control tanto en la etapa pico como en la RR. Esto sugiere que el inicio de EAE podría involucrar tanto a las células Tem CD4 + CD69+ como a las CD4 + CD44 + CD62L- en la etapa máxima, mientras que la etapa RR está quizás dominada principalmente por las células Tem CD4 + CD44 + CD62L- . CD69 es la molécula de superficie de membrana más temprana que se expresa durante la activación de los linfocitos. Desempeña un papel crucial en la modulación de la adhesión y la migración de las células T, ayudando así a las células inmunitarias a identificar y localizar los sitios de infección o inflamación dentrodel cuerpo. Los linfocitos T en reposo no expresan CD69, pero cuando son estimulados y activados por activadores anti-CD3/TCR pueden expresarse inductivamente24. Después de la etapa efectora, una parte significativa de las células T sufren apoptosis ya que no pueden diferenciarse más. Esta reducción en el número se debe principalmente a la ausencia de citocinas que favorecen la supervivencia, incluida la IL-2, que se producen durante la estimulación de antígenos. Además, la regulación negativa de los receptores de estas citocinas contribuye aún más a este fenómeno de contracción clonal25. Además, la eliminación del agente infeccioso a través de una respuesta inmunitaria adaptativa conduce a la contracción clonal de las células T, lo que en última instancia deja menos células de memoria de larga vida para proporcionar una respuesta inmunitaria al huésped en caso de reinfección con el patógeno26. En el presente estudio, la proporción de células T CD4 + CD69 + se elevó notablemente en la etapa máxima, sin embargo, disminuyó en la etapa RR, lo que indica que las células Teff CD4 no pueden sobrevivir durante un período prolongado y, en última instancia, sufren apoptosis, solo una pequeña fracción de las células T específicas de antígeno se convierten en células T de memoria de larga vida. Las células madre tienen una baja expresión de CD62L. Sin embargo, son capaces de expresar algunos receptores de quimiocinas y moléculas de adhesión que facilitan su migración a los tejidos inflamados. Después de la reactivación del antígeno, la tasa de proliferación es relativamente lenta, pero las citocinas se liberan rápidamente para iniciar la función efectora27. En el presente estudio, los antígenos en ratones se liberaron de la emulsión y atacaron de nuevo al sistema inmune, las células Tem pueden reactivarse y liberar un gran número de citoquinas, como IL-6 e IFN-γ, lo que puede resultar en la recaída de ratones EAE.

Las principales poblaciones de linfocitos T CD4 proinflamatorios asociados con enfermedades autoinmunes (incluida la EM) son las células Th1 que secretan IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α y las células Th17 que secretan IL-17. Se ha demostrado que el IFN-γ asociado a las células Th1 puede tener un efecto perjudicial directo sobre los oligodendrocitos, lo que resulta en daño a las neuronas del SNC del paciente28. Las células Th17 también desempeñan un papel importante en varias enfermedades autoinmunes, incluida la EM. La investigación ha observado niveles elevados de células Th17 y ARNm de IL-17 en lesiones cerebrales de pacientes con EM en comparación con individuos sin la enfermedad29. Las células Treg, que se caracterizan por la producción de IL-10 y TGF-β30, tienen un efecto inmunosupresor y desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la tolerancia del sistema inmunitario a los autocomponentes, lo que permite al organismo mantener la homeostasis inmunitaria. Aquí observamos una regulación positiva significativa de la expresión de IL-4, IL-6, IFN-γ y TNF-α en el grupo EAE en la etapa máxima. Además, la expresión de IL-17A también se incrementó, aunque no hubo significación. Por el contrario, los niveles de expresión de TNF-α e IL-17A en el estadio RR fueron significativamente más altos en comparación con el grupo control. Esto sugiere que la etapa máxima de EAE es impulsada principalmente por las células Th1 en lugar de las células Th17, mientras que la etapa RR de EAE fue iniciada por las células Th1 y Th17. Vale la pena señalar que la expresión de IL-10 en el grupo EAE tanto en el período pico como en el RR fue marcadamente menor que en el grupo control, lo que sugiere que la función inmunosupresora de las células Treg se vio obstaculizada durante la procesión patológica de EAE.

