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Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

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DOI:

10.3791/66580

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24 de mayo de 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Resumen

La respuesta inmunitaria adaptativa depende de la capacidad de una célula T para migrar a través de la sangre, la linfa y los tejidos en respuesta a patógenos y cuerpos extraños. La migración de células T es un proceso complejo que requiere la coordinación de muchas entradas de señales del medio ambiente y de las células inmunitarias locales, incluidas las quimiocinas, los receptores de quimiocinas y las moléculas de adhesión. Además, la motilidad de las células T está influenciada por las señales ambientales dinámicas circundantes, que pueden alterar el estado de activación, el paisaje transcripcional, la expresión de la molécula de adhesión y más. In vivo, la complejidad de estos factores aparentemente entrelazados hace que sea difícil distinguir las señales individuales que contribuyen a la migración de las células T. Este protocolo proporciona una serie de métodos, desde el aislamiento de células T hasta el análisis asistido por computadora, para evaluar la migración de células T en tiempo real en condiciones ambientales altamente específicas. Estas condiciones pueden ayudar a dilucidar los mecanismos que regulan la migración, mejorando nuestra comprensión de la cinética de las células T y proporcionando una fuerte evidencia mecanicista que es difícil de lograr a través de experimentos con animales. Una comprensión más profunda de las interacciones moleculares que afectan la migración celular es importante para desarrollar terapias mejoradas.

Introducción

Las células T son los principales efectores de la respuesta inmunitaria adaptativa específica de antígeno. A nivel poblacional, las células T son heterogéneas, compuestas por subconjuntos celulares con distintas funciones especializadas. Es importante destacar que los linfocitos T CD8+ son los principales efectores citolíticos del sistema inmunitario, que eliminan directamentelas células infectadas o disfuncionales.

Las células T CD8+ maduras residen en el tejido y circulan a través de la sangre y los vasos linfáticos en busca de antígenos. Durante la infección, las células T se presentan con antígenos en la sangre o el tejido y drenan rápidamente al bazo o al ganglio linfático de drenaje más cercano para comenzar una respuesta inmunitaria productiva. En cualquier caso, las células T se activan, experimentan una expansión clonal y abandonan el sistema linfático para ingresar a la sangre, si aún no están allí. Durante este proceso, la señalización intracelular confiere la regulación a la baja de los receptores linfáticos y la regulación al alza de numerosos receptores de integrinas y quimiocinas esenciales para la migración específica del tejido2. En última instancia, la migración dirigida de las células T a los sitios de infección está impulsada por señales ambientales convergentes que incluyen la señalización de integrinas y quimiocinas.

Las quimiocinas se pueden clasificar en dos clases principales: (1) señales homeostáticas, que son esenciales para la diferenciación, la supervivencia y la función basal, y (2) señales inflamatorias, como CXCL9, CXCL10 y CCL3, que son necesarias para la quimiotaxis. Generalmente, las quimiocinas crean un gradiente de señal que impulsa la migración direccional, conocida como quimiotaxis, además de activar la expresión de integrinas1. La quimiotaxis está finamente regulada y es altamente sensible, con células T capaces de responder a pequeños cambios en el gradiente que pueden llevarlas hacia una dirección o ubicación específica.

Además de estos factores relacionados con las células T, la migración también se ve afectada por la composición y la densidad de la matriz extracelular (MEC). La MEC está formada por una densa red de proteínas, entre las que se incluyen el colágeno y los proteoglicanos, que proporcionan el andamiaje para los receptores de integrinas adhesivas en las células T. Las integrinas son una familia diversa de proteínas transmembrana, cada una con dominios de unión altamente especializados y efectos de señalización posteriores. La expresión dinámica de los receptores de integrinas en la superficie de una célula T permite una rápida adaptación a sus entornos cambiantes3. Es importante destacar que las integrinas conectan la MEC y las redes de actina del citoesqueleto intracelular que trabajan juntas para generar la fuerza propulsora necesaria para el movimiento de las células T.

