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Artículo de método

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

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DOI:

10.3791/66579

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6 de septiembre de 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Resumen

Los nucleosomas constituyen la unidad primaria de la cromatina eucariota y han sido objeto de numerosas investigaciones informativas sobre moléculas individuales con respecto a sus propiedades biofísicas e interacciones con las proteínas de unión a la cromatina. La reconstitución de nucleosomas en el ADN para estos estudios generalmente implica un procedimiento de diálisis salina que proporciona un control preciso sobre la ubicación y el número de nucleosomas formados a lo largo de una correa de ADN. Sin embargo, este protocolo requiere mucho tiempo y requiere una cantidad sustancial de cadencia de ADN e histonas como entradas. Para ofrecer una estrategia alternativa, se describe un método de reconstitución de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza y fluorescencia de una sola molécula que utiliza la chaperona de histonas Nap1. Este método permite a los usuarios ensamblar nucleosomas en cualquier molde de ADN sin la necesidad de secuencias de posicionamiento de nucleosomas fuertes, ajustar la densidad de nucleosomas a pedido y usar menos reactivos. La formación de nucleosomas in situ se produce en cuestión de segundos, lo que ofrece un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición cómoda a las mediciones de una sola molécula. Se describen con más detalle ejemplos de dos ensayos posteriores para sondear la mecánica de los nucleosomas y visualizar el comportamiento de las proteínas individuales en la cromatina.

Introducción

La unidad de empaquetamiento primario de la cromatina eucariota es el nucleosoma, en el que ~ 147 pares de bases (bps) de ADN se envuelven alrededor de un octámero de proteínas histonascentrales 1,2. Además del empaquetamiento del genoma, la arquitectura del nucleosoma sirve como otra rica capa de regulación biofísica que puede ser aprovechada por las proteínas de unión a la cromatina cuando realizan sus diversas funciones 3,4. El acceso experimental y la medición de las características físicas de los nucleosomas ha sido un desafío técnico, ya que estas unidades funcionan a escalas minúsculas (por ejemplo, longitudes nanométricas, fuerzas de piconewton) y, por lo tanto, su sondeo requiere suficiente sensibilidad y precisión para informar significativamente la función. Además, las proteínas de unión a la cromatina a menudo interactúan con sus sustratos de manera transitoria, y la mayoría de los enfoques de conjunto carecen de una resolución temporal adecuada para informar la cinética de estas interacciones5. Afortunadamente, el advenimiento de las técnicas de una sola molécula ha hecho posible visualizar y manipular proteínas individuales y sus interacciones en tiempo real, revelando información mecanicista sobre estos eventos moleculares que ocurren a nanoescala6. En particular, la microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula (smCFFM) aprovecha las herramientas de detección de fluorescencia de alta resolución y manipulación de fuerza para resolver simultáneamente la mecánica, la composición y la coordinación de los complejos de cromatina y cromatina-proteína 7,8.

En smCFFM que emplea específicamente "pinzas ópticas" como método de manipulación de fuerza, se utiliza un láser estrechamente enfocado para atrapar un objeto dieléctrico, generalmente una cuenta de plástico del tamaño de una micra, en tresdimensiones. Un biopolímero, como un fragmento de ADN, puede conjugarse con la perla (a través, por ejemplo, del enlace de anticuerpos estreptavidina-biotina, digoxigenina-antidigoxigenina), y el usuario puede aplicar una fuerza calibrada y medir la fuerza/desplazamiento generada por el sistema10. El módulo de fluorescencia añadido permite la obtención simultánea de imágenes de fluorescencia multicolor para realizar un seguimiento de la composición y el comportamiento de las proteínas.

