Este protocolo describe todos los procedimientos, desde el cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) y la recolección de sobrenadante hasta la extracción de vesículas extracelulares (EV) mediante ultracentrifugación.
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Artículo de método
Purificación y Caracterización de Vesículas Extracelulares a partir de Células Madre Mesenquimales Derivadas del Adiposo Humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) pueden promover la regeneración y reconstrucción de diversos tejidos y órganos. Investigaciones recientes sugieren que su función regenerativa puede atribuirse al contacto célula-célula y a los efectos paracrinos de las células. El efecto paracrino es una forma importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, en las que las vesículas extracelulares (VE) desempeñan un papel funcional como portadoras. Existe un potencial significativo para los ADSC EV en medicina regenerativa. Múltiples estudios han informado sobre la efectividad de estos métodos. Actualmente se describen varios métodos para extraer y aislar EV basados en principios como la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. La ultracentrifugación se considera el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos. Sin embargo, todavía no existe un protocolo meticuloso para resaltar las precauciones durante la ultracentrifugación. Este estudio presenta la metodología y los pasos cruciales involucrados en el cultivo de ADSC, la recolección de sobrenadante y la ultracentrifugación de EV. Sin embargo, a pesar de que la ultracentrifugación es rentable y no requiere tratamiento adicional, todavía existen algunos inconvenientes inevitables, como una baja tasa de recuperación y la agregación de EV.
Introducción
La mayoría de las ADSC se derivan del tejido adiposo y se ha demostrado que promueven la regeneración y reconstrucción de varios tejidos y órganos, incluidos el miocardio, el hueso yla piel. Investigaciones recientes sugieren que la función regenerativa de las ADSC puede deberse al contacto intercelular y a los efectos paracrinos de las células2. El efecto paracrino es un medio importante para que las células interactúen y transfieran información a distancias cortas, y esta función se logra a través de vesículas extracelulares (EV).
Los VE son estructuras de membrana de doble capa producidas por células, con un diámetro que oscila entre 40 nm y 160 nm (con un promedio de aproximadamente 100 nm). Afectan a diferentes funciones celulares, como la producción de citoquinas, la proliferación celular, la apoptosis y el metabolismo 3,4. Se han realizado numerosos estudios sobre las funciones de los ADSC EV, incluyendo la promoción de la regeneración ósea, la regeneración del tejido de la mucosa oral, la supervivencia del tejido adiposo después del trasplante de tejido y la reparación de heridas cutáneas 5,6,7,8. El enorme potencial de los ADSC EV en la medicina regenerativa es evidente. Existen varios métodos para extraer y separar los VE del sobrenadante, como las técnicas basadas en la centrifugación, la precipitación, el tamaño molecular, la afinidad y la microfluídica. El método de ultracentrifugación es ampliamente considerado el estándar de oro para aislar los vehículos eléctricos9. El principio fundamental de la ultracentrifugación para la separación de EV se basa en el hecho de que las partículas de la muestra tienen diferentes coeficientes de sedimentación, lo que da lugar a su sedimentación y agregación en distintas capas de separación. Sin embargo, aún no se ha establecido un protocolo detallado que enfatice las precauciones durante la ultracentrifugación.
Por lo tanto, este estudio describe objetivamente la cultura ADSC, la recolección de sobrenadantes y los procedimientos de ultracentrifugación de EV y los puntos clave con un flujo lógico de información y un lenguaje claro y formal. Esto proporciona una referencia valiosa para futuros experimentos.
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Protocolo
La descripción general de los pasos del protocolo se muestra en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de los medios
- Prepare un medio de cultivo para ADSC sin exosomas utilizando 450 mL de medio de cultivo basal, 50 mL de suero fetal bovino sin exosomas y 5 mL de antibióticos triples.
2. Resucitación y cultivo de ADSC
NOTA: Resucitar los ADSC.
- Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
- Precalentar previamente el medio en un baño de agua a 37 °C.
- Extraer 2 tubos de ADSC congelados (P3) de nitrógeno líquido y agitarlos en un baño de agua a 37 °C a temperatura constante hasta que se descongelen por completo.
NOTA: La abertura del tubo del congelador no debe estar en contacto con el agua para evitar la contaminación. - Desinfecte el tubo de criopreservación con alcohol al 75% y luego muévalo a la mesa ultra limpia. Aspire la suspensión celular con una pipeta y colóquela en un tubo centrífugo de 15 mL.
- Coloque el tubo de centrífuga en una máquina centrífuga de baja velocidad y centrifuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
- Prepare cuatro platos de cultivo de 10 cm y ponga 9 mL de medio en cada plato. Marque el nombre, el tipo de célula, la generación y la fecha de experimentación, y luego precaliéntelas en una incubadora de celdas termostáticas a 37 °C.
- Desinfecte el tubo de centrífuga y muévalo a la mesa ultra limpia. Retire el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 4 mL de medio y agitar suavemente la solución (1 x 105 células/mL) hasta que se disperse uniformemente.
NOTA: Tenga cuidado de no eliminar el pellet de células al extraer el sobrenadante. - Agregue 1 mL de suspensión celular a cada plato. Agita los platos con un método cruzado.
NOTA: Coloque la placa sobre una superficie nivelada y agítela en un patrón cruzado (moviéndola hacia arriba, hacia abajo, hacia la izquierda y hacia la derecha) durante 5-6 repeticiones. Evite los movimientos circulares, ya que pueden causar acumulación de células en el centro. - Observe las células con un aumento de 40x con el microscopio óptico y luego coloque las placas en la incubadora.
