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Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

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DOI:

10.3791/66566

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19 de abril de 2024

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Resumen

Las complicaciones después del trasplante de pulmón están relacionadas en gran medida con la respuesta del sistema inmunitario del huésped al injerto. Estas respuestas inmunitarias están reguladas por la diafonía entre las células del donante y del receptor. Una mejor comprensión de estos procesos se basa en el uso de modelos animales preclínicos y se ve favorecida por la capacidad de estudiar el tráfico de células inmunitarias intrainjerto en tiempo real. La microscopía intravital de dos fotones se puede utilizar para obtener imágenes de tejidos y órganos a profundidades de hasta varios cientos de micras con un daño fotográfico mínimo, lo que ofrece una gran ventaja sobre la microscopía confocal de un solo fotón. El uso selectivo de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes específicas del promotor y/o transferencia adoptiva de células marcadas con colorantes fluorescentes durante la microscopía intravital de dos fotones permite el estudio dinámico de células individuales dentro de su entorno fisiológico. Nuestro grupo ha desarrollado una técnica para estabilizar pulmones de ratón, que nos ha permitido obtener imágenes de la dinámica celular en pulmones naïve e injertos pulmonares trasplantados ortotópicamente. Esta técnica permite una evaluación detallada del comportamiento celular dentro de la vasculatura y en el intersticio, así como el examen de las interacciones entre varias poblaciones celulares. Este procedimiento se puede aprender y adaptar fácilmente para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan las respuestas inflamatorias y tolerogénicas después del trasplante de pulmón. También puede ampliarse al estudio de otras afecciones pulmonares patogénicas.

Introducción

El trasplante de pulmón es la última opción para muchos pacientes que padecen enfermedad pulmonar terminal; Sin embargo, la supervivencia a largo plazo después del trasplante de pulmón es mala en comparación con otros trasplantes de órganos sólidos. La supervivencia a los 5 años es solo ~60%-70%1, en comparación con el 80%-90% en los corazones2 y el 85%-90% en los riñones3. Muchas complicaciones después del trasplante de pulmón, como la disfunción primaria del injerto, el rechazo mediado por anticuerpos y la disfunción crónica del injerto pulmonar, se deben a la respuesta inmunitaria del huésped al aloinjerto. Por ejemplo, nuestro grupo ha demostrado que los neutrófilos se reclutan rápidamente en el aloinjerto pulmonar después de una lesión por isquemia-reperfusión inducida por un trasplante y forman grupos dinámicos alrededor de los monocitos sanguíneos4. La diafonía entre las células donantes y receptoras es responsable de las respuestas aloinmunes deletéreas 5,6,7, y la capacidad de estudiar estas interacciones celulares dinámicas en un modelo animal vivo es invaluable.

La microscopía de dos fotones permite obtener imágenes intravitales de alta resolución a profundidades de hasta varios cientos de micras con un fotoblanqueo mínimo de los tejidos 8,9. Se utiliza en una variedad de tejidos y sitios anatómicos, incluyendo el neocórtex10,11, la piel12,13 y el riñón14,15. Más recientemente, se ha adaptado a órganos no estáticos como el pulmón y el corazón 4,16,17. En este protocolo, describimos una técnica para obtener imágenes de injertos pulmonares estabilizados, ventilados y perfundidos después de un trasplante de pulmón izquierdo ortotópico murino. Un beneficio clave del modelo de trasplante es la capacidad de manipular genéticamente al donante y al receptor por separado. Las poblaciones celulares individuales se pueden visualizar con cepas de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes knock-in, transferencia adoptiva de células marcadas con fluorescencia5 o inyección intravenosa de anticuerpos marcados con fluorescencia para unirse a marcadores específicos de células 4,16,17,18.

Con el fin de estabilizar el pulmón durante la toma de imágenes, este protocolo consiste en pegar el pulmón a un cubreobjetos, mientras que otros grupos han descrito la estabilización por succión utilizando un dispositivo de vacío reversible hecho a medida19. Nuestro protocolo tiene varias ventajas, incluida una mayor área de imágenes y una relativa facilidad de configuración utilizando materiales comúnmente disponibles en un laboratorio de microscopía (incluidos cubreobjetos y pegamento). Dado que esta técnica de pegado restringe el pulmón en la superficie superior, se espera que disminuya el movimiento ventilatorio y permita obtener imágenes más profundas. Esta técnica de imagen intravital permite observar detalladamente el comportamiento y las interacciones de las células inmunitarias en tiempo real, lo que contribuye al estudio de los mecanismos inmunitarios que regulan las respuestas inflamatorias frente a las tolerogénicas tras el trasplante de pulmón.

Protocolo

Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Cuidado de la Salud y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.