En resumen, los patrones de migración varían en función del fenotipo de las células inmunitarias o de las señales ambientales. Estos complejos procesos biológicos están estrechamente regulados por la expresión de citocinas, quimiocinas e integrinas en la superficie de la célula T, las células circundantes y el tejido local infectado. In vivo, estos mecanismos migratorios pueden ser complejos y pueden ser el resultado de varias señales aditivas4. Debido a esta complejidad, puede ser imposible establecer una relación causal entre variables aparentemente entrelazadas. Para superar esto, existen varios enfoques in vitro para estudiar aspectos específicos de la migración de células T, como la respuesta a señales específicas de quimiocinas y la interacción entre las integrinas de células T y las proteínas de unión a la MEC. Este protocolo aborda métodos para aislar y activar células T CD8+ murinas, con ensayos de migración in vitro en espacio bidimensional y herramientas de análisis computacional para analizar la migración de células T especificadas. Estos métodos son ventajosos para el usuario porque no requieren materiales o dispositivos sofisticados, como ocurre con algunos otros ensayos de migración celular descritos en la literatura. Los datos de migración celular generados con estos métodos pueden proporcionar evidencia de respuestas inmunitarias de una manera simplista que permite una investigación más profunda e informada in vivo.

Protocolo

Los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones de este estudio se mantuvieron en el espacio libre de patógenos de las instalaciones de animales de la Universidad de Rochester. Para el presente estudio se utilizaron ratones macho/hembra C57BL/6, de 6 a 12 semanas de edad (15-30 g). El aislamiento del tejido del ratón se puede realizar en una mesa de trabajo con guantes para cubrir las manos y una mascarilla para cubrir la nariz y la boca, o dentro de un gabinete de bioseguridad. Todos los cultivos celulares y la preparación de placas deben realizarse en una cabina de bioseguridad. Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Purificación y activación de células T CD8+