El método principal para reconstituir plantillas de nucleosomas para smCFFM implica el ensamblaje de nucleosomas en plantillas de ADN personalizadas mediante diálisis salina 11,12,13. En este procedimiento, los octámeros de histonas purificadas se incuban con plantillas de ADN en un tampón con alto contenido de sal (~1 M de cloruro de sodio) y, a medida que la sal se dializa lentamente, los nucleosomas se ensamblan espontáneamente en el ADN de una manera posicional dependiente de la secuencia14,15. Como tal, es habitual que se incorporen secuencias fuertes de posicionamiento de nucleosomas (por ejemplo, Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) dentro de las plantillas de ADN para generar matrices de nucleosomas personalizadas. Aunque este método bien establecido ofrece un control preciso sobre la ubicación y el número de nucleosomas en el ADN, sufre de varias desventajas: (1) la incorporación de secuencias de ADN de posicionamiento de nucleosoma fuertes puede generar nucleosomas artificialmente estables que sesgan la actividad de las proteínas de unión a la cromatina, (2) el proceso de diálisis salina para la formación de nucleosomas requiere altas cantidades de ADN y octámeros. y (3) el procedimiento requiere de uno a varios días de trabajo, así como un esfuerzo considerable para determinar la proporción correcta de ADN a octámero para una densidad óptima de la matriz de nucleosomas.

En este manuscrito, describimos un método alternativo para formar nucleosomas a lo largo del ADN in situ dentro de un microscopio de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula utilizando la chaperona de histonas recombinantes Nap1, que se asemeja a la vía fisiológica de formación de nucleosomas in vivo 18,19,20,21,22. Este método permite a los usuarios ensamblar nucleosomas en secuencias de ADN no específicas, ajustar fácilmente la densidad de nucleosomas y utilizar cantidades significativamente menores de reactivos, todo en cuestión de minutos. Además, la formación de ataduras de ADN nucleosómico in situ permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y la comodidad de la visualización y manipulación integradas de una sola molécula. Por lo tanto, cuando el posicionamiento uniforme y específico de los nucleosomas no es una necesidad, este protocolo ofrece una opción útil para la investigación de la mecánica de los nucleosomas o el comportamiento de las proteínas en la cromatina, para lo cual también describimos ejemplos de ensayos.

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Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de ADN biotinilado

  1. Prepare una reacción de volumen de 120 μL que contenga 20 μg de λ ADN, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow y 1x NEB Buffer 2.
    NOTA: Este procedimiento utiliza específicamente ADN genómico lineal de doble cadena (ds) bacteriófago λ libre de metilación (48.502 bps), que contiene 12 nucleótidos (nt) 5' de ADN monocatenario (ss)saliente 23. Sin embargo, el protocolo puede adaptarse para hacer uso de cualquier longitud o secuencia de dsDNA lineal siempre que contenga al menos varios nts de voladizos de ss 5', la longitud y la secuencia nt dictan el número de nts biotinilados instalados en cada extremo para el anclaje aguas abajo entre trampas ópticas. Además, la reacción se puede reducir. Por ejemplo, se pueden utilizar 5 μg de ADN en una reacción de volumen de 30 μL. Además, los sustratos de ADN generados de esta manera no están restringidos por la torsión. Para conocer los protocolos para crear ADN restringido por torsión, consulte los informes publicados anteriormente24,25.
  2. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Añadir 10 mM de EDTA e incubar a 75 °C durante 20 min.
  4. Realizar la precipitación de etanol para obtener el producto de ADN biotinilado.
    1. Agregue 0,1 veces el volumen de acetato de sodio 3 M y 3 veces el volumen de etanol 100% helado. Mantener a -20 °C durante al menos 1 h hasta toda la noche. Centrifugar a 13.500 x g durante 30 min a 4 °C.
    2. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar a 13.500 x g durante 1 min a 4 °C.
    3. Repita los pasos de eliminación del sobrenadante, adición de etanol y centrifugación.
    4. Retire con cuidado todo el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire durante 10 min. Disolver el pellet en 100-200 μL de tampón TE o ddH2O (se puede incubar a 37 °C para facilitar la disolución). Mida la concentración con un espectrofotómetro Nanodrop.

2. Preparación de canales en una celda de flujo

NOTA: Este procedimiento se basa en un chip microfluídico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales), pero se puede adaptar a cualquier instrumento smCFFM con una celda de flujo multicanal.