1. Anestesia e intubación

NOTA: Se realiza un trasplante ortotópico de pulmón izquierdo en ratón, como se describió anteriormente20,21. Los pulmones de ratones C57BL/6 (B6) de 20-25 g se trasplantan a receptores B6 del mismo sexo y edad. B6. Los ratones reporteros LysM-GFP se utilizan como receptores para experimentos seleccionados para visualizar la infiltración de neutrófilos en injertos pulmonares. Los ratones receptores pueden ser fotografiados inmediatamente después de un trasplante de pulmón.

  1. Reanestesiar ratones con administración intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (8-10 mg/kg). Administrar buprenorfina de liberación sostenida (0,5-1,0 mg/kg) por vía subcutánea para un control adicional del dolor. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia con un pellizco en la pata.
    NOTA: Si el tiempo entre el trasplante de pulmón y las imágenes intravitales planificadas es inferior a dos horas, puede volver a dosificar el anestésico con el 50% de la dosis inicial de ketamina.
  2. Retire el vello de todo el pecho izquierdo con una maquinilla eléctrica y limpie el cofre para eliminar el exceso de pelos recortados.
  3. Aplique un ungüento oftálmico no medicado en los ojos del ratón para prevenir la sequedad de la córnea.
  4. Reintuble del ratón por vía orotraqueal con un angiocatéter de 20 G, como se ha descrito anteriormente21.
  5. Ventile con aire ambiental a una velocidad de 120 respiraciones/min y un volumen corriente de 0,5 cc.
  6. Administre un 1% de isofluorano por vía endotraqueal durante todo el procedimiento.
  7. Para visualizar los vasos sanguíneos durante la obtención de imágenes, inyecte 20 μL de puntos cuánticos no dirigidos (q-dots) de 655 nm en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa al menos 5 minutos antes de la obtención de imágenes.

2. Preparación quirúrgica del pulmón izquierdo para la obtención de imágenes

  1. Coloque el ratón en una posición de decúbito lateral derecho (ver Figura 1A).
  2. Desinfecte la piel del pecho con una mezcla de 0,75% de yodo y 70% de etanol, tres veces.
  3. Vuelva a abrir la toracotomía izquierda (del trasplante de pulmón de ratón) a través del tercer espacio intercostal (véase la figura 1A).
  4. Extraer una porción de la piel y el tejido blando sobre el sitio de la toracotomía izquierda, que mide 1,5 cm x 1,5 cm (véase la figura 1B).
  5. Antes de la resección de las costillas, primero pinza las costillas durante ~10 s para trombosecar cualquier microvasculatura y lograr la hemostasia (ver Figura 1C, D).
  6. Resecar partes de la3ª a la5ª costilla para crear una ventana de imagen lo suficientemente grande como para extraer el pulmón (~0,8 cm craneocaudalmente y ~1,0 cm anteroposterior, Figura 1D, E).
  7. Detenga cualquier sangrado adicional de los bordes de las costillas con electrocauterización.
    NOTA: Es fundamental lograr la hemostasia en el borde cortado de las costillas para evitar la pérdida excesiva de sangre durante el período de imagen.
  8. Coloque un pequeño bulto (gasa de 4 cm x 4 cm doblada longitudinalmente 3 veces) debajo del tórax derecho (ver Figura 1E).
  9. Con hisopos de algodón, eleve el injerto pulmonar fuera del tórax y coloque la cara inferior del pulmón sobre una tira de gasa empapada en solución salina de 1 cm x 3 cm (véase la figura 1F).
    NOTA: Esta tira de gasa empapada en solución salina evita el deslizamiento del pulmón, mantiene un ambiente húmedo para el pulmón, protege el pulmón de los bordes afilados de las costillas resecadas y separa el pulmón del movimiento del corazón. Una vez que la cámara de imagen circunferencial se coloca sobre el pulmón (Figura 1G, H, descrita en la sección 3), debe haber una pérdida mínima de calor y líquido de la cavidad torácica abierta durante el período de imagen.

3. Preparación de la cámara de imágenes

NOTA: Una cámara de imágenes se construye a medida (consulte la Figura 2A). Esta cámara de imágenes consta de una placa base y una placa superior entre las cuales se coloca el mouse y se asegura en su lugar con pernos accionados por resorte a cada lado (Figura 2B). La placa superior contiene un recorte circular de ~2 cm de diámetro. Se coloca una junta tórica negra de tamaño correspondiente en esta abertura en la parte frontal de la placa superior, que protegerá la lente del objetivo (Figura 2C). Un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm se adhiere a la parte posterior de la placa superior con grasa de alto vacío, lo que creará un sello hermético. Este cubreobjetos servirá como ventana de diagnóstico por imágenes al adherirse al pulmón por debajo y sostener el medio de diagnóstico por imágenes (es decir, agua) por encima. Asegúrese de que no entre grasa de vacío en la ventana circular de imagen. El cubreobjetos se reemplazará para cada nuevo experimento de imagen. La placa base se calienta a 35-37 °C utilizando una sonda de temperatura de termopar (Figura 2A).