  1. Preparación de materiales
    1. Para la selección negativa de linfocitos T CD8+ : Prepare un medio de selección negativo a partir del sobrenadante de los anticuerpos GK1.5 y M5/114 de las líneas celulares de hibridoma GK1.5 y M5/114, que producen anti-CD4 y anti-MHCII, respectivamente. Mezclar el sobrenadante en una proporción de 1:1, filtrarlo y almacenarlo a 4 °C para su uso futuro (>0,5 μg de cada anticuerpo/millón de células totales). Alternativamente, están disponibles kits comerciales de aislamiento de células T CD8+ .
    2. Para la activación de las células T: Añadir 500 μL de anticuerpos CD3 (10 μg/mL) y CD28 (16 μg/mL) en 1x DPBS (sin calcio ni magnesio) a una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos (TC) y almacenar durante la noche a 4 °C para asegurar la unión de la placa.
      NOTA: Los anticuerpos y las proteínas recubren las placas/placas de cultivo no tratadas con TC mejor que las normales tratadas con TC, por lo que las placas de cultivo no tratadas con TC se utilizan para la generación de células T.
  2. Prepare una placa de cultivo de 10 cm (o equivalente) colocando un colador de células de 70 μm en la placa y dispense 2 mL de medio R9 en el filtro (medio R9: RPMI 1640x suplementado con 10% de FBS, 1% antibiótico-antimicótico, 20 mM de tampón HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales MEM, 50 μM de β-mercaptoetanol).
  3. Obtener un ratón con antecedentes genéticos, sexo, edad y peso apropiados según lo determinado por el diseño experimental.
  4. Aplicar la eutanasia al ratón con CO2 seguido de luxación cervical, o estrategias de eutanasia apropiadas según lo definido por los protocolos locales de cuidado y uso de animales y aprobado por la institución.
  5. Coloque al ratón en una postura supina, estire las cuatro extremidades perpendiculares al cuerpo y sujete las almohadillas de los pies a un tablero de disección con alfileres T de disección de ratón o equivalentes. Realice una incisión central superficial a través de la capa cutánea en la parte inferior ventral del abdomen con tijeras de disección quirúrgica de ratón y corte directamente hasta la barbilla (~ 8 cm). Separe la piel del revestimiento peritoneal para exponer los ganglios linfáticos. Estire la piel perpendicularmente lejos del tronco y sujétela5.
    1. Extirpe suavemente los ganglios linfáticos cervicales, axiales, braquiales e inguinales bilateralmente con pinzas romas (o el tipo preferido de un kit de disección quirúrgica estándar para ratones). Transfiera al filtro de células preparado en el paso 1.2.
    2. Abra el peritoneo y extraiga el bazo. Transfiera al filtro de células preparado en el paso 1.2.
    3. Deseche el cadáver del ratón en el receptáculo de riesgo biológico adecuado.
  6. Prepare una suspensión unicelular de los tejidos linfoides secundarios mediante disrupción mecánica sobre el filtro celular de 70 μm con 2 mL de medio R9 del paso 1.2 girando la herramienta de disrupción tisular media vuelta en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj repetidamente.
    NOTA: El extremo del émbolo de una jeringa Luer-Lock, ya sea de 3 ml o de 10 ml, funciona bien para triturar y homogeneizar el tejido. Se pueden utilizar materiales alternativos a discreción del usuario.
  7. Lave las células, el extremo de la jeringa, el colador y la placa de cultivo con 7 ml de medio, asegurándose de que el colador permanezca en posición vertical para evitar la transferencia de trozos más grandes de tejido o agregados celulares que puedan estar presentes en la suspensión unicelular.
  8. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
  9. Granular las células a 270 x g a temperatura ambiente (20 °C) durante 5 min y decantar el sobrenadante.
  10. Añadir 500 μL de tampón lisante durante 1 min para eliminar los glóbulos rojos. Diluir con 9,5 mL de medio R9 y centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Decantar el sobrenadante.
  11. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL del medio de selección negativo previamente preparado que contiene anti-MHCII y anti-CD4 (paso 1.1.1). Mecer a temperatura ambiente (20 °C) durante 30 min.
  12. Granular las células a 270 x g durante 5 min y decantar el sobrenadante. Lavar 3 veces con 10 mL de R9 medio.
  13. Simultáneamente, en un tubo cónico de 15 mL, lavar 200 μL de perlas de IgG anti-ratas de oveja en 7 mL de medio. Coloque el tubo en un imán, retire el medio y repita el paso de lavado dos veces. Vuelva a suspender las perlas en 7 mL de medio R9.
  14. Granule las células a 270 x g (20 °C) durante 5 min, decante el sobrenadante y luego vuelva a suspender el pellet en 7 ml de suspensión de perlas del paso 1.13. Mecer a temperatura ambiente (20 °C) durante 45 min.
  15. Enriquezca las células T CD8+ mediante el agotamiento magnético de las perlas. Coloque el tubo cónico directamente sobre el imán sin tapa durante 3 minutos para eliminar las células unidas a anticuerpos/perlas. Las células CD8+ deben ser retenidas. Con el tubo aún en el imán, recoja la suspensión celular con una pipeta serológica o equivalente y transfiérala a un nuevo tubo de 15 ml. Centrifugar a 270 x g (20 °C) durante 5 min y lavar 3 veces a temperatura media.
  16. Lave la placa de activación prerrevestida (paso 1.1.2) con 1x DPBS dos veces sin pipetear directamente en la superficie inferior de la placa.
  17. Opcional: Realice una separación de linfocitos vivos y muertos para eliminar las células muertas.
    1. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Agregue suavemente 2 mL de medio de separación de linfocitos al fondo de la suspensión celular. Centrífuga a 900 x g durante 10 min (a temperatura ambiente) a baja aceleración y desaceleración.
      NOTA: Las células vivas se separarán en la interfaz del medio y el medio de separación (capa blanca media). Las células muertas se desprenderán en el fondo del tubo y se pueden desechar al final.
    2. Transfiera la capa intermedia que contiene linfocitos vivos a un nuevo tubo y centrifugue a 270 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante.
  18. Resuspender el pellet en 12 mL de medio con 10 U/mL de IL-2 recombinante de ratón. Coloque 1 mL por pocillo en una placa de 24 pocillos no tratada con TC y transfiérala a 37 °C durante la noche.

