Artículo de método

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

2.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66579

⸱

6 de septiembre de 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Resumen

Los nucleosomas constituyen la unidad primaria de la cromatina eucariota y han sido objeto de numerosas investigaciones informativas sobre moléculas individuales con respecto a sus propiedades biofísicas e interacciones con las proteínas de unión a la cromatina. La reconstitución de nucleosomas en el ADN para estos estudios generalmente implica un procedimiento de diálisis salina que proporciona un control preciso sobre la ubicación y el número de nucleosomas formados a lo largo de una correa de ADN. Sin embargo, este protocolo requiere mucho tiempo y requiere una cantidad sustancial de cadencia de ADN e histonas como entradas. Para ofrecer una estrategia alternativa, se describe un método de reconstitución de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza y fluorescencia de una sola molécula que utiliza la chaperona de histonas Nap1. Este método permite a los usuarios ensamblar nucleosomas en cualquier molde de ADN sin la necesidad de secuencias de posicionamiento de nucleosomas fuertes, ajustar la densidad de nucleosomas a pedido y usar menos reactivos. La formación de nucleosomas in situ se produce en cuestión de segundos, lo que ofrece un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición cómoda a las mediciones de una sola molécula. Se describen con más detalle ejemplos de dos ensayos posteriores para sondear la mecánica de los nucleosomas y visualizar el comportamiento de las proteínas individuales en la cromatina.

Introducción

La unidad de empaquetamiento primario de la cromatina eucariota es el nucleosoma, en el que ~ 147 pares de bases (bps) de ADN se envuelven alrededor de un octámero de proteínas histonascentrales 1,2. Además del empaquetamiento del genoma, la arquitectura del nucleosoma sirve como otra rica capa de regulación biofísica que puede ser aprovechada por las proteínas de unión a la cromatina cuando realizan sus diversas funciones 3,4. El acceso experimental y la medición de las características físicas de los nucleosomas ha sido un desafío técnico, ya que estas unidades funcionan a escalas minúsculas (por ejemplo, longitudes nanométricas, fuerzas de piconewton) y, por lo tanto, su sondeo requiere suficiente sensibilidad y precisión para informar significativamente la función. Además, las proteínas de unión a la cromatina a menudo interactúan con sus sustratos de manera transitoria, y la mayoría de los enfoques de conjunto carecen de una resolución temporal adecuada para informar la cinética de estas interacciones5. Afortunadamente, el advenimiento de las técnicas de una sola molécula ha hecho posible visualizar y manipular proteínas individuales y sus interacciones en tiempo real, revelando información mecanicista sobre estos eventos moleculares que ocurren a nanoescala6. En particular, la microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula (smCFFM) aprovecha las herramientas de detección de fluorescencia de alta resolución y manipulación de fuerza para resolver simultáneamente la mecánica, la composición y la coordinación de los complejos de cromatina y cromatina-proteína 7,8.

En smCFFM que emplea específicamente "pinzas ópticas" como método de manipulación de fuerza, se utiliza un láser estrechamente enfocado para atrapar un objeto dieléctrico, generalmente una cuenta de plástico del tamaño de una micra, en tresdimensiones. Un biopolímero, como un fragmento de ADN, puede conjugarse con la perla (a través, por ejemplo, del enlace de anticuerpos estreptavidina-biotina, digoxigenina-antidigoxigenina), y el usuario puede aplicar una fuerza calibrada y medir la fuerza/desplazamiento generada por el sistema10. El módulo de fluorescencia añadido permite la obtención simultánea de imágenes de fluorescencia multicolor para realizar un seguimiento de la composición y el comportamiento de las proteínas.

El método principal para reconstituir plantillas de nucleosomas para smCFFM implica el ensamblaje de nucleosomas en plantillas de ADN personalizadas mediante diálisis salina 11,12,13. En este procedimiento, los octámeros de histonas purificadas se incuban con plantillas de ADN en un tampón con alto contenido de sal (~1 M de cloruro de sodio) y, a medida que la sal se dializa lentamente, los nucleosomas se ensamblan espontáneamente en el ADN de una manera posicional dependiente de la secuencia14,15. Como tal, es habitual que se incorporen secuencias fuertes de posicionamiento de nucleosomas (por ejemplo, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) dentro de las plantillas de ADN para generar matrices de nucleosomas personalizadas. Aunque este método bien establecido ofrece un control preciso sobre la ubicación y el número de nucleosomas en el ADN, sufre de varias desventajas: (1) la incorporación de secuencias de ADN de posicionamiento de nucleosoma fuertes puede generar nucleosomas artificialmente estables que sesgan la actividad de las proteínas de unión a la cromatina, (2) el proceso de diálisis salina para la formación de nucleosomas requiere altas cantidades de ADN y octámeros. y (3) el procedimiento requiere de uno a varios días de trabajo, así como un esfuerzo considerable para determinar la proporción correcta de ADN a octámero para una densidad óptima de la matriz de nucleosomas.

