Identificación microbiana directa mediante un sistema automatizado de identificación microbiana para facilitar el método EUCAST RAST sin espectrometría de masas

Summary

EUCAST ha desarrollado un protocolo de pruebas directas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para hemocultivos automatizados. Sin embargo, su dependencia de la identificación microbiana basada en espectrometría de masas puede evitarse mediante el uso de un protocolo de preparación directa de inóculo en un sistema automatizado de identificación microbiana. Este enfoque puede proporcionar informes AST dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la muestra.

Abstract

La sepsis gramnegativa (GN) es una emergencia médica en la que el tratamiento en entornos de recursos limitados se basa en técnicas convencionales de cultivo microbiológico que proporcionan resultados en 3-4 días. Reconociendo este retraso en el tiempo de respuesta (TAT), tanto EUCAST como CLSI han desarrollado protocolos para determinar los resultados de AST directamente a partir de frascos de hemocultivo automatizados (+aBC) marcados positivamente. El protocolo EUCAST rapid AST (RAST) se introdujo por primera vez en 2018, donde se pueden informar puntos de corte de diámetro de zona para cuatro agentes etiológicos comunes de la sepsis GN, es decir, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugintosa y Acinetobacter baumannii complex. Sin embargo, los laboratorios clínicos que han implementado este método en su flujo de trabajo rutinario confían en la identificación microbiana basada en espectrometría de masas, que no está fácilmente disponible, lo que impide su implementación en entornos con recursos limitados. Para evitarlo, evaluamos un protocolo de inóculo directo (DIP) utilizando un sistema comercial automatizado de identificación microbiana y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (aMIAST) para permitir la identificación microbiana temprana dentro de las 8 h posteriores a la señalización positiva de aBC. Evaluamos este protocolo de enero a octubre de 2023 para identificar los cuatro GN DE NOTIFICACIÓN OBLIGATORIA DE RAST (RR-GN) en el aBC marcado positivamente. Los resultados de la identificación microbiana en DIP se compararon con el protocolo estándar de preparación de inóculo (SIP) en aMIAST. De 204 +aBCs con GN monomórfica (+naBC), una de las 4 RR-GN fue identificada en 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 y A. baumannii complex: 26). De estos, el 94% (98/105) fueron identificados correctamente por DIP, mientras que las tasas de error mayor y error muy grave fueron del 6% (7/105) y 1,7% (4/240), respectivamente. Cuando la DIP para la identificación microbiana se realiza utilizando el método EUCAST RAST, se pueden proporcionar informes clínicos provisionales dentro de las 24 horas posteriores a la recepción de la muestra. Este enfoque tiene el potencial de reducir significativamente el TAT, lo que permite la instauración temprana de una terapia antimicrobiana adecuada.

Introduction

La sepsis, un importante problema de salud mundial, se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal debido a una respuesta desregulada del huésped a la infección. El Estudio sobre la Carga Mundial de Enfermedades estimó que en 2017 hubo 48,9 millones de casos de sepsis y 11 millones de muertes relacionadas con la sepsis en todo el mundo, lo que representó casi el 20% de todas las muertes mundiales¹. Alrededor de 2/3 de^las infecciones del torrente sanguíneo (ISB) que causan mortalidad se deben a patógenos bacterianos gramnegativos². Las principales causas de mortalidad entre los gramnegativos (GN) son Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii, que representan alrededor del 40% de los casos entre 33 patógenos bacterianos².

Los hemocultivos siguen siendo el estándar de oro para el diagnóstico de la BSI, y la identificación microbiana rápida junto con los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) es la clave para el tratamiento. Se ha estimado que hay un aumento del 9% en las probabilidades de mortalidad con un retraso de cada hora en la instauración de antimicrobianos apropiados en la sepsis³. El tiempo de respuesta (TAT) de los informes de hemocultivos microbiológicamente positivos con resultados de AST es de alrededor de 48-72 h con las herramientas microbiológicas disponibles en entornos de recursos limitados, incluso con sistemas automatizados. Como resultado de este TAT deficiente, los antimicrobianos de amplio espectro se utilizan empíricamente, lo que contribuye al creciente problema de la resistencia a los antimicrobianos (RAM). Reconociendo esta urgente necesidad de reducir el TAT para las técnicas de cultivo microbiológico para la sepsis, EUCAST y CLSI están avanzando hacia la realización de AST directamente a partir de frascos de hemocultivo con marca positiva (+aBC)^4,5.