2. Levantar las células T CD8+ activadas

  1. Visualice las células utilizando un microscopio óptico de sobremesa estándar, utilizando el objetivo 4x o 10x.
    NOTA: Las células T activadas aparecerán más grandes y redondas o alargadas en comparación con las células T inactivadas y deben tener grupos densos de células en todo el pocillo.
  2. Para levantar las células activadas, rompa las células con una pipeta de 1 mL, asegurándose de mezclar bien en los bordes de la placa. Transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
    NOTA: Las células activadas son más pegajosas y requieren un pipeteo más vigoroso.
  3. Lave los pocillos con 1 mL de medio R9 para eliminar las células restantes. Repita una vez más si es necesario. Centrifugar las celdas a 270 x g (20 °C) durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  4. Realice una separación de linfocitos vivos/muertos para eliminar las células muertas como en los pasos 1.17-1.18.
  5. Mantenga las células T mediante la eliminación de células vivas/muertas cada 3-4 días en medio R9 con IL-2 en una placa de 6 pocillos no TC.
    NOTA: Las células T proliferan mejor en pocillos de pequeña dimensión durante la activación temprana, posiblemente debido a los contactos entre células T o a factores solubles derivados de células T que ayudan a su activación. La rápida proliferación de células T hace que el medio de cultivo amarillee dentro de las 24-48 horas posteriores al cultivo. En este punto, levante las células y transfiéralas a un pocillo más grande (placa de 6 pocillos sin recubrimiento, no TC) con suficiente medio de cultivo fresco para alimentar las células (generalmente 5 mL por pocillo). Reemplace el medio agotado por fresco siempre que lo indique el cambio de color del medio amarillo, o cada 3-4 días.

3. Preparación del plato de vidrio

  1. Prepare las cámaras o placas de migración de células de vidrio mediante un recubrimiento con 300 μL/cm2 de proteína A (0,1 mg/ml) durante la noche a 4 °C, lave dos veces con 1x DPBS dispensando en el plato y decantando antes de pasar al siguiente paso.
  2. Cubra la cámara o placa de migración con 300 μL/cm2 de quimera recombinante de ratón ICAM-1 o VCAM-1 Fc (0,1-2,75 mg/mL) junto con una quimiocina recombinante de ratón (0,1-10 μg/mL) durante 2-3 h a temperatura ambiente. Otros ligandos de integrina, como la fibronectina, el colágeno IV de ratón y la E-cadherina de ratón, se recubren directamente la cámara a 2,5-10 μg/ml durante la noche a 4 °C.
    1. Lave las cámaras dos veces con 1x DPBS dispensando en el plato y decantando inmediatamente después antes de agregar las celdas.
      NOTA: Las células T pueden migrar de manera diferente en diferentes concentraciones de ligandos de integrinas y quimiocinas dependiendo del estado de activación, diferenciación, sensibilización y cebado. Se sugiere encarecidamente analizar la migración celular en múltiples concentraciones diferentes.
  3. Coloque las células adherentes en placas recubiertas de vidrio 24 horas antes del inicio de la obtención de imágenes si se cultivan células T con otras células, como las células cancerosas, para medir la destrucción de células T de las células cancerosas en tiempo real.

4. Preparación de las células

  1. Opcional: Teñir los linfocitos T y los linfocitos adherentes con el colorante rastreador celular de elección a 1 μg/mL por 1 x 107 celdas en 1x DPBS durante 15 min a 37 °C, o según el protocolo del fabricante.
  2. Cuente las células con un hemocitómetro o equivalente.
  3. Placa 1 x 105 linfocitos T CD8+ (o la cantidad deseada) en el medio L-15 de Leibovitz suplementado con 1-5 g/L de glucosa en una cámara a 37 °C.
    NOTA: El medio L-15 está formulado para su uso sin un sistema de bicarbonato de sodio CO2. Se tampona utilizando aminoácidos básicos libres, tampones de fosfato y galactosa para mantener los niveles de pH.
  4. Opcional: Realice el bloqueo de integrinas.
    1. Preincubar linfocitos T con un anticuerpo bloqueante contra una integrina (1-10 μg/mL, anti-ratón CD11a (M17/4), anti-ratón CD18 (M18/2), anti-ratón VLA-4 (9C10) durante 10 minutos y permitir que se arrastre en presencia del mismo anticuerpo.

5. Microscopía de lapso de tiempo

  1. Realizar microscopía de video.
  2. En el caso de los linfocitos T, adquiera imágenes de campo claro y fluorescentes cada 10-60 s durante 10-60 minutos, o los ajustes de adquisición deseados.
    NOTA: La migración de linfocitos T es sensible a la temperatura, y la temperatura óptima para la migración de linfocitos T de ratón es de 37 °C. El sistema de control de temperatura que utiliza este protocolo consiste en una cubierta de microscopio cerrada y aislada con un sistema de calefacción adjunto. La cámara de imagen se encuentra en la plataforma de imagen. El perímetro de esta cámara tiene un pozo lleno de agua destilada que permite un calor y una humedad constantes durante la toma de imágenes. El micropocillo se coloca en el centro de la cámara de imágenes.