En este manuscrito, describimos un método alternativo para formar nucleosomas a lo largo del ADN in situ dentro de un microscopio de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula utilizando la chaperona de histonas recombinantes Nap1, que se asemeja a la vía fisiológica de formación de nucleosomas in vivo 18,19,20,21,22. Este método permite a los usuarios ensamblar nucleosomas en secuencias de ADN no específicas, ajustar fácilmente la densidad de nucleosomas y utilizar cantidades significativamente menores de reactivos, todo en cuestión de minutos. Además, la formación de ataduras de ADN nucleosómico in situ permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y la comodidad de la visualización y manipulación integradas de una sola molécula. Por lo tanto, cuando el posicionamiento uniforme y específico de los nucleosomas no es una necesidad, este protocolo ofrece una opción útil para la investigación de la mecánica de los nucleosomas o el comportamiento de las proteínas en la cromatina, para lo cual también describimos ejemplos de ensayos.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de ADN biotinilado

  1. Prepare una reacción de volumen de 120 μL que contenga 20 μg de λ ADN, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow y 1x NEB Buffer 2.
    NOTA: Este procedimiento utiliza específicamente ADN genómico lineal de doble cadena (ds) bacteriófago λ libre de metilación (48.502 bps), que contiene 12 nucleótidos (nt) 5' de ADN monocatenario (ss)saliente 23. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse para hacer uso de cualquier longitud o secuencia de dsDNA lineal siempre que contenga al menos varios nts de voladizos de ss 5', la longitud y la secuencia nt dictan el número de nts biotinilados instalados en cada extremo para el anclaje aguas abajo entre trampas ópticas. Además, la reacción se puede reducir. Por ejemplo, se pueden utilizar 5 μg de ADN en una reacción de volumen de 30 μL. Además, los sustratos de ADN generados de esta manera no están restringidos por la torsión. Para conocer los protocolos para crear ADN restringido por torsión, consulte los informes publicados anteriormente24,25.
  2. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Añadir 10 mM de EDTA e incubar a 75 °C durante 20 min.
  4. Realizar la precipitación de etanol para obtener el producto de ADN biotinilado.
    1. Agregue 0,1 veces el volumen de acetato de sodio 3 M y 3 veces el volumen de etanol 100% helado. Mantener a -20 °C durante al menos 1 h hasta toda la noche. Centrifugar a 13.500 x g durante 30 min a 4 °C.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar a 13.500 x g durante 1 min a 4 °C.
    3. Repita los pasos de eliminación del sobrenadante, adición de etanol y centrifugación.
    4. Retire con cuidado todo el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire durante 10 min. Disolver el pellet en 100-200 μL de tampón TE o ddH2O (se puede incubar a 37 °C para facilitar la disolución). Mida la concentración con un espectrofotómetro Nanodrop.

2. Preparación de canales en una celda de flujo

NOTA: Este procedimiento se basa en un chip microfluídico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales), pero se puede adaptar a cualquier instrumento smCFFM con una celda de flujo multicanal.

  1. Canales pasivados (cap.) 4 y 5 (o cualquier canal que contenga proteínas) (ver esquema de canales en la Figura 1A). Agregue 500 μL de BSA al 0.1% a cada canal y fluya a 0.8 bar (~0.45 μL/s para tubos con un diámetro interno de 0.010 pulgadas) durante 8 min. Retire la solución.
  2. Añadir 500 μL de Pluronic-F127 al 0,05% a cada canal y fluir a 0,8 bar durante 8 min. Retire la solución y enjuague las jeringas con 1x PBS. Añadir 2 mL de 1x PBS a cada canal y caudalizar a 0,8 bar durante 27 min.
  3. Agite la solución madre de perlas recubiertas de estreptavidina (este procedimiento utiliza perlas de 3,13 μm de tamaño) y agregue 2,15 μL de la solución de perlas a 1 mL de 1x PBS. Añádase al capítulo 1.
    NOTA: El tamaño y la concentración de las perlas recubiertas de estreptavidina se pueden ajustar según las preferencias del usuario.
  4. Añadir 30-80 ng de ADN λ biotinilado a 1 mL de 1x PBS. Añádase al capítulo 2.
    NOTA: La concentración de ADN biotinilado se puede ajustar según las preferencias del usuario. Mayores cantidades de ADN aumentarán la frecuencia de formación de ataduras de ADN, pero también aumentarán la frecuencia de atar múltiples moléculas de ADN a la vez, lo que puede aumentar la dificultad del experimento.