En 2018, EUCAST introdujo por primera vez el método rápido de AST (RAST) para determinar AST mediante el método de difusión en disco de Kirby-Bauer a tiempos de incubación cortos, es decir, 4 h, 6 h y 8 h, directamente desde +aBC ^6,7. El método está validado actualmente para determinar AST para +aBCs que contienen una de las 8 causas más comunes de BSI, a saber, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa y el complejo A. baumannii entre los gramnegativos y Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium y Streptococcus pneumoniae entre los grampositivos⁸. Los puntos de corte para la determinación de AST en varios intervalos de tiempo se proporcionan según las especies microbianas enumeradas anteriormente. Por lo tanto, antes de la interpretación categórica de los resultados de AST, es necesaria la identificación microbiana. Sin embargo, el estándar RAST no especifica el método para permitir la identificación microbiana dentro de este período de tiempo.

La mayoría de los estudios que evalúan el método EUCAST RAST en su entorno han utilizado la identificación microbiana basada en espectrometría de masas después de una incubación corta en medios plateados para identificar microorganismos 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Sin embargo, los instrumentos de espectrometría de masas no están ampliamente disponibles, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos, lo que limita en gran medida la utilidad potencial de este método. Pocos estudios han reportado la implementación de este método en sus centros sin utilizar espectrometría de masas 18,19,20. Tayşi et ^al.18 reportaron una categorización amplia de GN entre Enterobacterales, Pseudomonas y Acinetobacter spp. basada en la morfología de la tinción de Gram y la prueba de oxidasa antes de interpretar los resultados de AST. En otros estudios de este centro, realizados por Gupta et ^al.19 y Siddiqui et ^al.20, la identificación microbiana a nivel de especie se realizó mediante la preparación de un pellet bacteriano a partir de la mezcla de sangre y caldo marcado positivamente y su inoculación en las pruebas bioquímicas convencionales. Mientras que Tayşi et ^al.18 no comentaron sobre la precisión de la identificación microbiana con su enfoque, Gupta et ^al.19 informaron que con su enfoque en 165/176 (94%) casos, un RAST gramnegativo notificable (RR-GN), es decir, de E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii complejo. Sin embargo, con este último enfoque, la lectura de los resultados de RAST se realizó retrospectivamente utilizando puntos de corte de 8 h de diámetro de zona solo después de la incubación completa de los resultados bioquímicos convencionales, es decir, 18-24 h después de la inoculación, y el tiempo promedio para el informe fue de alrededor de 2 días.

Para reducir aún más el TAT de los informes clínicos, proponemos una metodología alternativa que permita la identificación temprana de GN presente en +aBCs utilizando aMIAST. Antes de la introducción de los sistemas de identificación microbiana basados en espectrometría de masas, estos sistemas de identificación automatizados se consideraban el estándar de atención para la identificación microbiana, donde la identificación era posible mediante cambios colorimétricos y/o fluorométricos inducidos por bacterias de prueba cuando se inoculaban en pruebas bioquímicas miniaturizadas alojadas en un casete y comparaban los resultados con su base de datos de aislados. El tiempo promedio de identificación en estos sistemas es de alrededor de 4 h a 8 h, sin embargo, están limitados por el hecho de que los fabricantes recomiendan el crecimiento nocturno de microbios antes de que sus respectivas tarjetas de identificación puedan ser inoculadas. Este requisito limita en gran medida su utilidad para reducir el tiempo de presentación de informes.

Pocos estudios han evaluado métodos para identificar directamente microbios a partir de +aBCs utilizando estos sistemas automatizados 21,22,23,24,25,26,27. En el caso de los +aBCs que contenían GN monomórfica, la mayoría de los estudios mostraron una excelente concordancia entre la inoculación directa a partir de gránulos bacterianos hechos a partir de una mezcla positiva de sangre y caldo y la incubación estándar de la colonia. Sin embargo, en el caso de los grampositivos, las tasas de concordancia fueron subóptimas. Dado que el tiempo medio hasta la positividad de los +aBCs es de entre 8 h y 16 h y la identificación de la GN tarda ~4 h a 8 h en un sistema automatizado de identificación microbiana, planteamos la hipótesis de que al emplear el protocolo de inoculación directa en la identificación microbiana automatizada, podemos completar el informe clínico de los +aBCs con GN con un RR-GN dentro de las 24 h posteriores a la recepción de la muestra.

