Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.

Resumen

Los organoides de la retina (RO) son un sistema de cultivo tridimensional que imita las características de la retina humana y que se han diferenciado de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en condiciones específicas. El desarrollo y la maduración de las sinapsis en las RO se han estudiado inmunocitoquímica y funcionalmente. Sin embargo, la evidencia directa de la ultraestructura de contacto sináptico es limitada, ya que contiene tanto sinapsis de cinta especiales como sinapsis químicas convencionales. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución y una historia respetable que dilucida el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos y diversas especies. Es una herramienta poderosa para explorar la estructura sináptica en las RO y es ampliamente utilizada en el campo de investigación de las RO. Por lo tanto, para explorar mejor la estructura de los contactos sinápticos de RO a nanoescala y obtener evidencia microscópica de alta calidad, desarrollamos un método simple y repetible de preparación de muestras de RO TEM. Este documento describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, incluida la preparación de la fijación de ósmosis inversa, la posfijación, la inclusión y la visualización.

Introducción

La retina, un órgano sensorial visual vital en humanos y mamíferos, exhibe una estructura laminada distinta caracterizada por tres capas nucleares que albergan somas neuronales y dos capas plexiformes formadas por conexiones sinápticas¹, incluidas las sinapsis convencionales y la sinapsis de cinta especializada ^2,3. La sinapsis en cinta desempeña un papel crucial en la transmisión de los impulsos vesicular de forma gradual ^2,3. El proceso de visión implica la transmisión de señales electroópticas a través de varios niveles de neuronas y sinapsis, llegando finalmente a la corteza visual ^4,5.

Los organoides de la retina (ROs) representan un sistema de cultivo tridimensional (3D) derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que imitan los estados fisiológicos del tejido retiniano in vitro ^1,6,7. Este enfoque es prometedor para el estudio de las enfermedades de la retina⁸, el cribado de fármacos⁹ y sirve como una terapia potencial para las enfermedades degenerativas irreversibles de la retina, como la retinosis pigmentaria¹⁰ y el glaucoma¹¹. Como potente sistema de conducción óptica in vitro, la sinapsis dentro de las RO es una estructura crucial que facilita la transformación y transferencia efectivas de la señal⁵.

A grandes rasgos, el desarrollo de la RO puede dividirse en tres etapas según sus rasgos morfológicos y perfiles de expresión molecular ^6,12. Las RO en la etapa 1 (alrededor de D21-D60) comprenden células progenitoras neurales de la retina, muchas células ganglionares de la retina (RGC) y algunas células amacrinas (SAC), correspondientes a la primera época del desarrollo fetal humano. En la etapa 2 (alrededor de D50-D150), las RO expresan algunos precursores de fotorreceptores, interneuronas y genes relacionados con la sinaptogénesis, lo que representa una fase de transición. Los fotorreceptores desarrollan la madurez en la etapa 3 de ROs (alrededor de después de D100-D150), correspondiente a la tercera etapa del desarrollo fetal humano ^6,12,13. En particular, en comparación con las RO en la etapa 1 y la etapa 2, las RO en la etapa 3 tienen una estructura laminar distinta cuyas sinapsis han madurado¹², incluida la presencia de sinapsis en cinta¹⁴. Además, un estudio reciente ha confirmado que las sinapsis maduras existen para la transmisión de señales luminosas, lo que indica que son funcionales¹³. Por lo tanto, las RO en la etapa 3 a menudo se seleccionan para investigar la estructura sináptica.

La inmunohistoquímica se aplica ampliamente al estudio de la expresión de diversas proteínas moleculares. Sin embargo, la limitación de la microscopía óptica radica en su capacidad para observar solo un número restringido de células y moléculas específicas a la vez, lo que resulta en una falta de análisis exhaustivo de las relaciones entre las células y su entorno circundante. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución, con una resolución limitada de 0,1-0,2 nm, superando al microscopio óptico en ~10-20 veces¹⁵. Compensa los defectos de la microscopía óptica y se utiliza para dilucidar el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos^16,17 y diversas especies 18,19,20,21. La TEM permite la distinción directa de los componentes presinápticos y postsinápticos^18,20, e incluso permite la observación exhaustiva de estructuras subcelulares como las cintas ^2,3, las vesículas²² y las mitocondrias²³. Por lo tanto, TEM es una herramienta esencial para identificar tipos de sinapsis y explorar la ultraestructura de los contactos sinápticos en RO a nanoescala.