6. Análisis asistido por software de la migración de células T

  1. Utilice el software Volocity para evaluar la migración de células T.
    1. Abre Volocity y crea una nueva secuencia de imágenes.
    2. Seleccione y mueva todas las películas de microscopía de video de lapso de tiempo al área azul en Volocity.
    3. Ajuste el brillo y el contraste con la herramienta de mejora de contraste a la configuración deseada por el investigador.
    4. Compruebe el tamaño de las imágenes: 0,325 μm para 20x, 0,65 μm para 10x.
    5. Secuencia: establecer puntos de tiempo (por ejemplo: 81 imágenes si se toma una imagen cada 15 s durante 20 minutos, 4 por minuto).
    6. Desmarque todos los puntos de tiempo en la pestaña de medición.
    7. Encuentre objetos usando la intensidad: deslice la barra para que quede justo a la derecha del pico.
    8. Excluir objetos por tamaño: todas las celdas que tengan menos de 10 μm de diámetro y más de 100 μm para excluir restos celulares o partículas no celulares. Excluir los linfocitos T que están migrando durante menos del 20% del tiempo de registro (que puede variar dependiendo de la definición de cada investigador).
    9. Ignorar objetos estáticos (casilla de verificación).
    10. Unir automáticamente tramos rotos (casilla de verificación).
    11. Establezca la ruta más corta en no más de 20 μm.
    12. La pista de la migración de una célula es la línea que conecta la ubicación de la misma célula a lo largo del tiempo. Asegúrese de que el algoritmo de seguimiento realiza un seguimiento mediante la detección de dónde se detectan los objetos individuales mediante la segmentación en cada fotograma, y que los objetos coinciden entre fotogramas.
    13. Guarde un nuevo protocolo eligiendo Mediciones > Guardar protocolo > Nombre Nuevo protocolo.
    14. Haga clic en medir todos los puntos de tiempo en la pestaña de medición.
    15. Ordene las pistas por intervalo de tiempo, de mayor a menor.
    16. Registre los números de identificación de pista para todas las celdas con buenas pistas según lo definido por el investigador. Después del seguimiento automático de células, es necesaria una evaluación manual de cada pista de célula para excluir las pistas identificadas falsamente o rotas. Excluya las celdas con pistas incorrectas.
    17. Exporte el archivo como texto separado por comas y transfiera los datos al software de análisis deseado.
      NOTA: Parámetros básicos: Velocidad (μm/min), desplazamiento (movimiento neto, μm), longitud de la pista (longitud total del trayecto, μm) e índice de meandros (MI; desplazamiento neto/longitud de la pista. MI = 1 indica una pista lineal completamente recta).
  2. Realice el seguimiento manual con la imagen J.
    1. Abra los complementos y seleccione seguimiento y seguimiento manual. Establezca los parámetros: intervalos de tiempo, calibración x/y (tamaño de píxel) y calibración z (en modo de seguimiento manual). Inicie el seguimiento de celdas individuales haciendo clic en agregar pista, seleccionando una celda en el primer punto de tiempo y continuando a través de todos los puntos de tiempo. A continuación, haga clic en Finalizar pista. Repítelo para todas las celdas de interés.
      NOTA: Trackmate, otra herramienta para el seguimiento de celulares, es un software de seguimiento automático disponible a través del complemento ImageJ.

Resultados

La confirmación de la activación de los linfocitos T se puede lograr mediante citometría de flujo, buscando un aumento de la expresión de CD69 y CD44, que son marcadores canónicos de activación en los linfocitos T murinos6. Además, la pureza de la población de células T se puede determinar mediante citometría de flujo para células T CD3+ CD8+ . Este método produce una población de linfocitos T CD8+ del >90 %.