Entorno para el estudio
El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de bacteriología clínica de un instituto académico de atención terciaria de importancia nacional (INI) de 950 camas en el centro de la India de enero a octubre de 2023. El laboratorio está equipado con un sistema de monitorización continua de hemocultivos (CBCMS) y aMIAST. El laboratorio de bacteriología está funcionando las 24 horas del día con la disponibilidad de técnicos y microbiólogos para procesar y reportar cualquier frasco de hemocultivo marcado positivamente (+aBCs).

Métodos microbianos utilizados aquí
El flujo de trabajo del estudio se muestra en la Figura 1. Los +aBCs que mostraban GNs monomórficas (+naBC) se procesaron mediante inoculación directa de las tarjetas de identificación correspondientes para permitir la identificación y AST utilizando el protocolo EUCAST RAST. Estos resultados se compararon con el método estándar de atención (SoC) para +aBCs, es decir, el subcultivo en medios convencionales sembrados a través de agar sangre de oveja (SBA), agar chocolate (CA) y agar MacConkey (MA), incubado aeróbicamente durante 16 h a 24 h seguido de tarjetas de identificación y AST dadas por aMIAST cuando aparecen colonias aisladas. Se excluyeron del estudio los hemocultivos que mostraran cocos grampositivos, bacilos grampositivos, células de levadura en ciernes y ≥2 microorganismos diferentes en la tinción inicial de Gram o en medios en placa.

Protocol

El estudio, financiado por la beca de investigación interna otorgada al Dr. Ayush Gupta por AIIMS Bhopal, fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Humana (IHEC) vide carta no: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Se utilizó un volumen de muestra de 5 ml en base a los estudios realizados por Quesada et ^al.25 y Muñoz-Dávila et ^al.27.

1. Protocolo estándar de inóculo (SIP) para la identificación bacteriana mediante aMIAST

1. Use guantes limpios y, dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC) de clase IIa, desinfecte el tabique de +naBC con un hisopo que contenga un 70% de alcohol isopropílico.
2. Extraiga aproximadamente 1 ml de la mezcla de caldo sanguíneo utilizando una jeringa estéril con una aguja de 21 G.
3. Dispense 1 gota grande de la mezcla de caldo de sangre de la aguja sobre la superficie del medio plateado, es decir, SBA, CA y MA. Esmerilar las placas e incubar las placas de cultivo en una incubadora a 37 °C ± 2 °C en condiciones aeróbicas durante 18-24 h.
4. Después de la incubación, examine las placas para detectar la aparición de colonias aisladas en un BSC y proceda a la identificación y AST por aMIAST.
5. Para cada aislado, coloque un tubo de poliestireno aMIAST en el soporte del tubo aMIAST y añada 3 ml de solución salina estéril utilizando un dispensador adjunto al frasco de solución salina.
6. Toque de tres a cinco colonias morfológicamente similares con un alambre de inoculación recto estéril y transfiera el inóculo bacteriano al primer tubo.
7. Ajustar la turbidez utilizando suero fisiológico estéril en el tubo inoculado entre 0,47-0,63 McFarland utilizando un densitómetro.
8. Coloque la fijación capilar de la tarjeta de identificación aMIAST gramnegativa en el primer tubo.
9. Coloque las tarjetas seleccionadas en una posición adecuada en el casete. El inóculo en el casete está listo y llega a la sección de llenado de aMIAST.
   PRECAUCIÓN: La edad de suspensión no debe exceder los 30 minutos antes de inocular las tarjetas.
10. Cargue el casete en su posición en la cámara de llenado con el código de barras de muestra hacia adentro.
11. Cierre la puerta y presione Llenar en la pantalla de la interfaz de usuario. El llenado es un ciclo de 70 s. Cuando se complete el ciclo, la luz indicadora azul del sistema parpadeará. La colocación de las tarjetas en el sistema aMIAST distribuye el inóculo dentro de las pequeñas cámaras de las tarjetas por la máquina.
12. Retire el casete de la cámara de llenado, cierre la puerta y colóquelo en la cámara de carga. Los códigos de barras se escanean automáticamente y se cotejan con la lista de trabajo electrónica de casete virtual. Las pajitas se sellan automáticamente y las tarjetas se cargan automáticamente en el carrusel. La flecha azul parpadeante en el aMIAST indica que la carga ha finalizado.
13. Retire los residuos de cassette cuando termine. Consulte el procedimiento de eliminación de residuos en la documentación del producto o siga otras prácticas estándar. Utilice el resto de la suspensión en los tubos para subcultivar en agar CLED para verificar la pureza de los aislados.
14. Lea los resultados después de que el instrumento complete el análisis.