Es crucial tener en cuenta que la preparación de la muestra es de gran importancia para adquirir micrografías electrónicas de alta calidad. Aunque algunos estudios han realizado EM en ROs 12,13,24, los procedimientos detallados no están claros. Dado que la calidad de la imagen de microscopía electrónica depende en gran medida del efecto de la fijación de la ósmosis inversa y la permeabilidad del reactivo, es necesario tener en cuenta varios factores importantes durante la preparación. En consecuencia, para investigar mejor los contactos sinápticos en las RO, presentamos un método con buena reproducibilidad que muestra los puntos de operación de la fijación de la RO, la inclusión y la identificación de los sitios de observación.

Protocolo

1. Obtención de RO de iPSCs²⁵

NOTA: Las RO se derivaron de las iPSC modificando el procedimiento informado anteriormente.

1. Disocie las iPSC en una confluencia de ~90% utilizando una proteasa bacteriana (consulte la tabla de materiales). Pica las colonias en pedazos y ráspalas con un elevador de celdas.
2. Después de la recolección, vuelva a suspender los grupos de células en 0,25 ml de Matrigel helado. Después de 20 minutos de incubación a 37 °C, disperse el gel solidificado con el medio DMEM/F12 (0,5% de suplemento de N2, 1% de suplemento de B27, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,2 mM de sustituto de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina). Defina este tiempo como el día 0 de diferenciación.
3. Después de 5 días de cultivo flotante, las células se agrupan para formar quistes celulares. Transfiera estos quistes celulares a una placa de Petri de 100 mm donde ahora se adherirán y crecerán.
4. El día 15, utilice la proteasa bacteriana para disociar las células adheridas y cultivarlas en medio DMEM/F12 (suplemento de B27 al 2%, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales).
5. El día 21, cambie el medio con 20 mL de medio que contenga suero (medio DMEM/F12, 8% FBS, 2% de suplemento B27, 100 mM de taurina y 2 mM de sustituto de L-glutamina) y reemplace el medio cada semana.

2. Fijación anterior de las ósmosis inversas

1. Mueva suavemente una de las ósmosis inversas cultivadas (~D180, un tamaño de aproximadamente 1~2 mm de diámetro es óptimo) de la placa de Petri a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta y marque la información relevante sobre las ósmosis inversa.
   NOTA: Corte las RO por la mitad o corte el tejido mal estructurado con una navaja bajo el microscopio en el plato que contiene el fijador si las RO son demasiado grandes.
2. Retire el medio de cultivo de los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta. Añadir 1,5 mL de fijador de paraformaldehído al 2%-glutaraldehído al 2% diluido en tampón de fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4, y fijar a temperatura ambiente (RT) durante 4 h. Almacene los tubos de microcentrífuga a 4 °C durante la noche.
   NOTA: Este paso se puede pausar durante 1 semana, pero se recomienda reiniciar lo antes posible. Si las RO se dejan durante más tiempo, pueden causar la autólisis de las células, lo que lleva a la destrucción de la ultraestructura de las RO. Debido a la fragilidad de los ósmosis inversa, evite girar, oscilar, voltear u operaciones bruscas.

3. Fijación posterior de las ósmosis inversa

1. Retirar el fijador de paraformaldehído al 2%-glutaraldehído al 2% y lavar con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS) a pH 7,4 durante 3 x 10 min. Suspenda suavemente las ósmosis inversa en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml durante el proceso de lavado para enjuagar completamente. Por cada día adicional de fijación, aumente el número de lavados en dos para eliminar el fijador residual tanto como sea posible.
2. Retire cualquier resto de PBS con una pipeta y reemplácelo con ~ 150 μL de ácido ósmico al 1% (OsO4) hasta que los bloques de tejido se sumerjan. Coloque los tubos de la microcentrífuga en una caja oscura para protegerlos de la luz e infiltre en RT durante 1 h.
   NOTA: El OsO4 es un oxidante fuerte y debe manipularse en una campana extractora.

4. Manchas y deshidratación

NOTA: El deshumidificador debe encenderse para secar el ambiente a partir de este paso.