3. Formación de nucleosomas in situ mediada por Nap1

  1. Añada 500 μL de tampón de imagen sin proteínas al capítulo 3.
    NOTA: La composición del tampón en el capítulo 3 es flexible y debe ser apropiada tanto para los nucleosomas como para la(s) proteína(s) específica(s) de interés. Opcionalmente, los usuarios pueden optar por agregar sistemas de eliminación de oxígeno para reducir el fotoblanqueo de los fluoróforos y / o el ADN de la competencia para eliminar los octámeros de histonas que no están envueltos correctamente en los nucleosomas.
  2. Añadir 2 nM de S. cerevisiae Nap1 y 2-5 nM de octámero de histonas H4 marcadas con LD655 (HO) a 500 μL de tampón HR1x 18. Añádase al capítulo 4.
    NOTA: Los octámeros de histonas y Nap1 se pueden comprar comercialmente o preparar internamente (consulte la Tabla de materiales). El número de nucleosomas que se forman a lo largo de cada ADN anclado depende de la concentración del octámero, así como del tiempo que se pasa en este canal. La densidad de nucleosomas deseada y aproximada del usuario a lo largo de cada molécula de ADN se puede modular ajustando uno o ambos de estos parámetros. Además, el usuario puede optar por etiquetar los octámeros de histonas con su fluoróforo preferido.
  3. Opcional: Agregue proteína de unión a la cromatina u otra proteína de interés al canal 5 en un tampón apropiado.
  4. Fluya todos los canales a 1,0 bar (~0,55 μL/s en la configuración experimental actual) durante 30 s para lavar los canales de la celda de flujo con muestras.
  5. Ajuste el caudal a 0,2 bar (~0,16 μL/s en la configuración experimental actual). Mueva las trampas ópticas (OT) al canal 1 y atrape un par adecuado de perlas recubiertas de estreptavidina.
  6. Mueva los OT al canal 3, realice una calibración de fuerza para el par de cuentas, encienda el láser confocal rojo (u otra línea de láser de su elección) y calibre el área de imagen.
  7. Ajuste el caudal a 0,2 bar y mueva los OT al canal 2. Atrapa el ADN biotinilado.
  8. Mueva los OT al canal 3 y detenga el flujo. Aumente la distancia entre los OT para estirar el ADN y monitoree la curva de fuerza-distancia (FD) asociada para confirmar la presencia de un solo lazo de ADN (en lugar de múltiples ataduras). La curva debe seguir el modelo de cadena en forma de gusano para el dsDNA a la longitud de contorno dada26.
  9. Ajuste la distancia entre los OT para que la tensión del ADN sea de aproximadamente 1 pN.
    NOTA: 1 pN de tensión es lo suficientemente bajo como para permitir que los nucleosomas permanezcan envueltos por el ADN27 , pero es lo suficientemente alto como para colocar toda la molécula de ADN dentro del eje de imágenes de escaneo lineal.
  10. Activa el escaneo en línea para empezar a recoger un quimógrafo con el láser rojo activado.
    NOTA: Se pueden obtener kymogramas o escaneos 2D de ADN anclado, según las preferencias del usuario.
  11. Mueva los OT al canal 4 con el flujo apagado. Facilitados por Nap1, los HO se cargan en el ADN y se envuelven para formar nucleosomas en tiempo real. La carga de nucleosomas se visualiza como trayectorias fluorescentes que aparecen en el ADN dentro de los quimógrafos. Al mismo tiempo, la formación de nucleosomas en el ADN puede ser monitoreada por el aumento de fuerza a medida que se cargan más HO cuando las posiciones de los OT se mantienen constantes.
    NOTA: El láser de excitación de fluorescencia se puede apagar durante los pasos de formación de nucleosomas para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos. Además, la unión no específica de los octámeros de histonas al ADN, en la que los octámeros no están envueltos en nucleosomas, podría ocurrir utilizando este protocolo. Estos eventos de unión no generarán un "desgarro" cuando el ADN se estira, como se describe en el protocolo de desenvoltura de nucleosomas (paso 4) a continuación, y a veces pueden ser lavados por un flujo de tampón suave, particularmente si el tampón contiene ADN de la competencia libre.
  12. Cuando se forme el número aproximado deseado de nucleosomas, comience a recopilar datos.