2. Protocolo de inóculo directo (DIP) para la identificación bacteriana mediante aMIAST

1. Use guantes estériles y, dentro de un gabinete de bioseguridad, limpie el tabique de +naBC con un hisopo que contenga alcohol isopropílico al 70%.
2. Utilizando una jeringa estéril con aguja de 21 G, extraiga 5 mL de alícuota de la mezcla de sangre y caldo de +naBC y transfiéralo a un tubo separador de suero (SST) después de desinfectar el tabique de goma con alcohol isopropílico al 70% (Figura 2A).
3. Centrifugar esta alícuota durante 10 minutos a 160 x g para asentar las células sanguíneas en la mezcla de sangre y caldo. Después de la primera centrifugación, observe el sobrenadante en el que se asentarán las células sanguíneas.
4. Abra la tapa del vial dentro de un gabinete de bioseguridad y, con una punta y una pipeta estériles, retire con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo vial de extracción de sangre simple (tapa roja) quitando la parte superior.
5. Coloque el tapón en el vial y vuelva a centrifugarlo durante 10 min a 2000 x g. Después de la segunda centrifugación, se formará una bolita bacteriana en la parte inferior.
6. Aspire el sobrenadante y deséchelo con una pipeta y una punta estériles. El pellet bacteriano permanecerá en el fondo del tubo y se utilizará para inocular la tarjeta de identificación aMIAST.
   NOTA: En la primera centrifugación se utilizó un tubo separador de suero a 160 x g. Esto se basó en los estudios realizados por Quesada et ^al.25 y Muñoz-Dávila et ^al.27_, donde el primer paso de centrifugación se realizó aproximadamente a 30 x g y 60 x g, respectivamente. La mezcla de caldo de sangre de un +aBC se centrifugó primero a baja velocidad en un SST para extraer las células sanguíneas.
7. Coloque un tubo de poliestireno aMIAST en el soporte del tubo aMIAST y añada 3 ml de solución salina estéril utilizando un dispensador adjunto al frasco de solución salina.
8. Utilizando un asa de inoculación estéril, tome el pellet bacteriano del fondo del vial e inocule en el tubo aMIAST
9. Repita los pasos 1.7-1.14.

3. AST por el protocolo EUCAST RAST⁴

1. Mantenga listas las placas circulares de agar Mueller-Hinton (MHA) de 90 mm sin inocular en el gabinete de bioseguridad.
2. Use guantes estériles y, dentro de un gabinete de bioseguridad, limpie el tabique de +naBC con un hisopo que contenga alcohol isopropílico al 70%.
3. Con una jeringa estéril, aspire 125 μL ± 25 μL de mezcla de caldo sanguíneo sin diluir de +naBC y agréguelo a cada placa de MHA en el centro.
4. Extienda el caldo suavemente sobre los platos con un bastoncillo de algodón estéril en tres direcciones y aplique ≤ 6 discos antimicrobianos en cada plato.
5. Incubar las placas en una incubadora aeróbica a 35 °C± 1 °C durante 8 h. Después de completar la incubación, observe la pureza del aislado.
6. Leer las zonas de inhibición a las 8 h ± 5 min. Interprete los resultados utilizando la tabla de puntos de corte RAST para incubación corta después de verificar los resultados de identificación bacteriana en el aMIAST.
7. Informe los resultados de AST solo si el aislado se identifica como uno de los RR-GN y las placas MHA y CLED están desarrollando un solo morfotipo.