1. Eliminar el OsO4 con una pipeta, lavar con 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min y, a continuación, lavar 3 x 10 min con agua desionizada.
   NOTA: Para garantizar el enjuague completo de las ósmosis inversa, recomendamos suspender las ósmosis inversa. Aspire OsO4 en una botella de eliminación dedicada.
2. Retire el último lavado con agua desionizada y reemplácelo con ~ 150 μL por tubo (asegure la infiltración completa de los bloques de tejido) de acetato de uranio y tiña durante 1-2 h en RT. Proteja los tubos de microcentrífuga de la luz.
3. Retire el acetato de uranio y reemplácelo con 1 mL de acetona al 50% en la campana extractora, deshidratando durante 10 min. Luego, use acetona al 70%, 80%, 90%, 100% y 100% para la deshidratación en gradiente de las RO sucesivamente. Cada deshidratación dura 10 min.
   NOTA: Deje un poco de líquido para remojar las ósmosis inversa en cada intercambio para evitar la exposición al aire y la humedad. Además, opere rápidamente lo antes posible porque la acetona es volátil. Aspire el acetato de uranio en una botella de eliminación específica.

5. Infiltración

1. Deseche la acetona y agregue ~ 150 μL de la mezcla que consiste en acetona y resina Epon-812 en una proporción de 1: 1. Colócalo en un horno a 37 °C durante 1 h.
2. Retire la mezcla anterior y reemplácela con una mezcla que consista en acetona y resina Epon-812 en una proporción de 1:4. Colócalo en un horno a 37 °C durante la noche.
3. Transfiera las ósmosis inversas a los nuevos tubos que contienen ~ 500 μL de resina epoxi pura con cuidado y colóquelas en un horno a 45 ° C durante 1 h.

6. Incrustación

1. Prepare los 30-50 ml de resina epoxi pura en un tubo de centrífuga de 50 ml mezclando el kit de reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante con anticipación. Gire la resina epoxi pura boca abajo lentamente durante 30 minutos para reducir las burbujas de aire introducidas por el mezclador. Luego, déjalo en un horno a 37 °C durante 20 min. Agregue 2/3 de volumen de resina epoxi pura a la ranura del molde de inclusión.
2. Use un palillo de dientes para recoger RO en el molde de incrustación equipado con resina epoxi pura.
3. Rellena la ranura con resina epoxi pura hasta que sobresalga o se abulte ligeramente.
4. Ajuste la posición de las ósmosis inversas en ambos extremos del molde de incrustación para la incrustación direccional. Coloque el molde de incrustación en un horno a 45 °C durante 1-2 h y luego póngalo en un horno a 65 °C durante 48-72 h.

7. Posicionamiento semifino

1. Lija el exceso de resina epoxi alrededor del tejido desde los extremos de los cuatro lados más largos del bloque de inclusión para formar una cara trapezoidal. Instale el bloque de incrustación en el soporte de montaje de muestras y atornille el perno con un destornillador en L. Luego, instale cuchillos de vidrio en el soporte de cuchillos y apriete la tuerca manualmente.
2. Recorta el exceso de resina hasta que quede expuesta la zona deseada.
3. Llene el canal del cuchillo de vidrio con agua. Corte rodajas semifinas de 1 μm de grosor con un micrótomo semifino y colóquelas en un portaobjetos de microscopio con una aguja.
4. Añadir 50 μL de azul de toluidina al 1% para teñir rodajas semifinas e incubar durante 1 min a 95 °C en la placa calefactora. Enjuague con agua destilada durante 2 min. Utilice un microscopio óptico ordinario de 20x para observar la estructura de las secciones.

8. Corte ultrafino

1. Instale los bloques de incrustación y las cuchillas de vidrio como se describe en el paso 7.1. Ajuste la distancia entre el cuchillo y el bloque de pañuelo, el nivel de líquido del fregadero y la velocidad de corte. Corte las secciones ultrafinas con un grosor de ~70-100 nm con un micrótomo ultrafino y coloque las rodajas en la malla de cobre (malla 200) con la película de soporte.
2. Tiña las secciones ultrafinas con citrato de plomo al 3% durante 15 minutos para mejorar el contraste en un procedimiento de tinción doble.

9. Imágenes de ósmosis inversa por TEM

1. Inicie el software (consulte la Tabla de materiales).
2. Haga clic en el botón Modo de memoria y marque cada sección ultradelgada de manera aproximada.
3. Búsqueda de estructuras sinápticas.
   1. Distinga la estructura laminada de los RO a bajo aumento.
   2. Localiza la capa nuclear externa (ONL), que muestra una estructura nuclear con una densidad de electrones más profunda. Posteriormente, navegan hasta el terminal del fotorreceptor donde se acumulan numerosas vesículas. Busque los terminales de varilla con una sola cinta sináptica y los terminales de cono con varias cintas sinápticas.
   3. Muévase a la capa plexiforme interna (IPL) y busque una estructura similar con una pequeña cinta.
4. Captura la imagen microscópica.
   1. Haga clic en Inicio e introduzca la potencia de aumento correspondiente.
   2. Guarde las imágenes.