La migración de células T se puede evaluar con programas de seguimiento celular asistidos por software que son reproducibles y ajustables para adaptarse a las necesidades del investigador. Algunos parámetros básicos utilizados para determinar los efectos experimentales incluyen la velocidad celular (longitud de la migración por un tiempo determinado para determinar qué tan rápido se mueve una célula), el desplazamiento (distancia de migración, una línea recta desde el punto de inicio hasta el punto final, para determinar qué tan lejos migra una célula), la longitud de la pista (la distancia de migración, la longitud total de la ruta de migración, para determinar qué tan lejos migra una célula), y el índice de meandros (el IM está entre 0 y 1 para determinar la rectitud de la migración, 1 = recto). Estos parámetros se emplean para evaluar las diferencias migratorias en las células T CD8+ naïve y activadas que se arrastran a lo largo del vidrio recubierto con ICAM-1 con CXCL12 (Figura 1). Se observó un aumento de la velocidad media, el desplazamiento y el índice de meandros en los linfocitos T CD8+ activados en comparación con los naïve, lo que indica que los linfocitos T activados tienen una mayor capacidad de migración. Del mismo modo, con estos métodos se puede dilucidar el impacto de diferentes quimiocinas en los patrones de migración celular. Por ejemplo, las células T CD8+ activadas exhiben una mayor migración en presencia de CXCL12, pero no de CCL2 o CCL22, y la migración aumenta de manera dependiente de la dosis a una concentración saturante (Figura 2). Además, el seguimiento celular asistido por software permite la caracterización de la migración celular individual, lo que permite comprender los efectos de los ligandos individuales en el comportamiento de las células T. En la Figura 3 se pueden ver rastros representativos de las células.

Tomados en conjunto, estos datos respaldan la eficacia de los métodos actuales al confirmar que podemos (1) rastrear la migración celular sobre una base de células individuales, y (2) distinguir las diferencias en la migración de las células T CD8+ en función del estado de activación y en presencia de diferentes quimiocinas y moléculas de adhesión. Este ensayo es un paso crítico en la disección de mecanismos de señalización complejos e informar experimentos in vivo enfocados que pueden abordar aún más las contribuciones biológicas de señales específicas de una manera específica para el tipo de célula.

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Figura 1: Ensayos in vitro para la migración de linfocitos T CD8+ vírgenes y activados. Se permitió que las células T CD8+ de ratón naïve o activadas por CD3/ CD28 migraran en ICAM-1 más CXCL12 durante 10 min. La velocidad, el desplazamiento y el índice de meandros de la migración celular se analizaron mediante microscopía de lapso de tiempo y Volocity. Cada grupo tiene 36 células T individuales (media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ensayos in vitro para la migración dependiente de quimiocinas de células T CD8+ activadas. Se permitió que las células T CD8+ de ratón activadas por CD3/CD28 migraran en ICAM-1 más una quimiocina indicada. Las proporciones del número de células que se arrastran más de 50 μm durante 20 min (porcentaje del total) se determinaron en un campo de visión. Un solo ensayo analizó >10 células (n = 3 ensayos por grupo media ± SEM). Prueba t no apareada, *p< 0,05 en comparación con el control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Huellas migratorias de linfocitos T CD8+ activados en ICAM-1 más CXCL12 durante 20 min. Cada línea de color indica la trayectoria migratoria de cada célula T en una dirección desde el punto de la célula hasta el opuesto. En este ensayo en particular, 24 de las 38 células migraron en una longitud significativa (al menos la distancia de su ancho de celda según nuestra definición). Las células T migraron en diferentes longitudes de distancia, lo que indica que cada célula estaba en un estado diferente de activación o cebado. Todas las células migratorias se movían en diferentes direcciones bajo la condición de que la superficie estuviera cubierta uniformemente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Comprender el impacto biológico de las señales convergentes in vivo es un desafío y no es fácil de interpretar. Los protocolos presentados en este documento proporcionan un método razonable para comprender la migración de células T en condiciones altamente definidas y biológicamente relevantes. Estas condiciones se pueden especificar según la discreción del investigador, y los protocolos se pueden modificar para adaptarse a las necesidades de varias poblaciones de células T, el estado de activación y el fenotipo de la célula. Además, muchos ligandos y receptores pueden ser interrogados a través de estos procedimientos definidos de bloqueo de anticuerpos 7,8 y de vidrio recubierto de ligandos 8,9,10. Esta técnica también ha sido una plataforma crítica para el desarrollo de células inmunitarias modificadas11,12.