  1. Coloque el ratón intubado en la placa base de la cámara de diagnóstico por imágenes con el tórax izquierdo abierto hacia arriba (véase la figura 1G, H). Asegure el ratón con cinta de seda sobre la cara, las patas delanteras y la cola (consulte la Figura 1H y la Figura 2A).
  2. Aplique pegamento en la parte inferior del cubreobjetos unido a la placa superior (círculo gris en la Figura 2C, abajo), dejando un círculo sin pegamento de 0,8-1,0 cm en el centro.
    NOTA: Hay una compensación entre el tamaño del círculo sin pegamento y la cantidad de artefacto de movimiento; Por lo tanto, se recomienda que el círculo no supere 1,0 cm de diámetro.
  3. Baje la placa superior hasta que el cubreobjetos haga contacto con el pulmón, y el pegamento toque la superficie del pulmón (véase la figura 1G).
    NOTA: El pulmón izquierdo se pegará al cubreobjetos con un círculo limpio y sin pegamento en el medio, que es el área de la que se tomará la imagen.
  4. Sostenga el cubreobjetos contra el pulmón e infle el pulmón durante 1-2 segundos para que el área de pegamento se adhiera al tejido circundante. Logre el inflado pulmonar ocluyendo el tubo de salida desde el tubo endotraqueal del ratón hasta el ventilador.
    NOTA: No infle el pulmón durante más de 1-2 segundos, ya que esto puede causar un barotrauma excesivo.
  5. Retire ligeramente la placa superior para reducir la presión sobre el tejido pulmonar. Asegúrese de que el área del pulmón dentro de la ventana de diagnóstico por imágenes no se mueva con la ventilación.
  6. Asegure ambos extremos de la placa superior asegurando la tuerca de mariposa sobre cada perno (consulte la Figura 2B).

4. Imágenes de dos fotones

NOTA: Para la microscopía intravital se debe utilizar un microscopio vertical de platina fija con un objetivo de inmersión en agua de apertura numérica (NA) de 20x o 25x >1.0. A continuación se muestra la configuración utilizada en este estudio para un B6 a B6. Trasplante de pulmón izquierdo LysM-GFP con marcaje de vasos sanguíneos de 655 nm en puntos q. Al aplicar este protocolo, la configuración del microscopio, los láseres y los filtros dicroicos se pueden adaptar en función de las necesidades del experimento específico y de los reporteros fluorescentes utilizados.

  1. Coloque toda la cámara de imagen con el ratón receptor intubado (B6 pulmón izquierdo trasplantado a B6. LysM-GFP con puntos q de 655 nm) en la platina del microscopio (ver Figura 2A).
  2. Utilice filtros dicroicos de longitudes de onda de 480 nm, 560 nm y 635 nm, que separarán adecuadamente las señales del reportero GFP, los puntos q y la señal de generación de segundos armónicos (SHG) (445 nm) generada por el colágeno. Estos filtros se pueden adaptar en función del experimento específico.
    NOTA: La señal SHG generada por el colágeno demarca estructuras oscuras en forma de cráter, que representan los espacios aéreos alveolares (ver flechas blancas en la Figura 3).
  3. Ajuste el láser pulsado de femtosegundos de titanio-zafiro a 890 nm (dentro del rango del infrarrojo cercano) para la excitación. Utilice la potencia láser más baja posible para lograr una señal suficiente.
    NOTA: La configuración del láser debe ajustarse para el experimento específico para maximizar la separación de la señal.
  4. Aplique ~ 1 mL de agua para cubrir completamente el cubreobjetos en la placa superior, que se mantendrá en su lugar mediante la junta tórica y el sello de grasa al vacío del cubreobjetos a la placa superior (consulte la Figura 1G y la Figura 2C).
  5. Utilice el objetivo de inmersión en agua 20x >1.0 NA en el microscopio. Asegúrese de que la lente del objetivo se adapte en función del experimento específico.
    NOTA: Una NA más grande permite una mayor recolección de luz, mayor contraste e imágenes más detalladas. Se prefieren los objetivos de inmersión en agua, ya que el agua o el tampón son más compatibles con los tejidos biológicos.
  6. Baje el objetivo del microscopio en el agua y concéntrese en la superficie del pulmón.
  7. Active el calentador de la placa base y mantenga la temperatura a 35-37 °C.
    NOTA: Si existe preocupación sobre la incapacidad de mantener la temperatura de los tejidos o la perfusión adecuada al pulmón, se pueden colocar dos resistentes adicionales para calentar la placa superior además de la placa base (consulte la Figura complementaria 1).
  8. Adquiera pilas de imágenes con el software de adquisición de su elección.
    NOTA: Asegúrese de que la habitación esté completamente oscura durante la adquisición, lo que puede implicar el uso de cortinas/persianas opacas y una cobertura estratégica de todas las fuentes de luz.