Resultados

El establecimiento de RO 3D a través de la diferenciación de iPSC proporciona una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la retina y la terapia de reemplazo con células madre. Aunque otros han demostrado las conexiones sinápticas en las RO funcional e inmunocitoquímicamente, la evidencia directa de sinapsis convencionales y en cinta es muy limitada. En este trabajo se presenta un método para investigar la ultraestructura de dos tipos de sinapsis en ROs mediante TEM. Después de 180 días de cultivo, las ósmosis inversas se fijaron, se teñieron, se incrustaron y se cortaron en rodajas ultrafinas. La observación de TEM reveló sinapsis en cinta en las terminales axonales de los fotorreceptores (Figura 1 y Figura 2), que se distribuyen en la OPL. Bajo TEM, cintas de bastones esférulan alrededor de la invaginación sináptica, formando un perfil en forma de herradura con células horizontales (Figura 1). Por lo general, los bastones tienen una sola cinta, pero los conos tienen varias cintas (Figura 2). Además, se observaron sinapsis químicas clásicas entre células amacrinas en la IPL (Figura 3). Según la TEM, la sinapsis química consta de tres partes: la presináptica, la hendidura sináptica y la postsináptica. Las membranas celulares correspondientes a las partes presináptica y postsináptica son ligeramente más gruesas que el resto de las partes, y el estrecho espacio entre las dos membranas se denomina hendidura sináptica. Hay muchas vesículas sinápticas en el citoplasma del sitio de la membrana presináptica. Este estudio confirma la presencia de conexiones sinápticas completas en ROs 3D derivadas de iPSC. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que un enjuague incompleto entre pasos conduciría a la precipitación de partículas negras durante el proceso de preparación de la muestra (Figura 4).

Figura 1: Imágenes TEM de sinapsis de cinta de varilla en ROs. (A,B) Las células de bastón y horizontales forman un perfil en forma de herradura. Se observó una sola cinta (puntas de flecha) en cada esférula de la varilla en el OPL de las RO, rodeada de numerosas vesículas. Barras de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: RO = organoides retinianos; HC = celda horizontal; OPL = capa plexiforme externa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes TEM de sinapsis de cinta de cono en RO. Tres sinapsis de cinta (puntas de flecha) eran obvias en un pedículo de cono en el OPL de las RO. Barra de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: TEM = microscopía electrónica de transmisión; ROs = organoides retinianos; OPL = capa plexiforme externa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imagen TEM de sinapsis químicas en ROs. Se observó una sinapsis química convencional entre las células amacrinas en la capa IPL de ROs. La sinapsis química consta de tres partes: la presináptica, la hendidura sináptica y la postsináptica. Hay muchas vesículas sinápticas en el citoplasma del sitio de la membrana presináptica. Una flecha denota la dirección de la transmisión sináptica, lo que indica la transferencia de numerosas vesículas de un proceso AC1 a otro perfil AC2. Barra de escala = 0,2 μm. Abreviaturas: TEM = microscopía electrónica de transmisión; ROs = organoides retinianos; IPL = capa plexiforme interna; AC = células amacrinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Un ejemplo de un problema que puede ocurrir durante el proceso de preparación de la muestra. Hay muchas partículas negras (círculos) en el pedículo del cono debido a un enjuague incompleto entre pasos. Flechas: sinapsis de cinta. Barra de escala = 0,2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para observar la ultraestructura sináptica convencional y de cinta en RO mediante TEM. Este protocolo se basa en los métodos de preparación de la retina descritos anteriormente con algunas modificaciones²⁰. Para mejorar la tasa de éxito del tratamiento de muestras y la calidad de las micrografías TEM, tenga en cuenta los siguientes puntos clave. En primer lugar, es importante reconocer que las RO se desarrollan a partir de iPSCs, formando una masa celular que carece de vasculatura ^6,26 y células gliales²⁶. Esta ausencia puede conducir a una organización menos compacta en comparación con la retina in vivo. Por lo tanto, es crucial manipular a los Ros con cuidado para mantener su estructura e integridad. Agregue líquidos a lo largo de la pared del tubo para minimizar las molestias.