4. Desenvolviendo nucleosomas

  1. Complete los pasos 2 y 3.
  2. Después de formar un lazo de ADN que contenga nucleosomas, mueva los OT al capítulo 3.
  3. Prepárese para los experimentos de desenvoltura de nucleosomas reduciendo la distancia entre los OT hasta que la fuerza sea aproximadamente cero. Poner a cero la fuerza.
  4. Comience a alejar el OT 1 del OT 2 a una velocidad constante de 0,1 μm/s. En un quimógrafo, la cuenta en OT 1 se alejará visualmente de la cuenta en OT 2. En la curva FD, la fuerza aumentará a medida que aumente la distancia. A medida que los nucleosomas se desenvuelven, aparecerán "rasgaduras" o transiciones en la fuerza (~ 8-37 pN) que significan el desenredo de la envoltura interna de los nucleosomas individuales 27,28,29.
    NOTA: La fuerza a la que se produce el desenrollado depende de la velocidad de tracción, que se espera para los procesos de no equilibrio. A veces, varios nucleosomas se desenvuelven a la vez, produciendo un cambio de distancia mayor en la transición en la curva FD. Además, el desenredo de la envoltura externa del nucleosoma no es fácilmente visible en este entorno experimental (ver la sección de Discusión).

5. Visualización de la unión de proteínas a la cromatina

  1. Complete los pasos 2 y 3.
  2. Agregue 10 nM de histona enlazadora H1.4 marcada con Cy3 a 500 μL de tampón de imagen en el capítulo 5.
    NOTA: Cualquier proteína de interés se puede agregar al canal 5 a una concentración de elección (generalmente por debajo de 100 nM para la visualización de una sola molécula).
  3. Después de formar una correa de ADN que contenga nucleosomas, encienda el láser verde además del láser rojo y mueva los OT al canal 5 para obtener imágenes en tiempo real de la unión de H1 a la cromatina.
  4. Continúe recolectando kymographs o escaneos hasta que se hayan logrado estadísticas suficientes (al menos ~ 10-20 kymographs dependiendo de la frecuencia de los eventos y la dificultad experimental).

Resultados

Usando la configuración descrita en el paso 3 (Figura 1A), la formación de nucleosomas a lo largo de la atadura de ADN se visualizó como la aparición de focos fluorescentes rojos en un escaneo 2D (Figuras 1B, izquierda) o trayectorias a lo largo del tiempo en un quimógrafo (Figura 1B, derecha). Los nucleosomas correctamente envueltos produjeron trayectorias de fluorescencia que permanecieron estacionarias en el tiempo dentro del límite de difracción de la detección confocal (~300 nm). En particular, los múltiples nucleosomas formados cerca unos de otros por debajo del límite de difracción no pueden resolverse espacialmente y aparecen como focos o trayectorias más brillantes. Sin embargo, se analizaron los pasos de fotoblanqueo de las trayectorias nucleosómicas individuales y con frecuencia mostraron eventos de fotoblanqueo de 1 paso (Figura 1C) o 2 pasos (Figura 1D), lo que indica que los focos contenían principalmente mononucleosomas dada la tasa de marcaje de aproximadamente el 70% de la proteína H4 en esta muestra. Además, sobre la base del recuento promedio de fotones para un solo fluoróforo LD655 en esta condición experimental, se estimó el número de copias de H4 marcadas en cada trayectoria de nucleosoma y se mostró que los loci de nucleosomas predominantemente (>75%) contenían 1 o 2 copias de H2A marcadas (Figura 1E), nuevamente consistente con la noción de que estaban cargados principalmente como mononucleosomas separados espacialmente. Los otros focos más brillantes contenían más de 3 copias de H4 marcado, probablemente representando múltiples nucleosomas dentro del límite de difracción.