5. Adquisición de vídeo

NOTA: Los siguientes parámetros se pueden adaptar en función del experimento específico. En los pasos 5.1-5.3 se describen los parámetros específicos utilizados para los diagramas B6 a B6. Trasplante de pulmón izquierdo murino Lysm-GFP, que puede utilizarse como guía de referencia.

  1. Con un escáner bidireccional de velocidad de vídeo, establezca las dimensiones del escaneo x-y en 512 x 512 píxeles.
  2. Con una unidad paso a paso xyz, adquiera grabaciones de lapso de tiempo de una pila z de 21 pasos con un promedio de 10 fotogramas por paso. Cada pila tarda unos 20 segundos en adquirirse, lo que incluye el tiempo necesario para el promedio de tramas, el motor paso a paso para moverse y comprobar su posición, y un retraso de 100 ms.
    NOTA: El escáner bidireccional del microscopio utilizado en este estudio funciona a una velocidad de vídeo de 30 fotogramas/s. Esto puede diferir dependiendo de la configuración específica del microscopio.
  3. Adquiera 80 pilas z consecutivas para obtener imágenes de lapso de tiempo de la migración de leucocitos dentro del parénquima tisular. Esto tarda unos ~27 minutos a 20 s/pila.
    NOTA: El tamaño de la pila, el promedio de fotogramas, la potencia del láser y la duración total de la grabación de lapso de tiempo deben minimizarse para evitar la exposición excesiva del láser al tejido. Si los reporteros fluorescentes utilizados son brillantes (es decir, GFP) y la potencia del láser es baja, el ratón tolera bien la repetición de una pila z de 21 pasos con un escaneo promedio de 10 fotogramas, 512 x 512 píxeles, a intervalos de 20 s durante ~27 minutos. Si se desean períodos más largos de obtención de imágenes, se debe aumentar el tiempo de adquisición por pila para mantener la exposición total al láser igual (es decir, 1 minuto por pila durante ~ 1,5 h). Estos ajustes deberán optimizarse en función de los reporteros fluorescentes utilizados.
  4. Sacrificar al ratón al final de la adquisición de la imagen. Para aplicar la eutanasia, anestesiar al ratón con ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (8-10 mg/kg), seguido de una posterior luxación cervical. Las preparaciones típicas de imágenes mantendrán fácilmente la viabilidad del ratón hasta 2 h.
    NOTA: Para prolongar este período, es posible que se requiera suplementación adicional con líquidos, anestesia con isoflurano y atención a la regulación de la temperatura.
  5. Renderizado de video completo con Imaris. También se puede utilizar otro software de imagen (como ImageJ).
    NOTA: Las imágenes se pueden procesar después de la adquisición utilizando la mejora del contraste, el suavizado y la aritmética de canales para eliminar la diafonía de canales.

Resultados

Después de 1 h de almacenamiento isquémico en frío a 4 °C, trasplantamos ortotópicamente el pulmón izquierdo de un ratón B6 a un B6. LysM-GFP en ratón4, y luego se realizaron imágenes intravitales de dos fotones, como se describió anteriormente. Realizamos imágenes en dos momentos post-trasplante: 2 h (Figura 3A) y 24 h (Figura 3B). Los vasos sanguíneos están marcados en rojo por los puntos q inyectados inmediatamente antes de la toma de imágenes. Además, podemos visualizar monocitos que han ocupado puntos q a las 24 h4. En el vídeo correspondiente se puede ver a los neutrófilos derivados del receptor marcados en verde infiltrándose en el injerto pulmonar a las 24 h después del trasplante (vídeo complementario 1). Los alvéolos se pueden visualizar como cráteres oscuros debido a la SHG del colágeno (flechas blancas en la Figura 3). Observamos que a las 24 h post-trasplante hay más neutrófilos en el pulmón en comparación con las 2 h post-trasplante (Figura 3).