Es importante asegurarse de una deshidratación completa del tejido en el paso 4 del protocolo y encender el deshumidificador para reducir la humedad ambiental antes de comenzar el paso de deshidratación. Al reemplazar la acetona, opere rápidamente y deje que un poco de líquido sumerja el tejido, evitando la destrucción severa de la estructura del tejido de ósmosis inversa. El tejido no deshidratado se contrae bruscamente a altas altitudes EM, y el agua en el tejido dificulta la penetración del agente incrustante.

Dado que las ósmosis inversas se presentan como esferas transparentes, asegúrese de que la dirección sea correcta al cortar rodajas semifinas para obtener estructuras laminares intactas. Por último, las RO en la etapa 3 (alrededor de D100-D150) se consideran maduras y poseen sinapsis integrales¹², como resultado de lo cual, se recomienda que la investigación de los contactos sinápticos, incluidas las sinapsis de cinta y las sinapsis químicas, se realice en esas RO.

A pesar de que en estudios previos se han proporcionado pruebas ultraestructurales limitadas de las sinapsis de RO, no hay detalles sobre el procedimiento completo de preparación de muestras de RO, así como sobre la identificación de varios tipos de estructuras sinápticas 12,13,24. Capowski et al. utilizaron diferentes técnicas para investigar las características de las RO inducidas por diferentes líneas de hPSC en diferentes etapas, incluyendo micrografías electrónicas que muestran la existencia de sinapsis de cinta cargadas de vesículas en el pedículo del cono, que revelaron que las RO en la etapa 3 inducidas por varias líneas de hPSC son maduras y funcionales¹². Utilizando TEM e imágenes de dos fotones, Cowan et al. confirmaron la formación de estructuras sinápticas funcionales en cinta en ROs maduras¹³, pero el tipo de sinapsis no estaba indicado (sinapsis de cono o de bastone). Sin embargo, nuestros varios lotes de resultados de micrografía mostraron la estructura de la membrana de las sinapsis en cinta con una claridad y contraste ideales, lo que ilustra que nuestro método es factible y reproducible. Además, identificamos diferentes tipos de sinapsis según sus diferentes características morfológicas: las sinapsis de cono suelen ser más grandes y tienen varias cintas, mientras que las sinapsis de bastones suelen ser más pequeñas, mostrando solo una cinta; En las sinapsis químicas, las vesículas se acumulan en las estructuras presinápticas y la densidad electrónica de la hendidura sináptica aumenta.

La integridad ultraestructural de los contactos sinápticos en las RO es vital para su función. El empleo de TEM para investigar estos contactos ofrece ventajas amplias y significativas en varios campos, como el estudio de la patogénesis de la retina in vitro, la realización de cribado de fármacos en RO y la evaluación de técnicas de diferenciación de RO, entre otras aplicaciones. Limitado por las imágenes TEM en 2D, solo se puede observar un aspecto específico de la ultraestructura de las RO, lo que dificulta el análisis estereoscópico de toda la estructura de la sinapsis. Además, la acotación de la diferenciación contribuye a que las células se extravíen^13,26, lo que complica aún más el proceso de observación. Por lo tanto, la combinación de EM de volumen con reconstrucción 3D puede superar estas deficiencias en el futuro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 100 mm	Corning	430167
Acetona	Microscopía Electrónica Ciencia	10000
B27 suplemento	Gibco	A3582801
Elevador de celdas	Santa Cruz	sc-395251
Rejillas de cobre	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Software de Micrografía Digital	Gatan, Inc.		Software
Dispasa	StemCell Technologies	#07913	Proteasa bacteriana
DMEM/F12 medio	Gibco	#11320033
Molde de incrustación	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
microscopía electrónica	de resina Epon-812	14900
Suero fetal bovino (FBS)	Industrias biológicas	#04-0021A
Ciencia de microscopía electrónica	de glutaraldehído	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Citrato de plomo	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	Sustituto de la L-glutamina
Matrigel	Corning	356234
portaobjetos de microscopio	CITOTEST	80312-3161
N2 suplemento	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	Un componente de PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	Un componente de PB/PBS
Aminoácidos no esenciales	Sigma	#M7145
Microscopio óptico Microscopio	biológico binocular de laboratorio	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Horno	Bluepard	BPG9040A
Microscopía electrónica de paraformaldehído	Ciencia	157-8
Penicilina-estreptomicina	Gibco	#15140-122
Microtomo semi/ultrafino	Reichert-Jung	396649
Taurina	Sigma	#T0625
azul de toluidina	Microscopios	E670105-0100
	HITACHI	H-7500
Acetato de uranilo	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoetanol	Sigma	444203