La formación de nucleosomas también se monitoreó mediante un aumento en la tensión a lo largo de la correa cuando las posiciones de los OT permanecieron constantes a medida que más ADN se envolvía alrededor de los octámeros de histonas (Figura 1B, abajo). En ausencia de Nap1, los octámeros de histonas aún pueden unirse al ADN, pero permanecen en su mayoría sin envolver, ya que la tensión asociada cuando se mantuvieron las posiciones de OT permaneció constante (Figura 1F). Es posible que la unión no específica de los octámeros de histonas al ADN ocurra incluso en presencia de Nap1. En otro experimento, se realizó el mismo protocolo para formar nucleosomas que contienen H2A marcado con Cy3, que arrojó resultados similares a los realizados con H4 marcado con LD655 (Figura 1G), lo que indica el ensamblaje de octámeros intactos en nucleosomas.

Usando la configuración descrita en el paso 4 (Figura 2A), el desenvolvimiento de nucleosomas se visualizó a lo largo del tiempo en un quimógrafo a medida que aumentaba la distancia de amarre (Figura 2B). Se informó previamente que los octámeros de histonas a menudo permanecen unidos al ADN después de ser desenvueltos30,31 y, por lo tanto, las trayectorias fluorescentes a menudo persisten incluso a altas tensiones. También se monitorizó el desenvolvimiento de nucleosomas en la curva FD asociada (Figura 2C). Las características cuantificables de la curva FD incluyen la fuerza a la que los nucleosomas se desenvuelven (ver "Transición F" en el recuadro de la Figura 2C), así como la longitud del ADN que se liberó del octámero de histonas (ver "ΔL" en el recuadro de la Figura 2C), que existe en múltiplos de ~24 nm, consistente con el desenvolvimiento independiente de las vueltas internas del ADN de los nucleosomas individuales27, Artículo 30. Estos parámetros se pueden utilizar para estimar el número de nucleosomas formados en cada atadura o para un análisis posterior adicional de la mecánica de los nucleosomas. Como tal, el número de rupturas de giro interno obtenidas de experimentos de tracción mecánica se comparó con el número estimado de copias de H4 marcadas en cada trayectoria de nucleosoma en función de la intensidad del monómero, lo que mostró que los números son en gran medida consistentes (ejemplos mostrados en las Figuras 2D-G). Sin embargo, se observó que no coinciden perfectamente debido a la eficiencia marcada de ~ 70% de la proteína H4 en la muestra y cualquier histona residual independiente de Nap1 que se une al ADN, como se muestra en la Figura 1F. Finalmente, como se esperaba, el estiramiento de las ataduras de ADN desnudo unidas a Nap1 (sin histonas) no genera transiciones inducidas por la fuerza (Figura 2H), lo que indica que Nap1 por sí sola no distorsiona significativamente el ADN.

Empleando la configuración descrita en el paso 5 (Figura 3A), la unión de la histona enlazadora H1 a la cromatina se visualizó como la aparición de focos fluorescentes verdes a lo largo de la atadura de la cromatina (Figura 3B). En particular, los nucleosomas unidos a H1 generaron trayectorias de doble color (véanse las flechas blancas en la Figura 3B) que parecían estacionarias a lo largo del tiempo. Además, se observaron trayectorias difusas de H1 a través de regiones de ADN libres de nucleosomas (ver estrellas verdes en la Figura 3B).