En conclusión, nuestros estudios sugieren el establecimiento exitoso de un modelo de EAE recurrente-remitente en ratones a través de la inmunización con el péptido MOG35-55. Desde el punto de vista de la fase activa, el estadio pico de EAE probablemente fue iniciado por células Tem CD4+CD69+ y CD4+CD44+CD62L- , mientras que la recaída de la etapa EAE RR podría estar dominada principalmente por células Tem CD4+CD44+CD62L- . Desde el punto de vista de la función del efecto inmunitario, la fase máxima de la EAE no fue iniciada principalmente por las células Th17, sino por las células Th1. Sin embargo, la etapa RR de EAE fue iniciada por las células Th1 y Th17. La función inmunosupresora de las células Treg fue inhibida durante el proceso patológico de EAE. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la activación de las células Th1/Th17 y la supresión de las células Treg requieren más investigación.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Ningxia (2022AAC03601 y 2023AAC02087) y la Fundación de Investigación de la Universidad Médica de Ningxia (XM2019052). Gracias por el apoyo del Centro de Investigación de Ciencia y Tecnología Médica de la Universidad Médica de Ningxia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Evaporador de la máquina de anestesiaNorvap20-17368
  IsofluranoSigma-Aldrich (Shanghái) Trading Co.Ltd.
70 μ m filtro de célulasXIYAN Co., Ltd.15-1070
Alexa Fluor 700 anti-ratón CD45 AnticuerpoBiolegend103128
APC anti-ratón Anticuerpo CD4Biolegend100616
Contador automático de célulasJiangsu JIMBIO technology Co., LtdJIMBIO iCyta S2
BD* Matriz de perlas citométricas (CBA) Ratón Th1/Th2/Th17 Kit CBA BDBiosciences560485
Biotina anti-ratón CD16/32 AnticuerpoBiolegend101303
Violeta Brillante 510 anti-ratón CD69Anticuerpo Biolegend104532
BV786 Rata Anti-Ratón CD62L(MEL-14)BD Pharmingen563109
Columna Tissue& Kit de extracción de proteínas celularesShanghai Epizyme Biomedical Technology Co., LtdPC201Plus
Complete Freund's AdjuvantSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. 
DeshidratadorDIAPATHDonatello
Jeringa esterilizada desechable (1 mL)Yikang Group210820
Jeringa esterilizada desechable (2,5 mL)Yikang Group210820
Jeringa esterilizada desechable (5 mL)Yikang Group210820
TeñidorDIAPATHGiotto
Máquina de incrustaciónWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
EtanolSCRC100092683
Suero fetal bovinoProcell Life Science& Tecnología Co., Ltd.FSP500
FITC Hamster Anti-Ratón CD3e(145-2C11)BD Pharmingen553062
Citómetro de flujoBecton,Dickinson and CompanyFACSCelesta
Citómetro de flujoBecton,Dickinson and CompanyAccuri C6
Flow Jo softwareBD Biosciences10.8.1
Plataforma congeladaWuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Portaobjetos de vidrioServicebioG6004
HE juego de soluciones de coloranteServicebioG1003
Solución de hematoxilina-eosinaServicebioG1002
Centrífuga refrigerada de alta velocidadThermo Fisher ScientificMogafugo8R
Sistema de imagenNikonNIKON DS-U3
Kit de tinción azul rápido LuxolServicebioG1030
Ms CD44 BV421 IM7BD Pharmingen564970
Mycobacterium tuberculosis H37RABD Pharmingen231141
Glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG35-55)AnaSpecAS-60130-1
Goma neutraSCRC10004160
OrganizadorKEDEEKD-P
HornoLaboteryGFL-230
Cortadora de patologíaLeicaRM2016
Toxina de la tos ferina de Bordetella pertussisSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.P7208
Solución salina tamponada con fosfatoServicebioG4202
Pipeta 0.5-10 μ LPipeta de7010101004
100-1000 μ LPipeta de7010101014
20-200 μ LDLAB Scientific7010101009
RPMI-1640Procell Ciencias de la Vida& Tecnología Co., Ltd.
Válvula en TGuangdong Kanghua Medical Co., LTDA06
Esparcidor de tejidosZhejiang Kehua Instrument Co., LtdKD-P
NikonNIKON ECLIPSE E100
XilenoSCRC10023418
792632 SLCH4887 DLAB ScientificDLAB ScientificPM150110 Microscopio óptico vertical

Referencias

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