4. Control de calidad

1. Realizar un control de calidad interno para el protocolo SIP de aMIAST según las instrucciones del fabricante utilizando las cepas de referencia recomendadas.
2. Realizar semanalmente un control de calidad interno del método RAST utilizando la cepa de referencia recomendada de E. coli como se describe a continuación.
   1. Coloque 4 tubos de vidrio estéril en un soporte para tubos. Dispensar 3 ml de solución salina estéril en el primer tubo y 990 μl de solución salina estéril en cada uno de los tubos segundo, tercero y cuarto.
   2. Realice una suspensión McFarland 0.5 de la cepa QC de las colonias aisladas de un cultivo nocturno en medios plateados.
   3. Con una pipeta y una punta estériles, transfiera 10 μL de suspensión del primer tubo al segundo tubo.
   4. Después de mezclar, transfiera 10 μL de suspensión del segundo al tercer tubo y luego al último tubo.
   5. Del último tubo, tome 1 mL del inóculo con una jeringa estéril con una aguja y agréguelo a un aBC no inoculado.
   6. Añadir simultáneamente 5 mL de sangre de oveja estéril en el aBC utilizando una jeringa estéril con una aguja e incubarla en el CBCMS hasta que marque positivo debido al cambio en el color del sensor de emulsión líquida en la base del aBC.
   7. Repita los pasos como se explica en los pasos 1 a 3 para la identificación por SIP, DIP y RAST, respectivamente. Los resultados esperados son que la deformación QC debe identificarse correctamente mediante ambos protocolos de identificación del aMIAST y que los diámetros de zona en las placas RAST deben estar dentro del rango especificado²⁸.

5. Análisis estadístico

1. Considere la identificación microbiana utilizando SIP como estándar de oro y si la misma identificación se obtiene mediante DIP, considérela como concordante.
2. Si un RR-GN, es decir, uno de los complejos E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii identificados mediante SIP, es discordante en el DIP, considéralo como un error mayor (EM), mientras que lo contrario lo considera como un error muy grave (VME), ya que tiene el potencial de emitir un informe con una identificación incorrecta.
3. Calcule la tasa de concordancia para RR-GN como la relación entre el número total de RR-GN concordantes y el número total de RR-GN identificados por SIP multiplicado por 100.
4. Calcule la tasa de EM como la relación entre el número de +naBC identificados como no RR-GN y el número total de +naBC con RR-GN identificados por SIP multiplicado por 100.
5. Calcule la tasa VME como la relación entre el número de +naBC identificados erróneamente como que tienen un RR-GN en DIP y el número total. de +naBCs probados por DIP multiplicado por 100.
6. Calcule el tiempo de identificación del aislado (TTI) como el tiempo que se tarda en identificar el aislado por ambos protocolos desde el momento del marcado del hemocultivo por el CBCMS.
7. Calcular las diferencias entre el DIP y el SIP como una reducción en el TTI. Calcule esto solo para los concordantes +naBC que tienen un RR-GN. Anote los puntos de tiempo respectivos de los relojes de CBCMS y aMIAST.
8. Administre datos y analícelos usando una hoja de cálculo. Utilice la prueba U de Mann-Whitney para variables continuas, considerando un valor p bilateral de ≤ 0,05 como estadísticamente significativo.

Results

Resultados generales
Durante el período de estudio, 240 +naBCs se sometieron a la identificación por aMIAST utilizando DIP y SIP. De estos, se encontró que el 15% (36/240) de +naBCs eran polimicrobianos después de la incubación durante la noche en los medios sembrados. De los 204 +naBCs, la proporción de RR-GN identificados por SIP fue del 51,5% (105/204). De ellos, el 47,6% (50/105) fueron E. coli, el 19% (20/105) K. pneumoniae, el 8,6% (9/105) P. aeruginosa y el 24,8% (26/105) el complejo A. baumannii . En la Tabla 1 se proporciona una descripción detallada de todos los resultados de identificación por SIP.