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Figura 1: Preparación del ratón para la obtención de imágenes de dos fotones. (A) Piel reabierta sobre la toracotomía izquierda. (B) Piel y tejidos blandos extirpados sobre el tórax izquierdo. (C,D) Las costillas se sujetan durante 10 s antes de dividirse. (E)3ª-5ª costillas izquierdas resecadas para crear una ventana que mide ~0,8 cm craneocaudalmente x 1,0 cm anteroposterior. (F) Pulmón izquierdo elevado fuera del tórax izquierdo y colocado sobre una tira de gasa. (G) Una cámara de imágenes con una ventana de imágenes se superpone al pulmón izquierdo. (H) La cámara de imagen colocada en la platina del microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración de la cámara de imagen. (A) La cámara de imagen colocada en la platina del microscopio. (B) Vista ampliada del mecanismo de perno accionado por resorte para asegurar la placa superior sobre el pulmón izquierdo. (C) Parte delantera y trasera de la placa superior con junta tórica y vidrio de cobertura aplicados. Las líneas blancas representan el área donde se aplica la grasa de vacío para adherir el cubreobjetos a la placa superior. El círculo gris representa un anillo de pegamento para aplicar al vidrio de la cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imagen intravital de dos fotones de un trasplante de pulmón izquierdo de ratón de B6 a B6. Ratón LysM-GFP con 1 h de almacenamiento isquémico en frío. Las imágenes se realizan a las (A) 2 h y (B) 24 h después del trasplante. El rojo representa los puntos q. El verde representa los neutrófilos de B6. Receptor de LysM-GFP. El azul representa el SHG de los alvéolos ricos en colágeno. Las flechas blancas muestran los espacios aéreos alveolares. La barra de escala representa 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Placa superior con dos resistentes unidas para proporcionar calefacción adicional. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 1: Imágenes de lapso de tiempo de dos fotones de pulmón izquierdo de ratón trasplantado de B6 a B6. LysM-GFP en ratón con 1 h de almacenamiento isquémico en frío, realizado a las 24 h después del trasplante. El rojo representa los puntos q. El verde representa los neutrófilos del receptor de LysM-GFP. El azul representa la segunda generación armónica a partir de los alvéolos ricos en colágeno. La barra de escala representa 20 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La excitación de dos fotones fue descrita por primera vez en su tesis doctoral por Maria Göppert-Mayer en 1931, quien más tarde ganó el Premio Nobel de Física por describir la estructura de la capa nuclear22,23. La microscopía de fluorescencia tradicional se basa en la excitación de un solo fotón, con longitudes de onda de excitación que son más cortas y de mayor energía que las longitudes de onda de emisión. A diferencia de la microscopía de fotón único, la microscopía de dos fotones implica la excitación simultánea de dos fotones, cada uno con longitudes de onda más largas que la de la señal de fluorescencia emitida 24,25,26. Debido a que dos fotones individuales necesitan colocalizarse para excitar un solo punto focal en el tejido, la excitación de dos fotones es espacialmente a un volumen de muestra pequeño, lo que permite el corte óptico 24,25,26 y hay menos fotoblanqueo por encima y por debajo del plano que contiene el punto focal27. La probabilidad de excitación simultánea por dos fotones es muy baja, por lo que se necesita un láser pulsado de femtosegundos para lograr la intensidad de excitación requerida para una señal de emisión de fluorescencia 25,26,27. El láser de excitación se encuentra en el rango del infrarrojo cercano (700-1100 nm), cuya ventaja es la menor dispersión, lo que permite que la luz penetre más profundamente en el tejido28. La profundidad de la imagen depende de la velocidad de oscilación y la potencia del láser24. Dentro del pulmón, se pueden alcanzar profundidades de imagen de ~500-600 μm17. Por lo tanto, la combinación de la profundidad de la imagen y el bajo fotoblanqueo hace que la microscopía de dos fotones sea muy adecuada para la obtención de imágenes intravitales de órganos.

La microscopía de dos fotones se ha utilizado en múltiples tejidos y sitios anatómicos diferentes, como la piel12,13, los ganglios linfáticos29, el endotelio venoso30, la corteza cerebral10,11, el riñón14,15 y el hígado31,32. Por ejemplo, en la dermis de ratón, se han utilizado imágenes intravitales de dos fotones para describir el enjambre de neutrófilos después de una lesión física estéril12. En un modelo de trombosis venosa, se visualizaron monocitos sanguíneos y neutrófilos arrastrándose a lo largo del endotelio de la vena cava inferior30. Se han obtenido imágenes con éxito de microglía humana in vivo después de ser xenotrasplantadas en un modelo de organoide cerebral humano33. Con los continuos avances en la microscopía de dos fotones, las imágenes intravitales son posibles a mayores profundidades e incluso en órganos no estáticos. Por ejemplo, se han obtenido imágenes de profundidades de hasta 1000 μm en el neocórtex en ratones utilizando un amplificador regenerativo de Ti:Al2O3 34.