Los pasos importantes del protocolo incluyen el aislamiento del tejido linfoide secundario, la activación de las células T, el recubrimiento de las placas de imagen de vidrio y el análisis de datos. Para el ojo inexperto, los ganglios linfáticos incrustados en el tejido pueden ser difíciles de identificar y extraer. Esto se puede superar con la práctica. Una vez que las células T se han aislado y purificado, la etapa de activación da como resultado células pegajosas que, si no se levantan correctamente, pueden resultar en un bajo rendimiento. Esto se puede evitar con un lavado generoso y cuidadoso de los pozos. Los platos de vidrio deben estar debidamente recubiertos con el ligando de interés y lavados antes de la adición de células. Esto asegurará que haya una capa robusta de proteína disponible para que las células se adhieran, al tiempo que garantiza que el exceso de reactivo no interrumpa la biología. La unión superficial de la proteína A-vidrio y la unión de la proteína Fc-A en el pH fisiológico y la concentración de sal son lo suficientemente fuertes como para resistir el lavado al verter y decantar suavemente el tampón. Las proteínas residuales, si las hay, en el medio no causan ninguna toxicidad, aunque podrían perturbar la interacción celular con los ligandos unidos si los no unidos están en altas concentraciones. Descartamos esta posibilidad enjuagando el vidrio recubierto un par de veces. Por último, existen muchos programas informáticos comerciales y no comerciales fáciles de usar que permiten a los investigadores detectar incluso diferencias sutiles en los comportamientos y morfologías celulares. No se puede exagerar la importancia de asegurar los resultados analizados manualmente para excluir los errores que podría cometer el software.

Los métodos para la purificación y activación de células T pueden modificarse para adaptarse a las necesidades del investigador para obtener el estado celular y el fenotipo adecuados para recapitular las observaciones in vivo. Se pueden utilizar varios tipos y estados celulares para abordar diferentes mecanismos de infección y respuesta inmune 7,8,9,10,11,13, incluido el abordaje del comportamiento de las células T ingenuas y de memoria y varios aspectos de la respuesta de memoria, como el cebado y el reclutamiento, en condiciones específicas de tejido14. Este método se puede utilizar para el cocultivo con diferentes tipos de células para comprender mejor las interacciones celulares, incluidos los tiempos y la duración del contacto entre células 7,9, la presentación de antígenos 9,13 y la destrucción de células diana6. Se pueden utilizar indicadores y etiquetas adicionales para evaluar las estructuras subcelulares7, gránulos15, apoptosis6 y más.

El protocolo es una excelente herramienta para guiar experimentos in vivo adicionales basados en observaciones en condiciones simplificadas y altamente definidas. Si bien la evaluación in vitro de la motilidad celular puede ser altamente reductora, es un paso importante para descomponer las actividades biológicas complejas. Con los resultados de estos experimentos, los investigadores pueden abordar el trabajo in vivo de una manera más fisiológicamente relevante y específica.

La simplicidad de este método también representa su mayor limitación; Aunque representativos de las actividades in vivo, todos los resultados pueden confirmarse aún más utilizando la microscopía multifotónica intravital, por ejemplo. El método descrito en este documento es uno de los más simples que está completamente disponible para los laboratorios de investigación con un microscopio de campo claro y/o un microscopio de epifluorescencia con una cámara digital integrada en el sistema de microscopio o colocada por separado en el objetivo del endoscopio. Por otro lado, hay más opciones para el análisis avanzado de la migración de células inmunitarias in vitro. En primer lugar, las células inmunitarias a menudo son impulsadas por gradientes de quimiocinas en el sistema biológico. El análisis del comportamiento de las células inmunitarias bajo gradientes de quimiocinas se puede lograr de varias maneras. Un método simple es usar un portaobjetos especialmente diseñado (ver Tabla de Materiales). Este sistema de pozos canalizados, cuando su parte inferior está recubierta con ligandos de integrinas, permite el análisis de la migración de células inmunitarias bajo un gradiente de quimiocinas estático. Otros ensayos sencillos para la quimiotaxis de células inmunitarias incluyen la microscopía de lapso de tiempo de la migración celular a una punta de micropipeta que libera quimiocinas16, bajo el ensayo de agarosa17 y la cámara de Zigmond18. Para ensayos de migración más sofisticados bajo gradientes de quimiocinas controlados, se requieren portaobjetos personalizados con generadores de gradientes microfluídicos19,20. En segundo lugar, las células inmunitarias pueden migrar en condiciones físicas únicas utilizando diferentes mecanismos, a veces sin utilizar la adhesión dependiente de integrinas a los ligandos. El ensayo de migración in vitro en una dimensión se puede realizar con o sin recubrimiento de ligando de integrina y reproduce la motilidad de las células inmunitarias en los vasos capilares21,22. Otra opción es el ensayo de migración celular en el espacio tridimensional23,24 para investigar los mecanismos subyacentes a la migración intersticial de las células25,26. En general, hemos esbozado métodos simples, reproducibles y confiables para estudiar los eventos dinámicos de migración celular.

