Purificación y Caracterización de Vesículas Extracelulares a partir de Células Madre Mesenquimales Derivadas del Adiposo Humano

Resumen

Este protocolo describe todos los procedimientos, desde el cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) y la recolección de sobrenadante hasta la extracción de vesículas extracelulares (EV) mediante ultracentrifugación.

Resumen

Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) pueden promover la regeneración y reconstrucción de diversos tejidos y órganos. Investigaciones recientes sugieren que su función regenerativa puede atribuirse al contacto célula-célula y a los efectos paracrinos de las células. El efecto paracrino es una forma importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, en las que las vesículas extracelulares (VE) desempeñan un papel funcional como portadoras. Existe un potencial significativo para los ADSC EV en medicina regenerativa. Múltiples estudios han informado sobre la efectividad de estos métodos. Actualmente se describen varios métodos para extraer y aislar EV basados en principios como la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. La ultracentrifugación se considera el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos. Sin embargo, todavía no existe un protocolo meticuloso para resaltar las precauciones durante la ultracentrifugación. Este estudio presenta la metodología y los pasos cruciales involucrados en el cultivo de ADSC, la recolección de sobrenadante y la ultracentrifugación de EV. Sin embargo, a pesar de que la ultracentrifugación es rentable y no requiere tratamiento adicional, todavía existen algunos inconvenientes inevitables, como una baja tasa de recuperación y la agregación de EV.

Introducción

La mayoría de las ADSC se derivan del tejido adiposo y se ha demostrado que promueven la regeneración y reconstrucción de varios tejidos y órganos, incluidos el miocardio, el hueso y^{la piel.} Investigaciones recientes sugieren que la función regenerativa de las ADSC puede deberse al contacto intercelular y a los efectos paracrinos de las células². El efecto paracrino es un medio importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, y esta función se logra a través de vesículas extracelulares (EV).

Los VE son estructuras de membrana de doble capa producidas por células, con un diámetro que oscila entre 40 nm y 160 nm (con un promedio de aproximadamente 100 nm). Afectan a diferentes funciones celulares, como la producción de citoquinas, la proliferación celular, la apoptosis y el metabolismo ^3,4. Se han realizado numerosos estudios sobre las funciones de los ADSC EV, incluyendo la promoción de la regeneración ósea, la regeneración del tejido de la mucosa oral, la supervivencia del tejido adiposo después del trasplante de tejido y la reparación de heridas cutáneas 5,6,7,8. El enorme potencial de los ADSC EV en la medicina regenerativa es evidente. Existen varios métodos para extraer y separar los VE del sobrenadante, como las técnicas basadas en la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. El método de ultracentrifugación es ampliamente considerado el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos⁹. El principio fundamental de la ultracentrifugación para la separación de EV se basa en el hecho de que las partículas de la muestra tienen diferentes coeficientes de sedimentación, lo que da lugar a su sedimentación y agregación en distintas capas de separación. Sin embargo, aún no se ha establecido un protocolo detallado que enfatice las precauciones durante la ultracentrifugación.

Por lo tanto, este estudio describe objetivamente la cultura ADSC, la recolección de sobrenadantes y los procedimientos de ultracentrifugación de EV y los puntos clave con un flujo lógico de información y un lenguaje claro y formal. Esto proporciona una referencia valiosa para futuros experimentos.

Protocolo

La descripción general de los pasos del protocolo se muestra en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los medios

1. Prepare un medio de cultivo para ADSC sin exosomas utilizando 450 mL de medio de cultivo basal, 50 mL de suero fetal bovino sin exosomas y 5 mL de antibióticos triples.

2. Resucitación y cultivo de ADSC

NOTA: Resucitar los ADSC.

1. Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
2. Precalentar previamente el medio en un baño de agua a 37 °C.
3. Extraer 2 tubos de ADSC congelados (P3) de nitrógeno líquido y agitarlos en un baño de agua a 37 °C a temperatura constante hasta que se descongelen por completo.
   NOTA: La abertura del tubo del congelador no debe estar en contacto con el agua para evitar la contaminación.
4. Desinfecte el tubo de criopreservación con alcohol al 75% y luego muévalo a la mesa ultra limpia. Aspire la suspensión celular con una pipeta y colóquela en un tubo centrífugo de 15 mL.
5. Coloque el tubo de centrífuga en una máquina centrífuga de baja velocidad y centrifuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
6. Prepare cuatro platos de cultivo de 10 cm y ponga 9 mL de medio en cada plato. Marque el nombre, el tipo de célula, la generación y la fecha de experimentación, y luego precaliéntelas en una incubadora de celdas termostáticas a 37 °C.
7. Desinfecte el tubo de centrífuga y muévalo a la mesa ultra limpia. Retire el sobrenadante con una pipeta.
8. Añadir 4 mL de medio y agitar suavemente la solución (1 x 10⁵ células/mL) hasta que se disperse uniformemente.
   NOTA: Tenga cuidado de no eliminar el pellet de células al extraer el sobrenadante.
9. Agregue 1 mL de suspensión celular a cada plato. Agita los platos con un método cruzado.
   NOTA: Coloque la placa sobre una superficie nivelada y agítela en un patrón cruzado (moviéndola hacia arriba, hacia abajo, hacia la izquierda y hacia la derecha) durante 5-6 repeticiones. Evite los movimientos circulares, ya que pueden causar acumulación de células en el centro.
10. Observe las células con un aumento de 40x con el microscopio óptico y luego coloque las placas en la incubadora.
    NOTA: El propósito principal de observar las células es determinar si están distribuidas uniformemente, ya que la distribución desigual afectará el crecimiento posterior.
11. Prepare el medio de intercambio para las células.
    1. Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
    2. Precalentar previamente el medio en un baño de agua a 37 °C.
    3. Observe el estado de la célula bajo el microscopio óptico con un aumento de 40x. El nivel de confluencia es de aproximadamente el 50%.
       NOTA: El nivel de confluencia se calcula como la relación entre el área ocupada por las células y el área de la superficie de la placa de Petri después de que las células se adhieren a la pared y se estiran completamente.
    4. Transfiera la placa de cultivo a la mesa ultralimpia (nivel de bioseguridad 2) después de la desinfección y retire el medio.
    5. Enjuague suavemente cada plato de cultivo dos veces con 2 ml de solución de PBS.
    6. Agregue 10 mL de medio a cada plato. Transfiera los platos a la incubadora.

3. Recogida del sobrenadante de los ADSCs y extracción de los EVs

1. Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
2. Observe el estado de la célula bajo un microscopio. El nivel de confluencia es de aproximadamente el 80%.
3. Transfiera el plato a la mesa ultra limpia después de la desinfección. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y colóquelo en un tubo de centrífuga de 50 mL.
   NOTA: Las células se pueden congelar o desechar. Si no se requiere esterilidad, se pueden realizar los siguientes pasos en la mesa de operaciones. En este punto, el experimento se puede pausar y luego reiniciar más tarde. Si el experimento se interrumpe, almacene el sobrenadante en un refrigerador a 4 °C durante no más de una semana. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo, ya que puede afectar a la actividad de los vehículos eléctricos. El enfoque óptimo es extraer los vehículos eléctricos de inmediato.
4. Centrífuga (300 x g, 10 min, a temperatura ambiente) para eliminar las células en suspensión. Recoja el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: No verter. Deje un poco de sobrenadante para evitar que la pellet sea aspirada.
5. Centrifugar para eliminar los restos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) y continuar recogiendo el sobrenadante con una pipeta.
   NOTA: Los puntos clave son los mismos que en el paso 3.4.
6. Filtre el sobrenadante con una membrana de 0,22 mmm para eliminar las partículas grandes y los restos celulares.
   NOTA: Filtre el sobrenadante con 2 mL de PBS estéril para humedecer la membrana del filtro antes de la filtración.
7. Centrífuga en la máquina ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
8. A continuación, centrifugar a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para eliminar el pellet y recoger el sobrenadante.
   NOTA: Los EV obtenidos se purificaron por centrifugación varias veces para aumentar su pureza. Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. Por lo tanto, es crucial operar la pipeta con cuidado y dejar un poco de sobrenadante en el fondo para evitar la acumulación de pellets.
9. Retire el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender el pellet con PBS y centrífuga (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   NOTA: Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. Por lo tanto, al aspirar el sobrenadante con una pipeta, es fundamental eliminar el sobrenadante de manera suave y completa para maximizar la pureza de los EV.
10. Retire el sobrenadante y obtenga el pellet EV. Vuelva a suspenderlo con 1 mL de PBS, transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1 mL y guárdelo en un refrigerador a 4 °C para su posterior detección.
    NOTA: Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. En consecuencia, al aspirar el sobrenadante con una pipeta, es crucial eliminar suave y completamente el sobrenadante para maximizar la pureza de los EV. Si las muestras no son necesarias durante un período prolongado, guárdelas en un refrigerador a -80 °C.

Resultados

En primer lugar, se caracterizaron e identificaron las ADSC, incluyendo su morfología¹⁰ y los anticuerpos de superficie. Con base en la Figura 2A, es evidente que los ADSC están dispuestos en forma de huso y forman un vórtice después de un crecimiento denso. Las células cultivadas se diferenciaron en células adipogénicas, osteogénicas y condrogénicas y se tiñeron con rojo de aceite O, rojo de alizarina y azul alcián¹¹. El experimento de diferenciación inducida y la citometría de flujo validaron que, en efecto, son ADSC con potencial para la diferenciación multidireccional. Sin embargo, el 22% de las células son CD45 positivas en los resultados, lo que no afectará a la conclusión, ya que hay suficientes anticuerpos positivos y negativos que lo respaldan (Figura 2A,B).