figure-results-1
Figura 1: Formación de nucleosomas in situ mediada por Nap1. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de formación de nucleosomas in situ mediado por Nap1 (paso 3). Un par de perlas quedaron atrapadas ópticamente en el canal 1, y una sola molécula de ADN λ se ató entre las perlas a través de un enlace biotina-estreptavidina en el capítulo 2. A continuación, el cable se trasladó al canal 4, que contenía octámeros de histonas marcados con LD655 (rojo) y Nap1 para la formación en tiempo real de nucleosomas en todo el ADN. (B) Escaneo 2D representativo (izquierda) y cimógrafo (derecha) de un anillo de ADN que contiene nucleosoma marcado con LD655-H4. La lectura de fuerza asociada (abajo) muestra un aumento en la fuerza inmediatamente a medida que la correa se mueve al canal 4 cuando las posiciones de OT se mantienen constantes, lo que indica envoltura de nucleosomas. Las trayectorias más brillantes significan múltiples nucleosomas adyacentes ubicados dentro del límite de difracción de ~300 nm. (C) Ejemplo de quimógrafo que muestra un evento de fotoblanqueo de 1 paso (flecha blanca) de un nucleosoma que contiene LD655-H4. (D) Ejemplo de quimógrafo que muestra un evento de fotoblanqueo de 2 pasos (flechas blancas) de un nucleosoma que contiene LD655-H4. (E) Frecuencia relativa del número de H4 marcados con DL655 por trayectoria estimada a partir de su intensidad de fluorescencia. (F) Quimógrafo representativo de una correa unida con octámeros de histonas en ausencia de Nap1. La lectura de fuerza asociada (abajo) permanece sin cambios incluso cuando los octámeros de histonas se unen al ADN. (G) Quimógrafo representativo de una correa de ADN que contiene nucleosoma marcada con Cy3-H2A. La lectura de fuerza asociada (abajo) muestra un aumento de fuerza inmediatamente a medida que la correa se mueve al canal 4 (que contiene octámeros y Nap1), ya que se forman nucleosomas cuando las posiciones de OT se mantienen constantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Ensayo de desenvoltura de nucleosomas. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de desenvoltura de nucleosomas (paso 4). El lazo de ADN que contiene nucleosomas se movió al canal 3 que contiene un tampón de imagen libre de proteínas, donde se aumentó la distancia entre cuentas y se desenvolvieron los nucleosomas. (B) Quimógrafo representativo de un lazo de ADN que contiene nucleosoma tirado a altas fuerzas al aumentar gradualmente la distancia entre cuentas. La disminución de la intensidad de la fluorescencia hacia la cuenta inferior probablemente se debió a que el ADN se inclinó ligeramente fuera del enfoque de escaneo de línea. (C) La curva FD asociada que muestra transiciones inducidas por la fuerza del desenvolvimiento del giro interior que ocurren entre 8-37 pN. El recuadro muestra una vista ampliada de un ejemplo de transición para el que se puede registrar y analizar más a fondo la distancia no envuelta (ΔL = ~24 nm para el giro interno del ADN de los nucleosomas individuales) y la fuerza de transición (Transición F). Para esta correa, se desenvolvieron 26 nucleosomas y la atadura se rompió a ~ 65 pN, como lo denota la línea punteada blanca en el quimógrafo. (D,E) Ejemplo de amarre que contiene nucleosomas LD655-H4 tirado a fuerzas altas donde el número de H4 por trayectoria se estima a través de la intensidad de fluorescencia (indicada en el cimograma, D) y el número de nucleosomas envueltos se estima a través del tamaño del cambio de distancia inducido por la fuerza (indicado en la curva de fuerza-distancia asociada, E). (F,G) Otro ejemplo como en (D,E). (H) Las ataduras de ADN (n = 5) se atraen a altas fuerzas después de ser incubadas en un canal que contiene Nap1 solamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Visualización de la interacción proteína-cromatina. (A) Esquema de la configuración experimental descrita en el protocolo de visualización de la unión de proteínas a la cromatina (paso 5). El lazo de ADN que contiene nucleosomas se movió al canal 5, que contiene 10 nM de histona enlazadora H1 marcada con Cy3 (verde). (B) Quimógrafo representativo de dos colores de la unión de H1 a una atadura de ADN que contiene nucleosomas. Los eventos de colocalización de nucleosomas H1 se indican con flechas blancas. La trayectoria de los nucleosomas no unidos se denota con la flecha magenta. Las moléculas H1 que se difunden en el ADN desnudo se denotan con estrellas verdes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo descrito proporciona varias ventajas para la reconstitución de nucleosomas, incluida la minimización de los reactivos y el tiempo, así como la habilitación de la formación de nucleosomas dependientes de chaperonas a lo largo de cualquier secuencia de ADN (potencialmente nativa). Además, el método in situ permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición conveniente hacia ensayos de una sola molécula de la mecánica de nucleosomas y la interacción proteína-cromatina. Por otro lado, las limitaciones de este enfoque incluyen la incapacidad de dirigir el posicionamiento de los nucleosomas a lo largo del ADN (incluso con la incorporación de secuencias fuertes de posicionamiento de nucleosomas) y controlar con precisión el número de nucleosomas formados por atadura de ADN (aunque esto se puede ajustar empíricamente estandarizando el flujo de trabajo experimental). En efecto, quienes eligen este método apuestan por un control preciso de la posición y la densidad de los nucleosomas para facilitar el flujo de trabajo y reducir la necesidad de reactivos, cuya elección depende de cada experimento específico. También se observa que el giro externo del ADN no se resuelve en el protocolo actual debido a la larga longitud de la correa (~48,5 kbps) y las condiciones de amortiguación32. Para obtener información sobre el giro externo del ADN, así como el apilamiento entre nucleosomas, el usuario puede optar por acortar la longitud del ADN y cargar una mayor densidad de nucleosomas en el ADN y/o utilizar el método de diálisis salina para colocar nucleosomas en secuencias de posicionamiento fuertes que están separadas por longitudes de enlace regulares. Por último, es probable que se produzca una unión inespecífica de los octámeros de histonas al ADN; Por lo tanto, es importante tener en cuenta tanto las señales de fluorescencia como las de fuerza a la hora de interpretar los resultados.