Divulgaciones

Los autores declaran que toda la investigación y la preparación del manuscrito se llevaron a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del Kim Lab que han contribuido al desarrollo de estos protocolos a lo largo del tiempo. Los datos representativos fueron posibles gracias a P01 AI102851/AI/NIAID, NIH HHS/Estados Unidos y P01 HL018208/HL/NHLBI, NIH HHS/Estados Unidos. Esta publicación fue posible en parte gracias a la subvención número T32 GM135134 del Premio Institucional Ruth L. Kirschstein del Servicio Nacional de Investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plato de 10 cmCorning353003o equivalente
Tubo cónico de 15mL ThermoFisher339650o equivalente
1x DPBSGibco14190144sin calcio y sin magnesio
Placa de 6 pocillos no tratada con TCCorning3736o equivalente
70 µ Filtro de célulasFisherScientific352350o equivalente
Tampón de lisado ACKThermoFisherA1049201 o equivalente
Centrífuga Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R con rotor TX400 3655 y cucharónequivalente
Beta mercaptoetanolSigmaM3148o equivalente
CellTrace VioletThermoFisherC34571O equivalente
CentrífugaThermoScientificSorvall ST 16Ro equivalente
Colágeno (IV)Corning354233 o
equivalente Placa de cultivo DeltaT de .17 mm de espesor vidrio transparenteBioptechs04200417C
Dynabeads Ovejas anti-Rata IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 ImánThermoFisher Scientific12301Do equivalente
Kit de aislamiento de células T Easy sepStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLo equivalente
FibronectinaSigmaAldrich10838039001o equivalente
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Cubos de filtroNikon u Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080o cámara
CCD HQo equivalenteImageJ
http://imagej.nih.gov/ij/henlace web
ImageJ complementoen http://imagej.net/TrackMateenlace web
Seguimiento manual de ImageJ enchufe https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlenlace web
L-15VariosVer MaterialesMedio Receta: Leibovitz' s Medio L-15 sin rojo fenol (Gibco) suplementado con 1-5 g/L
de glucosa Medio L-15 de Liebovitz, sin rojo fenol21083027
Luer LokFisher Scientific14-955-459o equivalente
Medio de separación de linfocitosCorning25-072-CIo equivalente
M5/114ATCCTIB-120
MEM Aminoácidos no esencialesThermoFisher11140050o equivalente
Sistema de calentamiento de microscopioOkolabokolab.comDiseños personalizados disponibles
Diapositiva Millicell EZMilliporeC86024
Mojosort ratón CD8+ Naï kit de aislamiento de células TBiolegend480043
Mouse E-cadherinR& Sistemas D8875-EC-050o equivalente
Kit de disección quirúrgica de ratónFisher Scientific13-820-096o elementos
NISNikonSoftware
no TC 24wpCorning353047o equivalente
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher15140122o equivalente
Proteína AThermoFisher Scientifico equivalente
R9Varios VerMaterialesMedio Receta: RPMI 1640x suplementado con 10 % FBS, 1 % antibiótico-antimicótico (Gibco), 20 mM de tampón HEPES (Gibco), 1 % de MEM Aminoácidos no esenciales (Gibco), 50 μ M β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)
Ratón recombinante ICAM-1 Fc quimeraR& Sistemas D796-IC-050o equivalente
Ratón recombinante IL2Biolegend575410o equivalente
RPMI 1640xThermoFisher11875093o pines T equivalentes
Fisher ScientificS99385o equivalente
Microscopio TE2000-UNikono equivalente
Varios quimiocinas recombinantes de ratónR& Sistemas Do equivalentes
VCAM-1 Fc quimeraR& D systems643-VM-050o equivalente
VolocityPerkinElmerSoftware
o mouse equivalente CoolSNAP de seguimiento automático Jeringa desechable ThermoFisher equivalentes

Referencias

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