  1. Canales pasivados (cap.) 4 y 5 (o cualquier canal que contenga proteínas) (ver esquema de canales en la Figura 1A). Agregue 500 μL de BSA al 0.1% a cada canal y fluya a 0.8 bar (~0.45 μL/s para tubos con un diámetro interno de 0.010 pulgadas) durante 8 min. Retire la solución.
  2. Añadir 500 μL de Pluronic-F127 al 0,05% a cada canal y fluir a 0,8 bar durante 8 min. Retire la solución y enjuague las jeringas con 1x PBS. Añadir 2 mL de 1x PBS a cada canal y caudalizar a 0,8 bar durante 27 min.
  3. Agite la solución madre de perlas recubiertas de estreptavidina (este procedimiento utiliza perlas de 3,13 μm de tamaño) y agregue 2,15 μL de la solución de perlas a 1 mL de 1x PBS. Añádase al capítulo 1.
    NOTA: El tamaño y la concentración de las perlas recubiertas de estreptavidina se pueden ajustar según las preferencias del usuario.
  4. Añadir 30-80 ng de ADN λ biotinilado a 1 mL de 1x PBS. Añádase al capítulo 2.
    NOTA: La concentración de ADN biotinilado se puede ajustar según las preferencias del usuario. Mayores cantidades de ADN aumentarán la frecuencia de formación de ataduras de ADN, pero también aumentarán la frecuencia de atar múltiples moléculas de ADN a la vez, lo que puede aumentar la dificultad del experimento.

3. Formación de nucleosomas in situ mediada por Nap1

  1. Añada 500 μL de tampón de imagen sin proteínas al capítulo 3.
    NOTA: La composición del tampón en el capítulo 3 es flexible y debe ser apropiada tanto para los nucleosomas como para la(s) proteína(s) específica(s) de interés. Opcionalmente, los usuarios pueden optar por agregar sistemas de eliminación de oxígeno para reducir el fotoblanqueo de los fluoróforos y / o el ADN de la competencia para eliminar los octámeros de histonas que no están envueltos correctamente en los nucleosomas.
  2. Añadir 2 nM de S. cerevisiae Nap1 y 2-5 nM de octámero de histonas H4 marcadas con LD655 (HO) a 500 μL de tampón HR1x 18. Añádase al capítulo 4.
    NOTA: Los octámeros de histonas y Nap1 se pueden comprar comercialmente o preparar internamente (consulte la Tabla de materiales). El número de nucleosomas que se forman a lo largo de cada ADN anclado depende de la concentración del octámero, así como del tiempo que se pasa en este canal. La densidad de nucleosomas deseada y aproximada del usuario a lo largo de cada molécula de ADN se puede modular ajustando uno o ambos de estos parámetros. Además, el usuario puede optar por etiquetar los octámeros de histonas con su fluoróforo preferido.
  3. Opcional: Agregue proteína de unión a la cromatina u otra proteína de interés al canal 5 en un tampón apropiado.
  4. Fluya todos los canales a 1,0 bar (~0,55 μL/s en la configuración experimental actual) durante 30 s para lavar los canales de la celda de flujo con muestras.
  5. Ajuste el caudal a 0,2 bar (~0,16 μL/s en la configuración experimental actual). Mueva las trampas ópticas (OT) al canal 1 y atrape un par adecuado de perlas recubiertas de estreptavidina.
  6. Mueva los OT al canal 3, realice una calibración de fuerza para el par de cuentas, encienda el láser confocal rojo (u otra línea de láser de su elección) y calibre el área de imagen.
  7. Ajuste el caudal a 0,2 bar y mueva los OT al canal 2. Atrapa el ADN biotinilado.
  8. Mueva los OT al canal 3 y detenga el flujo. Aumente la distancia entre los OT para estirar el ADN y monitoree la curva de fuerza-distancia (FD) asociada para confirmar la presencia de un solo lazo de ADN (en lugar de múltiples ataduras). La curva debe seguir el modelo de cadena en forma de gusano para el dsDNA a la longitud de contorno dada26.
  9. Ajuste la distancia entre los OT para que la tensión del ADN sea de aproximadamente 1 pN.
    NOTA: 1 pN de tensión es lo suficientemente bajo como para permitir que los nucleosomas permanezcan envueltos por el ADN27 , pero es lo suficientemente alto como para colocar toda la molécula de ADN dentro del eje de imágenes de escaneo lineal.
  10. Activa el escaneo en línea para empezar a recoger un quimógrafo con el láser rojo activado.
    NOTA: Se pueden obtener kymogramas o escaneos 2D de ADN anclado, según las preferencias del usuario.
  11. Mueva los OT al canal 4 con el flujo apagado. Facilitados por Nap1, los HO se cargan en el ADN y se envuelven para formar nucleosomas en tiempo real. La carga de nucleosomas se visualiza como trayectorias fluorescentes que aparecen en el ADN dentro de los quimógrafos. Al mismo tiempo, la formación de nucleosomas en el ADN puede ser monitoreada por el aumento de fuerza a medida que se cargan más HO cuando las posiciones de los OT se mantienen constantes.
    NOTA: El láser de excitación de fluorescencia se puede apagar durante los pasos de formación de nucleosomas para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos. Además, la unión no específica de los octámeros de histonas al ADN, en la que los octámeros no están envueltos en nucleosomas, podría ocurrir utilizando este protocolo. Estos eventos de unión no generarán un "desgarro" cuando el ADN se estira, como se describe en el protocolo de desenvoltura de nucleosomas (paso 4) a continuación, y a veces pueden ser lavados por un flujo de tampón suave, particularmente si el tampón contiene ADN de la competencia libre.
  12. Cuando se forme el número aproximado deseado de nucleosomas, comience a recopilar datos.