Uno de los desafíos de las imágenes intravitales en los órganos torácicos es la estabilización de la imagen. Debido al movimiento de los latidos del corazón y las respiraciones pulmonares, los artefactos de movimiento pueden reducir significativamente la calidad de la imagen. Se han desarrollado varios métodos de estabilización para la obtención de imágenes cardíacas y pulmonares, incluyendo el pegado del órgano 4,7, la estabilización por succión 19,35,36,37 y la corrección de movimiento a posteriori38. Nuestra técnica de obtención de imágenes del pulmón se basa en pegar la superficie pulmonar a un cubreobjetos estabilizado. Mantenemos el pulmón perfundido, ventilado y normotérmico, lo que simula las condiciones encontradas in vivo. En comparación con el método de estabilización por succión descrito por Looney et al.19, este protocolo tiene varias ventajas. En primer lugar, no requerimos la creación de un dispositivo de succión especializado. En cambio, nuestra cámara de imágenes y placa superior se pueden construir con materiales fácilmente disponibles en un laboratorio de microscopía. Además, en comparación con el dispositivo de succión (que tiene un diámetro interno de 4 mm), la técnica de pegado utilizada en este estudio permite una mayor superficie de imagen (hasta 10 mm). Con el pegado circunferencial, el área del pulmón dentro del círculo de pegamento se restringe adecuadamente y se minimiza el movimiento ventilatorio. En comparación con la técnica de succión, el enfoque de cubreobjetos evita la deformación convexa de la superficie pulmonar, lo que podría afectar el flujo sanguíneo capilar subpleural. Las desventajas de nuestro sistema incluyen la imposibilidad de quitar el cubreobjetos sin comprometer la unión pleuroparenquimatosa. Por lo tanto, no es posible obtener imágenes del pulmón por segunda vez con la técnica de pegamento utilizada aquí, mientras que la técnica de succión permite obtener imágenes en serie. Además, el uso de una toracotomía requiere la pérdida de la presión intratorácica negativa normal, que, combinada con la ventilación con presión positiva, no es fisiológica. Limitaciones adicionales de las imágenes de dos fotones se discuten a continuación.

Si bien el tórax está abierto durante las imágenes intravitales, es fundamental mantenerlo lo más cerca posible de un entorno fisiológico. La placa base sobre la que se encuentra el ratón se mantiene a una temperatura de 35-37 °C. Con solo la placa base calentada, hemos descubierto que la temperatura central del ratón (medida a través de una sonda rectal) está bien regulada durante varias horas. En nuestra experiencia, la motilidad y el comportamiento de las células solo se ven visiblemente afectados cuando la temperatura desciende por debajo de los 32 °C, lo que es poco probable que ocurra con esta configuración. Si se encuentra una dificultad para mantener la normotermia tisular o la perfusión pulmonar durante la configuración inicial de esta cámara de imágenes, se pueden conectar dos resistentes adicionales para calentar la placa superior además de la placa base (Figura complementaria 1). Una vez que se optimiza la cámara de imagen, no es necesario monitorear rutinariamente la temperatura interna del ratón durante cada experimento de imagen. Además, hemos encontrado que la combinación de gasa empapada en solución salina colocada sobre la cavidad torácica abierta y el anillo oclusivo de pegamento alrededor del área del pulmón que se va a fotografiar son efectivas para minimizar las pérdidas de líquido durante la imagen.

Una consideración técnica importante es lograr una buena hemostasia durante la resección de las costillas al crear la ventana de imagen torácica. Se resecan partes de las costillas3ª a5ª izquierdas, y la hemorragia continua de estas costillas cortadas comprometerá la supervivencia del ratón durante la toma de imágenes. Para combatirlo, se recomienda pinzar primero las costillas proximalmente al lugar donde se van a resecar durante 10 s para tromboizar la microvasculatura (ver Figura 1C,D). Luego, después de la resección de las costillas, los bordes cortados de las costillas deben coagularse generosamente con electrocauterización. Por último, es fundamental colocar el pulmón izquierdo encima de la tira de gasa empapada en solución salina (véase la figura 1F) durante la toma de imágenes para evitar que los bordes afilados de las costillas perforen el pulmón. Con esta combinación de consideraciones técnicas, podemos capturar videos claros del tráfico de células inmunitarias dentro del parénquima pulmonar con un artefacto de movimiento mínimo durante varias horas sin lesión pulmonar ni pérdida de los patrones normales de perfusión.