Precisión diagnóstica en la identificación microbiana
De las 105 RR-GN, 98 (93,3%) y 99 (94,2%) concordaron con la identificación a nivel de DIP, especie y género, respectivamente. Las tasas de concordancia entre organismos fueron de 94% (47/50) para E. coli, 90% (18/20) para K. pneumoniae, 100% (9/9) para P. aeruginosa y 92,3% (24/26) para el complejo A. baumannii , como se muestra en la Tabla 1. En 7 +naBCs, los resultados fueron discordantes hasta la identificación a nivel de especie utilizando DIP, de los cuales aMIAST dio no identificado (3) o identificó un Non-RR-GN (4), como se muestra en la Tabla 2. Dado que estos resultados no obligan al microbiólogo clínico a informar, se consideraron errores mayores (EM). La tasa de EM en nuestro estudio fue del 6,7% (7/105) hasta la identificación a nivel de especie. La proporción de GN-no RR en aMIAST por SIP fue del 48,5% (99/204). De ellos, 60 (60,6%) fueron concordantes por DIP hasta la identificación a nivel de especie. Entre los 99 GN-RR, se identificó una GN-RR utilizando DIP en 4 +naBCs, como se muestra en la Tabla 2. Tal discordancia podría haber llevado a un error de informe y se consideró un error muy grave (VME). La tasa general de VME usando DIP fue del 1,7% (4/240). En la Tabla Suplementaria 1 se muestra una descripción completa de los resultados de identificación y los errores de todos los gramnegativos.

Reducción del tiempo de identificación aislada (TTI)
El TTI de los +naBCs concordantes en DIP fue significativamente menor que el TTI en SIP (mediana (RIC): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (prueba de Mann-Whitney)). La mediana de la diferencia en el TTI entre ambos protocolos fue de 1635 min (RIC: 1964-1299).

Figura 1: Flujo de trabajo del estudio: representación del flujo de trabajo en el estudio para el frasco de hemocultivo marcado positivamente con gramnegativos monomórficos que se procesan mediante el protocolo de inóculo estándar y directo. Abreviaturas: +aBC = frasco de hemocultivo con marca positiva, +naBC = frasco de hemocultivo con gramnegativos monomórficos, DIP = Protocolo de inóculo directo, SIP = Protocolo de inóculo estándar, SBA = Agar sangre de oveja, CA = Agar chocolate, MA = Agar MacConkey, RR-GN = RAST gramnegativo notificable, TAT = Tiempo de respuesta Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Protocolo de inóculo directo para la identificación bacteriana: muestra imágenes de los viales durante la realización del protocolo de inóculo directo. Abreviaturas: +naBC = frasco de hemocultivo marcado positivamente con gramnegativos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gramnegativos notificables RAST	Aislados probados (n)	Concordante	Identificación errónea	Sin identificación
		n (%)	n (%)	n (%)
Total	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Complejo Acinetobacter baumannii	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Un aislado correctamente identificado a nivel de género, pero no a nivel de especie (complejo de Acinetobacter baumannii identificado como A. haemolyticus)

Tabla 1: Resultados de la identificación bacteriana en el protocolo de inóculo directo. Los resultados son solo para los Gram-negativos notificables por RAST. Abreviaturas: n = numerador, % = porcentaje.

Gramnegativos	Total de aislados analizados	Error grave			Error muy importante, n (%)
		Número	Identificación errónea	Sin identificación	(identificado como)
		n (%)	n	n
Escherichia coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Complejo Acinetobacter baumannii	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	NA			1 (10%)
					(E. coli)
Complejo Enterobacter cloacae	8	NA			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	NA			1 (7.1%)
					(Complejo A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis	9	NA			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Abreviaturas- n: numerador, %: porcentaje, ID: identificación, NA: no aplicable,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Tabla 2: Detalle de errores mayores y muy graves por protocolo de inóculo directo. Abreviaturas: n = numerador, % = porcentaje, ID = identificación, NA = no aplicable, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Tabla complementaria 1: Resultados detallados de la identificación de organismos en ambos protocolos junto con resultados de errores en el protocolo de inóculo directo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Utilizando DIP, identificamos con éxito los RR-GN con una precisión diagnóstica considerable. La media de TTI después del marcado positivo de aBC fue de solo 507 min (~ 8,5 h). Por lo tanto, cuando se realiza junto con el método EUCAST RAST para la determinación de AST, puede proporcionar una identificación aislada a las 8 h de tiempo de lectura de AST. Este enfoque tiene el potencial de implementar el método EUCAST RAST, obviando la necesidad de una identificación basada en espectrometría de masas. Esto es una bendición para los entornos de bajos recursos que desean implementar el método EUCAST RAST en su flujo de trabajo rutinario para reducir el tiempo de presentación de informes clínicos y sortear los principales obstáculos para su implementación.