4. Desenvolviendo nucleosomas

  1. Complete los pasos 2 y 3.
  2. Después de formar un lazo de ADN que contenga nucleosomas, mueva los OT al capítulo 3.
  3. Prepárese para los experimentos de desenvoltura de nucleosomas reduciendo la distancia entre los OT hasta que la fuerza sea aproximadamente cero. Poner a cero la fuerza.
  4. Comience a alejar el OT 1 del OT 2 a una velocidad constante de 0,1 μm/s. En un quimógrafo, la cuenta en OT 1 se alejará visualmente de la cuenta en OT 2. En la curva FD, la fuerza aumentará a medida que aumente la distancia. A medida que los nucleosomas se desenvuelven, aparecerán "rasgaduras" o transiciones en la fuerza (~ 8-37 pN) que significan el desenredo de la envoltura interna de los nucleosomas individuales 27,28,29.
    NOTA: La fuerza a la que se produce el desenrollado depende de la velocidad de tracción, que se espera para los procesos de no equilibrio. A veces, varios nucleosomas se desenvuelven a la vez, produciendo un cambio de distancia mayor en la transición en la curva FD. Además, el desenredo de la envoltura externa del nucleosoma no es fácilmente visible en este entorno experimental (ver la sección de Discusión).

5. Visualización de la unión de proteínas a la cromatina

  1. Complete los pasos 2 y 3.
  2. Agregue 10 nM de histona enlazadora H1.4 marcada con Cy3 a 500 μL de tampón de imagen en el capítulo 5.
    NOTA: Cualquier proteína de interés se puede agregar al canal 5 a una concentración de elección (generalmente por debajo de 100 nM para la visualización de una sola molécula).
  3. Después de formar una correa de ADN que contenga nucleosomas, encienda el láser verde además del láser rojo y mueva los OT al canal 5 para obtener imágenes en tiempo real de la unión de H1 a la cromatina.
  4. Continúe recolectando kymographs o escaneos hasta que se hayan logrado estadísticas suficientes (al menos ~ 10-20 kymographs dependiendo de la frecuencia de los eventos y la dificultad experimental).

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Resultados

Usando la configuración descrita en el paso 3 (Figura 1A), la formación de nucleosomas a lo largo de la atadura de ADN se visualizó como la aparición de focos fluorescentes rojos en un escaneo 2D (Figuras 1B, izquierda) o trayectorias a lo largo del tiempo en un quimógrafo (Figura 1B, derecha). Los nucleosomas correctamente envueltos produjeron trayectorias de fluorescencia que permanecieron estacionarias en el tiempo dentro del lím...

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Discusión

El protocolo descrito proporciona varias ventajas para la reconstitución de nucleosomas, incluida la minimización de los reactivos y el tiempo, así como la habilitación de la formación de nucleosomas dependientes de chaperonas a lo largo de cualquier secuencia de ADN (potencialmente nativa). Además, el método in situ permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición conveniente hacia ensayos de una sola molécula de la mecánica de nucleosomas y la interacción...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