La microscopía de dos fotones se ha utilizado en pulmones para estudiar modelos de enfermedades infecciosas e inflamación estéril. Un grupo utilizó imágenes de dos fotones para estudiar la motilidad y la migración de las células B de memoria residentes después de desafíos repetidos de pulmones de ratón con el virus de la influenza39. Además, la microscopía de dos fotones se ha utilizado en el trasplante de piel, riñón e islotes pancreáticos 40,41,42,43. Con un modelo de trasplante, el donante y el receptor pueden ser alterados genéticamente para estudiar sus respectivas poblaciones celulares. Hasta donde sabemos, nuestro grupo fue el primero en realizar imágenes intravitales de dos fotones en trasplantes de pulmón murino4. Observamos un rápido reclutamiento y agrupamiento de neutrófilos después de una lesión por isquemia-reperfusión mediada por trasplante, que se redujo con la depleción farmacológica de los monocitos sanguíneos4. En trabajos posteriores, hemos demostrado que los monocitos derivados del bazo receptor facilitan la extravasación de los neutrófilos a través de la producción de IL-1B44. Las imágenes intravitales en estos estudios nos permitieron descubrir reguladores aguas arriba de la extravasación de neutrófilos como posibles dianas terapéuticas para reducir la respuesta inflamatoria post-trasplante45. Además, también hemos realizado imágenes intravitales en corazones de ratón latiendo después de un trasplante heterotópico16. Visualizamos el reclutamiento de neutrófilos hacia el miocardio y descubrimos que la muerte ferroptótica de las células del injerto cardíaco inicia la inflamación después del trasplante cardíaco46. Aplicamos una técnica de estabilización similar a los arcos aórticos trasplantados para visualizar el tráfico monocítico en las placas ateroscleróticas47. Estos estudios demostraron la factibilidad y utilidad de las imágenes intravitales de órganos torácicos trasplantados no estáticos.

Finalmente, vale la pena discutir los métodos para visualizar diferentes tipos de células y el parénquima pulmonar. Se utilizan dos métodos principales para etiquetar las células: 1) cepas de ratones transgénicos con mutaciones knock-in de proteínas fluorescentes y 2) anticuerpos marcados con fluorescencia para teñir las células. Las cepas de ratones transgénicos comúnmente utilizadas para identificar células inmunitarias mediante microscopía de dos fotones incluyen LysM-GFP para neutrófilos48, CX3Cr1-GFP para varias poblaciones de macrófagos intersticiales49,50, CCR2-GFP para monocitos clásicos51, CD19-tdTomato para células B52 y Foxp3-GFP para células T reguladoras5. En particular, CX3Cr1 por sí sola no es suficiente para identificar células sin ambigüedades, pero esto puede verse favorecido por la morfología celular y la ubicación consistente con la de los macrófagos intersticiales. Los macrófagos alveolares se pueden obtener imágenes sin marcaje debido a su autofluorescencia53,54, morfología distintiva y comportamiento (es decir, falta de motilidad en la resolución temporal de los registros de lapso de tiempo). En comparación con los eosinófilos, que también son autofluorescentes, los macrófagos alveolares son más grandes y considerablemente más brillantes, con una excitación de 890 nm54. Alternativamente, los macrófagos alveolares también pueden marcarse en función de su función fagocítica mediante la administración intrapulmonar de agregados colorantes54.

La visualización de las células inmunitarias en los receptores de trasplantes también puede lograrse mediante la transferencia adoptiva intravascular de células marcadas con fluorescencia o mediante la inyección de anticuerpos marcados con fluorescencia contra marcadores de superficie específicos de la célula18,55. Otro beneficio inherente de la microscopía de dos fotones es la SHG por ciertas estructuras birrefringentes dentro del tejido, como el colágeno56. Este fenómeno es particularmente útil para las imágenes pulmonares debido al alto contenido de colágeno en los sacos alveolares, que actúa como un indicador intrínseco de la estructura alveolar sin colorantes fluorescentes adicionales. Además, los alvéolos también están circunscritos por capilares alveolares marcados por puntos q de 655 nm. Por último, los vasos sanguíneos se pueden marcar con inyección intravenosa de puntos q (como se describe en este protocolo) o rodamina B dextrano. Al diseñar un experimento de microscopía intravital de dos fotones, recomendamos el uso de no más de cuatro canales de emisión diferentes para minimizar el riesgo de sangrado y mala diferenciación entre canales.

Una de las principales limitaciones de nuestra técnica de estabilización con pegamento descrita es la incapacidad de eliminar el cubreobjetos del pulmón sin un posible daño tisular y pegamento residual en la superficie pulmonar. Por lo tanto, el pulmón solo se puede obtener una vez en lugar de en múltiples puntos de tiempo en el lapso de varios días. Para abordar esta limitación, un grupo ha descrito una ventana de imagen torácica semipermanente, que permite obtener imágenes seriadas del pulmón57. Sin embargo, en nuestra experiencia, este enfoque no permite una estabilización pulmonar adecuada durante períodos prolongados de imagen. Esta técnica permite obtener imágenes del pulmón durante varias horas, lo que proporciona información clave sobre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas después del trasplante.