Un aspecto crítico del protocolo actual es garantizar que el usuario haya logrado una alta tasa de marcaje fluorescente para los octámeros de histonas (si se requiere visualización) para que la mayoría de los nucleosomas, si no todos, puedan detectarse visualmente. Otro aspecto crítico es confirmar que el usuario ha elegido un tampón adecuado para el canal de imagen que sea compatible con los nucleosomas y cualquier otra proteína de interés. Las modificaciones específicas del usuario al protocolo pueden incluir la conjugación de fluoróforos a una histona diferente (véanse los informes33,34 para ver ejemplos de uso de este método para formar nucleosomas con H3 o H2B marcados), la elección de un fluoróforo alternativo, la incorporación de ataduras de ADN de diferentes secuencias y longitudes, la adición de un sistema de eliminación de oxígeno para prolongar la vida útil de los fluoróforos, la elección de un tamaño de perla diferente, y la utilización de un sistema alternativo de conjugación ADN-perlas (por ejemplo, enlace de anticuerpos digoxigenina-anti-digoxigenina).

En resumen, el método descrito proporciona a smCFFM un enfoque conveniente y versátil para generar ataduras que contienen nucleosomas que se pueden emplear fácilmente para estudiar una amplia gama de preguntas centradas en la cromatina en biología. Las áreas de investigación aplicables incluyen la mecánica de la cromatina regulada por variantes de histonas y modificaciones postraduccionales, el compromiso biofísico y la cinética de las proteínas de unión a la cromatina, y los procesos de ensamblaje de orden superior dirigidos por nucleosomas, como la condensación biomolecular 35,36,37,38.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