A continuación, la identificación de los vehículos eléctricos extraídos es esencial. Incluye principalmente tres aspectos: morfología, tamaño de partícula y proteínas marcadoras. Los resultados del TEM revelan claramente la estructura EV en forma de copa con una membrana bicapa¹² (Figura 3A). La NTA indica que los VE tienen una distribución de tamaño de partícula de alrededor de 50-150 nm, con una concentración de aproximadamente 1,6 x^{10 10} partículas/mL (Figura 3B). El análisis de Western Blot también muestra que las proteínas marcadoras de los EV, incluidas CD9, CD63 y TSG101¹³, se expresan sin problemas (Figura 3C).

Figura 1: Descripción general de los pasos del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Caracterización de ADSC. (A) La morfología de las ADSC es fusiforme. Las ADSC se cultivaron en el medio para la diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica, respectivamente. La diferenciación adipogénica se identificó mediante tinción con Oil Red O. La diferenciación osteogénica y condrogénica se confirmó mediante la tinción con rojo de alizarina y azul alcián, respectivamente. Barra de escala: 100 μm. (B) Análisis de citometría de flujo de ADSC para marcadores de superficie MSC (CD90, CD105, CD29 y CD73) y marcadores específicos de células hematopoyéticas (CD31, CD34, CD45 y HLA-DR). La estrategia de compuertas: rodear primero el grupo en blanco. En base a eso, encierre en un círculo CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 y HLA-DR sucesivamente de acuerdo con los anticuerpos marcados de cada grupo. Esta figura es una adaptación de Han, Y. D. et ^al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización de los VE. (A) Los resultados del TEM revelan claramente la estructura EV en forma de copa de la membrana bicapa. Barra de escala: 200 nm. (B) NTA indica que los EV tienen una distribución de tamaño de partícula de alrededor de 50-150 nm, con una concentración de aproximadamente 1,6 x^{10 10} partículas/mL. (C) Detección de expresiones de TSG101, CD9 y CD63 en exosomas por Western blot. Esta figura es una adaptación de Han, Y. D. et ^al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Durante el proceso experimental formal, varios puntos son cruciales para lograr los mejores resultados experimentales. Basándonos en nuestra experiencia previa, se recomienda optar por los ADSC de paso 3-6, ya que garantizan el mejor estado celular posible. Antes de P3, es posible que los glóbulos rojos, las células endoteliales y otras células diversas no se hubieran excluido. Después de P6, las células pueden envejecer gradualmente, lo que puede afectar el estado de las VE secretadas. En segundo lugar, el sobrenadante debe recogerse cuando el grado de confluencia celular esté entre el 80% y el 90% para asegurar una secreción suficiente del mayor número posible de VE. Para mantener la máxima pureza de los vehículos eléctricos, los investigadores deben tener cuidado durante las tres primeras centrifugaciones y asegurarse de que no queden residuos líquidos para evitar que las impurezas y los gránulos aspiren. Durante las dos últimas centrifugaciones, asegúrese de que el sobrenadante se elimine por completo mientras protege el pellet.

La ultracentrifugación es rentable y no requiere tratamiento adicional. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en estudios de VE y ha demostrado una eficiencia satisfactoria en la obtención de VE, como lo confirman los experimentos de caracterización. No obstante, hay algunos inconvenientes inevitables. En primer lugar, la tasa de recuperación de los vehículos eléctricos es baja. En segundo lugar, los vehículos eléctricos tienden a agregarse a veces. Además, los componentes no celulares pueden aislarse y algunos VE pueden romperse durante el proceso, lo que lleva a la acumulación de desechos 14,15,16. Para abordar estos defectos, la mayoría de las investigaciones se centran en la purificación de los vehículos eléctricos^12,13. Sin embargo, este protocolo cubre todo el proceso, desde el cultivo celular hasta la purificación de exosomas, porque creemos que todo el proceso afecta el estado y la pureza de los EV finales extraídos. Es crucial cumplir con las pautas antes mencionadas durante la operación. Además, la recolección de más sobrenadante y la implementación del cultivo celular 3D pueden ser beneficiosas, ya que numerosos estudios han demostrado que el cultivo 3D es más efectivo para estimular la secreción de EV en comparación con el cultivo 2D^17,18.

Este protocolo describe el proceso de extracción de vehículos eléctricos de los ADSC mediante ultracentrifugación. Proporciona una guía práctica y permite a los experimentadores evitar detalles durante la operación tanto como sea posible. En resumen, el protocolo ayuda a los experimentadores a mejorar la calidad de las muestras y sirve como recordatorio de que no solo debemos centrarnos en los detalles de cada paso, sino también considerar el experimento en su conjunto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de aguja Acrodisc de membrana Supor	Acros Organics	4652	0.22 μ m
Medio basal para cultivo celular	OriCell	BHDM-03011
Suero fetal bovino sin EXO + Suplemento de cultivo (para células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano)	OriCell	HUXMD-05002
Microscopio invertido	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Centrífuga de baja velocidad	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Ultracentrífuga de sobremesa	Beckman Coulter	393315
Solución de penicilina-estreptomicina-gentamicina (100x)	Solarbio	P1410