Antes de la introducción del método EUCAST RAST, varios autores han evaluado la precisión de las pruebas directas de +aBC para varios sistemas aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. En estos estudios, los protocolos de prueba directa difirieron en seguir un paso de centrífuga simple 29,30,31,32 o un paso de centrífuga doble 21,22,24,25,26,27 para hacer el pellet bacteriano. En el método de un solo paso, la mezcla de caldo de sangre de un +aBC se centrifugó a alta velocidad en un tubo separador de suero (SST) para granular las bacterias por encima de la capa de gel de silicona. El pellet se utilizó para preparar el inóculo para la inoculación de las tarjetas de identificación. En el método de doble centrifugación, la mezcla de caldo de sangre de un +aBC se centrifugó primero a baja velocidad en un SST para extraer las células sanguíneas. De este tubo, se eliminó el sobrenadante que contenía bacterias y se transfirió a un nuevo tubo y se sometió a una centrifugación de alta velocidad. De este tubo se desechó el sobrenadante y se utilizó el pellet para inocular las tarjetas de identificación correspondientes. En estos estudios, la tasa de concordancia varió de 62% a 100%, pero en general, la precisión fue mayor con el método de doble centrifugación.

Descubrimos que el método era fácil de realizar y se llevó a cabo en un laboratorio de diagnóstico de rutina con una fuerza laboral de >10 técnicos de laboratorio en rotación, lo que demuestra la solidez del método. En ~94% (98/105) +naBCs que contenían uno de los RR-GN, el DIP identificó correctamente el microorganismo. La tasa de concordancia para las diferentes categorías de organismos también fue comparable entre sí, ya que fueron de 94%, 90%, 100% y 92,3%, respectivamente para el complejo E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa y A. baumannii. También encontramos que la tasa de concordancia general para cualquier gramnegativo fue subóptima, ~77% (157/204). Sin embargo, la mayoría de estas identificaciones erróneas se produjeron con gramnegativos no fermentativos como Acinetobacter spp. aparte del complejo baumannii, Pseudomonas spp. aparte de aeruginosa, Moraxella spp. y Sphingomonas paucimobilis, que generalmente se consideran contaminantes comunes de la piel. Las identificaciones erróneas con gramnegativos no fermentativos también fueron señaladas por otros autores^21,23, lo que probablemente se deba a la baja reactividad de estas bacterias en las tarjetas de identificación aMIAST.

Encontramos una reducción significativa en el TTI de las bacterias dentro de los +naBCs utilizando DIP. La mediana del TTI de la DIP fue alrededor de 4 veces menor que la mediana del TTI de la SIP (507 min frente a 2171 min) cuando se realizó en un laboratorio de diagnóstico clínico de rutina. Este TTI de ~8,5 h también incluyó el intervalo entre el marcado positivo de aBC y el rendimiento de la inoculación de la tarjeta aMIAST, ya que el tiempo medio para el análisis de aislamiento por aMIAST fue de solo 5,45 h ± 1,6 h. Sumando el tiempo medio a la positividad de 728 min ± 301 min (~12 h) para los +naBCs concordantes en nuestro estudio, este enfoque de identificación bacteriana tiene el potencial de proporcionar informes el mismo día después de recibir el aBC en un laboratorio de diagnóstico de rutina.

También hay ciertas limitaciones con el DIP. En primer lugar, dado que se trata de un uso no indicado en la etiqueta de la preparación de inóculo, los resultados deben considerarse preliminares, al igual que los resultados de AST de EUCAST RAST. Sin embargo, cumple el objetivo principal de identificar solo los RR-GN con una precisión diagnóstica considerable de manera oportuna. En segundo lugar, existe la posibilidad práctica de desperdicio de recursos de prueba, ya que en torno al 60% +naBCs; no hubiéramos podido informar debido a infecciones polimicrobianas o a la identificación de una GNRno RRGN. Este desperdicio de recursos se aplica a cualquiera de los nuevos métodos AST directos automatizados para hemocultivos. En tercer lugar, la tasa de infecciones polimicrobianas y la identificación de contaminantes cutáneos comunes fue mayor en este estudio debido a las malas prácticas de recolección de muestras. En cuarto lugar, no confirmamos la identidad de los aislados analizados con espectrometría de masas, que es el estándar de oro actual para la identificación bacteriana.