G. N. L. C. reconoce el apoyo del Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el premio número F31MH132306. S. L. cuenta con el apoyo de la Fundación Robertson, la Fundación Internacional del Síndrome de Rett y los NIH (número de premio R01GM149862).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x Tampón HRN/AN/A30 mM  tris  acetato pH 7,5, 20 mM acetato de magnesio, 50 mM cloruro de potasio, 0,1 mg/mL BSA 
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)N/AN/A137 mM cloruro de sodio, 2,7 mM cloruro de potasio, 10 mM fosfato de sodio dibásico, 1,8 mM fosfato de potasio monobásico 
Ácido acético, glacialMillipore SigmaAX0074-6Úselo para hacer acetato de tris
Biotina-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotina-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotina-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA9418-50GDisolver en H2O y se ejecuta a través de un filtro de mmm de 0,22
Cy3 Maleimida Colorante mono-reactivoCytivaPA23031Maleimida funcionalizado Fluoróforo
Cy3 dGTPNueva Inglaterra BiolabsN0442S
Centrífuga Eppendorf 5425 RFisher Scientific05-414-051Centrífuga de sobremesa con
alcohol etílicoMillipore Sigma459844
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Millipore SigmaE9884Se disuelve en H2O a 0,5 M
Octámero de histonas humanas (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/A Lasproteínas histonas recombinantes y las que albergan mutaciones de marcaje se purificaron internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34, 35, 36). Brevemente, las histonas recombinantes se expresaron en células BL21 (De3) pLySS (Promega). Los cuerpos de inclusión se aislaron después de la sonicación y las histonas se extrajeron en condiciones de desnaturalización. Las histonas se dializaron en tampón A (7 M de urea, 10 mM de clorhidrato de tris pH 8.0, 100 mM de cloruro de sodio, 1 mM de EDTA y 5 mM de 2-mercaptoetanol), y la solución se agregó a una columna de gravedad cargada con Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). A continuación, el flujo se añadió a una columna de gravedad cargada con SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), y las histonas se eluyeron de la columna añadiendo tampón A suplementado con cloruro de sodio de 600 mM. Las histonas que albergan mutaciones de marcaje (H4, L50C; H2A, K119C) se purificaron y luego se conjugaron con el fluoróforo deseado a través de colorantes funcionalizados con maleimida (Cytiva, Lumidyne) utilizando una relación molar de colorante a proteína de 20:1 (ver refs. 33, 34). Los octámeros de histonas se ensamblaron agregando una proporción molar igual de cada histona de tipo salvaje o marcada con fluoróforos en condiciones de desnaturalización, se dializaron en un tampón con alto contenido de sal que contenía cloruro de sodio 2 M y luego se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño como se describió anteriormente (ver refs. 36, 37). Alternativamente, las proteínas de histonas individuales y los octámeros de histonas listos para usar se pueden comprar comercialmente (por ejemplo, Epicypher). 
Tampón de imagenN/AN/A20 mM clorhidrato de tris pH 8.0, cloruro de sodio de 100
mM Fragmento de Klenow (3' a 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Libre de metilación y lambda; ADN
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimida funcionalizada Fluoróforo LD655
Enlazador histona H1.4 (A4C)N/AN/A Proteínarecombinante purificada de fabricación propia (ver ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/AConfiguración de doble trampa; materiales estándar para el instrumento proporcionados por el fabricante
Solución de acetato de magnesioMillipore Sigma63052-100MLÚselo para hacer tampón HR
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluido con el kit de fragmentos Klenow
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDisolver en H2O y pasar a través de un filtro de 0,22 mmm
Cloruro de potasioMillipore SigmaP3911Úselo para hacer PBS y tampón HR
Fosfato de potasio monobásicoMillipore SigmaP0662Uso para hacer PBS
em>S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 se purificó internamente como se describió anteriormente (ver refs. 33, 34). Alternativamente, Nap1 se puede comprar comercialmente (por ejemplo, Active Motif).
Acetato de sodioMillipore Sigma241245Disolver en H2O a 3 M
Cloruro de sodioMillipore SigmaS9888Úselo para hacer PBS y tampón de imagen
Fosfato de sodio dibásicoMillipore SigmaS9763Úselo para hacer
partículas recubiertas de biotina PBS SPHERO (3.0-3.4 y micro; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c EspectrofotómetroFisher ScientificND2000NanoDrop Tris
BaseFisher ScientificBP152-500Disolver en H2O y ajustar al pH apropiado; úselo para hacer tampón de imagen y acetato de tris
refrigerante, puro <

Referencias

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