Otras limitaciones de las imágenes de dos fotones incluyen el costoso costo inicial de configuración y la experiencia requerida para mantener el sistema. Los campos de exploración son relativamente pequeños en comparación con las imágenes inmunofluorescentes. El daño térmico y fotodificativo puede ser significativo si no se optimizan cuidadosamente los parámetros de adquisición. La función de dispersión del punto de excitación de dos fotones es amplia, lo que limita un poco la resolución, especialmente en la dimensión z. Además, las imágenes de dos fotones requieren que las células de interés se marquen con fluorescencia, y algunas células no se pueden marcar de forma inequívoca con un solo marcador celular. El número de señales que se pueden visualizar simultáneamente a menudo se limita a cuatro o menos. Por último, la anestesia, la cirugía y las imágenes pueden inducir inflamación adicional y cambios fisiológicos además del trasplante de pulmón que pueden confundir los resultados experimentales y las interpretaciones a pesar de los mejores esfuerzos por mantener un entorno fisiológico. Las direcciones futuras incluyen el desarrollo de métodos mínimamente invasivos de imágenes intravitales (como a través de una toracotomía más pequeña o un abordaje broncoscópico).

En conclusión, la microscopía intravital de dos fotones es una herramienta invaluable en el estudio de múltiples procesos patológicos. En este trabajo describimos una técnica fiable de inmovilización pulmonar e imágenes de dos fotones, que permite la observación intravital del tráfico celular y las interacciones dinámicas entre diferentes poblaciones celulares después del trasplante de pulmón murino. Esta técnica ha ampliado nuestra comprensión del panorama inmunitario post-trasplante y seguirá siendo una herramienta indispensable en el estudio del trasplante pulmonar y otros procesos de enfermedad pulmonar.

Divulgaciones

Los autores no informan de ninguna divulgación relevante.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de NIH 1P01AI11650 y la Fundación para el Hospital Judío Barnes. Agradecemos al Centro de Imágenes In Vivo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.75% povidona-yodoAplicareNDC 52380-0126-2Para desinfectante
Catéter intravenoso de 1 pulgada 20GTerumoSROX2025CAPara tubo endotraqueal (ETT)
Cinta de seda de 1 pulgadaDurapore3M ID 7100057168Para asegurar el mouse en su posición
Lente de objetivo largo de inmersión en agua de 20xOlympusN20X-PFH
3M PegamentoVetbondMedi-Vet.com10872Para pegar cubreobjetos en el pulmón
655 nm puntos cuánticos no dirigidosThermoFisherQ21021MPPara el etiquetado de vasos sanguíneos
70% etanolSigma AldrichEX0281Para desinfectante
Argent High Temp Pluma de cauterización de punta finaMcKesson231
Black Junta tórica (2 cm)FerreteríaN/APara imágenes personalizadas perno
(2)FerreteríaN/APara la cámara de imagen a medida
Tuerca de mariposa de latón (2)FerreteríaN/APara la cámara de imagen personalizada
Buprenorfina 1,3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Para el control del dolor
Camaleón láser pulsado de femtosegundo de titanio-zafiro CoherenteN/A
Cubreobjetos (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Para cámara de imagen
personalizada Pinza antimosquitos curvada (1)Fine Science Tools13009-12
Controlador de calentador de doble canalWarner InstrumentsTC-344B
Tijeras finas (1)Fine Science Tools15040-11
Microscopio vertical de platina fijaOlympusBX51WI
Gasa (cortada a 1 cm x 3 cm)McKesson476709Para colocar debajo del pulmón izquierdo
Grasa de alto vacíoDow CorningN/APara adherir el cubreobjetos a la placa superior
Isoflurano 1%Sigma Aldrich26675-46-7Para anestesia
Clorhidrato de ketamina 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Para anestesia
Lámina de metal (3 cm x 7 cm)FerreteríaN/APara cámara de imagen a medida
Aplicadores puntiagudos con punta de algodónSolon56225Para manipular el pulmón y para la disección roma
Power Pro Ultraclipper Oster078400-020-001
Puralube Vet ungüento ocularMedi-Vet.com11897Para prevenir la desecación ocular
Ventilador para animales pequeñosHarvard Aparato55-0000
Pinzas rectas (1)Fine Science Tools91113-10
Controlador de obturador de tres canalesUniblitzVMM-D3Escáner resonante
x.y.z motor paso a paso óptico PriorScientificOptiScan II
Xilacina 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Para el control del dolor
de la cámara

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