G. N. L. C. reconoce el apoyo del Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el premio número F31MH132306. S. L. cuenta con el apoyo de la Fundación Robertson, la Fundación Internacional del Síndrome de Rett y los NIH (número de premio R01GM149862).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x Tampón HRN/AN/A30 mM  tris  acetato pH 7,5, 20 mM acetato de magnesio, 50 mM cloruro de potasio, 0,1 mg/mL BSA 
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)N/AN/A137 mM cloruro de sodio, 2,7 mM cloruro de potasio, 10 mM fosfato de sodio dibásico, 1,8 mM fosfato de potasio monobásico 
Ácido acético, glacialMillipore SigmaAX0074-6Úselo para hacer acetato de tris
Biotina-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotina-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotina-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA9418-50GDisolver en H2O y se ejecuta a través de un filtro de mmm de 0,22
Cy3 Maleimida Colorante mono-reactivoCytivaPA23031Maleimida funcionalizado Fluoróforo
Cy3 dGTPNueva Inglaterra BiolabsN0442S
Centrífuga Eppendorf 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrífuga de sobremesa con
alcohol etílicoMillipore Sigma459844
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Millipore SigmaE9884Se disuelve en H2O a 0,5 M
Octámero de histonas humanas (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/A Lasproteínas histonas recombinantes y las que albergan mutaciones de marcaje se purificaron internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34, 35, 36). Brevemente, las histonas recombinantes se expresaron en células BL21 (De3) pLySS (Promega). Los cuerpos de inclusión se aislaron después de la sonicación y las histonas se extrajeron en condiciones de desnaturalización. Las histonas se dializaron en tampón A (7 M de urea, 10 mM de clorhidrato de tris pH 8.0, 100 mM de cloruro de sodio, 1 mM de EDTA y 5 mM de 2-mercaptoetanol), y la solución se agregó a una columna de gravedad cargada con Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). A continuación, el flujo se añadió a una columna de gravedad cargada con SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), y las histonas se eluyeron de la columna añadiendo tampón A suplementado con cloruro de sodio de 600 mM. Las histonas que albergan mutaciones de marcaje (H4, L50C; H2A, K119C) se purificaron y luego se conjugaron con el fluoróforo deseado a través de colorantes funcionalizados con maleimida (Cytiva, Lumidyne) utilizando una relación molar de colorante a proteína de 20:1 (ver refs. 33, 34). Los octámeros de histonas se ensamblaron agregando una proporción molar igual de cada histona de tipo salvaje o marcada con fluoróforos en condiciones de desnaturalización, se dializaron en un tampón con alto contenido de sal que contenía cloruro de sodio 2 M y luego se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se describió anteriormente (ver refs. 36, 37). Alternativamente, las proteínas de histonas individuales y los octámeros de histonas listos para usar se pueden comprar comercialmente (por ejemplo, Epicypher). 
Tampón de imagenN/AN/A20 mM clorhidrato de tris pH 8.0, cloruro de sodio de 100
mM Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Libre de metilación y lambda; ADN
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimida funcionalizada Fluoróforo LD655
Enlazador histona H1.4 (A4C)N/AN/A Proteínarecombinante purificada de fabricación propia (ver ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfiguración de doble trampa; materiales estándar para el instrumento proporcionados por el fabricante
Solución de acetato de magnesioMillipore Sigma63052-100MLÚselo para hacer tampón HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluido con el kit de fragmentos Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDisolver en H2O y pasar a través de un filtro de 0,22 mmm
Cloruro de potasioMillipore SigmaP3911Úselo para hacer PBS y tampón HR
Fosfato de potasio monobásicoMillipore SigmaP0662Uso para hacer PBS
em>S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 se purificó internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34). Alternativamente, Nap1 se puede comprar comercialmente (por ejemplo, Active Motif).
Acetato de sodioMillipore Sigma241245Disolver en H2O a 3 M
Cloruro de sodioMillipore SigmaS9888Úselo para hacer PBS y tampón de imagen
Fosfato de sodio dibásicoMillipore SigmaS9763Úselo para hacer
partículas recubiertas de biotina PBS SPHERO (3.0-3.4 y micro; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c EspectrofotómetroFisher ScientificND2000NanoDrop Tris
BaseFisher ScientificBP152-500Disolver en H2O y ajustar al pH apropiado; úselo para hacer tampón de imagen y acetato de tris
refrigerante, puro <

Referencias

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. Nucleosome structure and dynamics are coming of age. Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).
  4. McGinty, R. K., Tan, S. Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes. Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).
  5. Fierz, B., Poirier, M. G. Biophysics of chromatin dynamics. Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).
  6. Single-molecule techniques: A laboratory manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  7. Chua, G. N. L., Liu, S. When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions. Annu Rev Biophys. , (2024).
  8. Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy. Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).
  9. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11, 288(1986).
  10. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  11. Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence. J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).
  12. Salt Peterson, C. L. gradient dialysis reconstitution of nucleosomes. CSH Protoc. 2008, 5113(2008).
  13. Leicher, R., Liu, S. Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers. Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).
  14. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, 772-778 (2006).
  15. Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. Nucleosome positions predicted through comparative genomics. Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).
  16. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).
  17. Chipev, C. C., Wolffe, A. P. Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo. Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).
  18. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181, 1380-1394 (2020).
  19. Vlijm, R., et al. Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes. PLoS One. 10, e0141267(2015).
  20. Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1. J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).
  21. Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor. J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).
  22. Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions. Mol Cell. 37, 834-842 (2010).
  23. Wu, R., Taylor, E. Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).
  24. King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint. Nat Commun. 7, 11810(2016).
  25. Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method. Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).
  26. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  27. Diaz-Celis, C., et al. Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).
  28. Leicher, R., et al. Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).
  29. Chua, G. N. L., et al. Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes. bioRxiv. , (2023).
  30. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).
  31. McCauley, M. J., et al. Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes. Cell Rep. 41, 111858(2022).
  32. Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. Effect of force on mononucleosomal dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).
  33. Li, S., et al. Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence. Nat Commun. 13, 4947(2022).
  34. Li, S., et al. Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity. Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).
  35. Harada, B. T., et al. Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes. Elife. 5, e10051(2016).
  36. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution. Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).
  37. Rogge, R. A., et al. Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA. J Vis Exp. (79), e50354(2013).
  38. Leicher, R., et al. Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1. Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Reconstituci n in situmicroscop a de mol cula nicamicroscop a de fuerzamec nica de la cromatinachaperona de histonas Nap1anclaje de ADNdesenrollamiento del nucleosomauni n de histonas de enlace

Artículos relacionados