NOTA: El propósito principal de observar las células es determinar si están distribuidas uniformemente, ya que la distribución desigual afectará el crecimiento posterior. - Prepare el medio de intercambio para las células.
- Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
- Precalentar previamente el medio en un baño de agua a 37 °C.
- Observe el estado de la célula bajo el microscopio óptico con un aumento de 40x. El nivel de confluencia es de aproximadamente el 50%.
NOTA: El nivel de confluencia se calcula como la relación entre el área ocupada por las células y el área de la superficie de la placa de Petri después de que las células se adhieren a la pared y se estiran completamente. - Transfiera la placa de cultivo a la mesa ultralimpia (nivel de bioseguridad 2) después de la desinfección y retire el medio.
- Enjuague suavemente cada plato de cultivo dos veces con 2 ml de solución de PBS.
- Agregue 10 mL de medio a cada plato. Transfiera los platos a la incubadora.
3. Recogida del sobrenadante de los ADSCs y extracción de los EVs
- Encienda previamente la radiación UV de la mesa ultra limpia y desinféctela durante 30 min.
- Observe el estado de la célula bajo un microscopio. El nivel de confluencia es de aproximadamente el 80%.
- Transfiera el plato a la mesa ultra limpia después de la desinfección. Recoja cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y colóquelo en un tubo de centrífuga de 50 mL.
NOTA: Las células se pueden congelar o desechar. Si no se requiere esterilidad, se pueden realizar los siguientes pasos en la mesa de operaciones. En este punto, el experimento se puede pausar y luego reiniciar más tarde. Si el experimento se interrumpe, almacene el sobrenadante en un refrigerador a 4 °C durante no más de una semana. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo, ya que puede afectar a la actividad de los vehículos eléctricos. El enfoque óptimo es extraer los vehículos eléctricos de inmediato. - Centrífuga (300 x g, 10 min, a temperatura ambiente) para eliminar las células en suspensión. Recoja el sobrenadante con una pipeta.
NOTA: No verter. Deje un poco de sobrenadante para evitar que la pellet sea aspirada. - Centrifugar para eliminar los restos celulares (2000 x g, 10 min, 4 °C) y continuar recogiendo el sobrenadante con una pipeta.
NOTA: Los puntos clave son los mismos que en el paso 3.4. - Filtre el sobrenadante con una membrana de 0,22 mmm para eliminar las partículas grandes y los restos celulares.
NOTA: Filtre el sobrenadante con 2 mL de PBS estéril para humedecer la membrana del filtro antes de la filtración. - Centrífuga en la máquina ultracentrífuga (10.000 x g, 30 min, 4 °C).
- A continuación, centrifugar a 1,00,000 x g durante 70 min a 4 °C para eliminar el pellet y recoger el sobrenadante.
NOTA: Los EV obtenidos se purificaron por centrifugación varias veces para aumentar su pureza. Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. Por lo tanto, es crucial operar la pipeta con cuidado y dejar un poco de sobrenadante en el fondo para evitar la acumulación de pellets. - Retire el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender el pellet con PBS y centrífuga (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
NOTA: Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. Por lo tanto, al aspirar el sobrenadante con una pipeta, es fundamental eliminar el sobrenadante de manera suave y completa para maximizar la pureza de los EV. - Retire el sobrenadante y obtenga el pellet EV. Vuelva a suspenderlo con 1 mL de PBS, transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1 mL y guárdelo en un refrigerador a 4 °C para su posterior detección.
NOTA: Es posible que el perdigón no sea visible a simple vista. En consecuencia, al aspirar el sobrenadante con una pipeta, es crucial eliminar suave y completamente el sobrenadante para maximizar la pureza de los EV. Si las muestras no son necesarias durante un período prolongado, guárdelas en un refrigerador a -80 °C.
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Resultados
En primer lugar, se caracterizaron e identificaron las ADSC, incluyendo su morfología10 y los anticuerpos de superficie. Con base en la Figura 2A, es evidente que los ADSC están dispuestos en forma de huso y forman un vórtice después de un crecimiento denso. Las células cultivadas se diferenciaron en células adipogénicas, osteogénicas y condrogénicas y se tiñeron con rojo de aceite O, rojo de alizarina y azul alcián11. El experimento de diferen...
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Discusión
Durante el proceso experimental formal, varios puntos son cruciales para lograr los mejores resultados experimentales. Basándonos en nuestra experiencia previa, se recomienda optar por los ADSC de paso 3-6, ya que garantizan el mejor estado celular posible. Antes de P3, es posible que los glóbulos rojos, las células endoteliales y otras células diversas no se hubieran excluido. Después de P6, las células pueden envejecer gradualmente, lo que puede afectar el estado de las VE secretadas. En segundo lugar, el sobrenadante ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún interés financiero que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202473).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de aguja Acrodisc de membrana Supor | Acros Organics | 4652 | 0.22 μ m |
| Medio basal para cultivo celular | OriCell | BHDM-03011 | |
| Suero fetal bovino sin EXO + Suplemento de cultivo (para células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano) | OriCell | HUXMD-05002 | |
| Microscopio invertido | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
| Centrífuga de baja velocidad | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd. | SC-3612 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| Optima Max-XP Ultracentrífuga de sobremesa | Beckman Coulter | 393315 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina-gentamicina (100x) | Solarbio | P1410 |
Referencias
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
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Reimpresiones y permisos