Este estudio establece con éxito que, incluso con pruebas fenotípicas, es posible informar en el mismo día de los hemocultivos positivos, especialmente en la bacteriemia gramnegativa. Esto tiene el potencial de reducir considerablemente la duración del inicio de la terapia antimicrobiana adecuada en los países de ingresos bajos y medianos, donde el diagnóstico microbiológico para la identificación bacteriana y la AST se basa en gran medida en las pruebas fenotípicas convencionales. Este enfoque debe validarse mediante la realización de un estudio multicéntrico y su posible impacto en los resultados de los pacientes, y como herramienta de optimización de los antimicrobianos debe ser el foco de los futuros ensayos clínicos en los países de ingresos bajos y medianos.

En conclusión, el DIP para aMIAST complementa el método EUCAST RAST para permitir la identificación temprana de RR-GNs. Esto evita la necesidad de confiar en técnicas avanzadas de identificación microbiana y AST, ya que el tiempo para informar con estos enfoques es comparable con este enfoque. En los casos de bacterias gramnegativas, se puede lograr la notificación el mismo día a través de métodos fenotípicos convencionales, si se optimizan al máximo. Esto tiene el potencial de reducir la duración del tratamiento antimicrobiano de amplio espectro y facilitar la administración de antimicrobianos en entornos con recursos limitados.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIANOS FUERTES amikacina
30 y micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de amoxiclavo (20/10 y micro; g)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de cefotaxima 5 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de ceftazidima 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de ciprofloxacino (5 µ g)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de co-trimoxazol (23,75/1,25 y micro; g)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de gentamicina 10 y micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de imipenem 10 µ g	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Levofloxacina disco 5 y micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de meropenem 10 y micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL Pruebas de	susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de piperacilina-tazobactam (30/6 y micro; g)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL Pruebas de	susceptibilidad a los antimicrobianos
Disco de tobramicina 10 y micro; g	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A Cepa	bacteriana gramnegativa recomendada para el control de calidad en RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	412CM8423	Sistema de hemocultivo automatizado continuo
Cabina de bioseguridad II Tipo A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	Para la protección contra agentes peligrosos e infecciosos y para mantener el control de calidad
Base de agar sangre n.º 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparación de agar sangre y agar chocolate
Modelo de centrífuga clínica SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugación a baja y alta velocidad para la separación del sobrenadante
Dispensette S Dispensador de tapa de botella ajustable analógico	BrandTech, Essex CT, Inglaterra	V1200	Dispensación de una cantidad precisa de agar MacConkey de solución salina
	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Medios diferenciales para fermentadores de lactosa / no fermentadores Bacilos gramnegativos
Micropipeta (100-1000 y micro; L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferencia de sobrenadante después de la primera centrifugación, descarte del sobrenadante después de la segunda centrifugación
Puntas de micropipeta (200-1000 y micro; L)	‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Calcuta, India	521020	Transferencia de sobrenadante después de la primera centrifugación, descarte del sobrenadante después de la segunda centrifugación
Agar Mueller-Hinton	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por el método Kirby-Bauer de difusión de disco
Bucle de nicromo D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	Para rayar en medios de cultivo
Alambre recto de nicromo	Himedia, Mumbai, India	LA022	Para inoculación de puñaladas
Guantes estériles Nulife	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		Para la seguridad precauciones
Frasco simple (vial con tapa roja), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, EE. UU	367815	Obtención de pellets después de la segunda centrifugación
Sangre de oveja	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparación de agar sangre y agar chocolate
tubo SST II, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, EE. UU	367954	Separación del sobrenadante en la primera centrifugación
Hisopo de algodón estéril (con palo de madera)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Cultivo de césped de caldo de hemocultivo para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
Jeringa hipodérmica estéril de un solo uso 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparación de alícuotas del kit
	de referencia +aBC VITEK DensiCHEK McFarlandbioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	422219	Densitómetro para comprobar la turbidez de la suspensión
VITEK solución salina (0,45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	V1204	Ajuste de la turbidez estándar de McFarland
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	533306-4 REV	Soporte para la colocación correcta de los tubos antes de la inoculación de la tarjeta de identificación
Tubos VITEK	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia		Tubos para la preparación de inóculo
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	VKC15144	Identificación automatizada y sistema AST
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francia	21341	Identificación de bacilos gramnegativos