Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Resumen

Este protocolo ofrece un método para estudiar la dinámica celular utilizando una sencilla técnica de cultivo in vitro . Proporciona una oportunidad para que los investigadores y educadores del pez cebra estudien los procesos celulares, como los relacionados con la homeostasis ósea y la biología celular básica, mediante la visualización de núcleos fluorescentes y células apoptóticas dentro de las escamas.

Resumen

Las escamas de pez cebra ofrecen una variedad de ventajas para su uso en laboratorios estándar con fines de enseñanza e investigación. Las escamas se recogen fácilmente sin necesidad de eutanasia, se regeneran en un par de semanas y son translúcidas y pequeñas, lo que permite observarlas con un microscopio estándar. Las escamas de pez cebra son especialmente útiles en entornos educativos, ya que brindan una oportunidad única para que los estudiantes participen en experiencias de aprendizaje práctico, particularmente en la comprensión de la dinámica celular y los métodos de cultivo in vitro . El objetivo principal de este protocolo es describir un método para recolectar y mantener escamas de pez cebra en cultivo para su uso en una variedad de estudios biológicos utilizando equipos básicos de laboratorio. Además, el protocolo detalla su uso en la comprensión de la homeostasis ósea mediante el examen de la actividad de las células óseas involucradas en la resorción y deposición ósea. También incluye protocolos adicionales para técnicas generales, como la visualización de núcleos y células apoptóticas. El protocolo de cultivo in vitro produce resultados fiables con un mínimo de reactivos y equipos. Este artículo analiza los beneficios del uso de cultivos in vitro de escamas de pez cebra para fomentar la investigación científica y describe los recursos necesarios para apoyar su integración en entornos educativos.

Introducción

En los últimos años, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un valioso organismo modelo en diversos campos científicos, como la genética, la biología del desarrollo y la toxicología ^1,2,3. El pez cebra es un pequeño pez tropical de agua dulce nativo de los ríos del sudeste asiático⁴. Se han convertido en un organismo modelo popular en biología debido a su fácil mantenimiento, pequeño tamaño, ciclo reproductivo rápido y embriones translúcidos^. Esto permite una fácil observación d....

Protocolo

Todos los protocolos descritos aquí siguen las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados anualmente por el comité de Cuidado Animal de la Universidad de Saint Mary's / Mount Saint Vincent University bajo los números de protocolo 20-14 y 21-12. Antes de llevar a cabo este protocolo, los usuarios deben asegurarse de que se sigan las directrices federales y provinciales sobre el uso de animales en la investigación o la enseñanza²³. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. ....

Resultados

Recientemente, este protocolo de cultivo a escala se utilizó para estudiar la homeostasis ósea¹¹. Las escamas pueden sobrevivir en el medio de cultivo durante al menos 2 días. Se analizó el número de células apoptóticas en cada día de cultivo, hasta un máximo de tres días, mediante el recuento de las células marcadas. Estos resultados mostraron que las células apoptóticas aumentaron significativamente en el tercer día de cultivo, lo que indica que el tiempo de cultivo debe limitarse a dos días uti.......

Discusión

Las escamas de pez cebra son un modelo in vitro de fácil acceso para estudiar una variedad de procesos biológicos diferentes que se pueden mantener hasta 2 días utilizando un método de cultivo y una incubadora para simular su entorno natural¹¹. Las básculas tienen una distribución regular y proporcional de las células presentes, lo que permite a los investigadores ver, contar y etiquetar las células y realizar experimentos sencillos de biología celular ut.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de 0,2 mL	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	Para la estabilización del pH y la preparación de PRS
Corredera cóncava	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	Para la visualización de núcleos celulares
Sal de diazonio (Fast Blue B)	Sigma	D9805	Para solución de sustrato AP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en polvo	Sigma	D5523	Para medios de cultivo a escala
3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (MS222)	Sigma	E10521	Para la preparación de suero fetal bovino MS222 al 0,1
%	Sigma	F4135	Para medios de cultivo a escala
Microscopio de fluorescencia	n/a	n/a
Ácido acético glacial	Pescador	A38 212	Para tampón de acetato
Glicerol	VWR	BDH1172-4LP	Para glicerol al 80% - básculas de almacenamiento
HEPES	ThermoFisher	15630106	Para los medios de cultivo a escala
Placa calefactora	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	Para la preparación de PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	Para la visualización de lisosomas
Ácido maleico	Sigma	M0375	Para tampón Tris-Maleato
Micropipeta	n/a	n/a
	Sigma	319937	Para solución de sustrato AP
N,N-dimetilformamida	Sigma	319937	para solución de sustrato enzimático
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	Para la preparación de PBS
NaCl	Sigma	S9888	Para la preparación de PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	para 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	Para la preparación de 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	Para la fijación de incrustaciones y la estabilización del pH
Napthol-AS-TR-fosfato	Sigma	N6125	Para la solución de sustrato AP
Napthol-AS-TR-fosfato	Sigma	N6125	para solución de sustrato enzimático
clorhidrato de pararosanilina	Sigma	P3750	para PRS
Penicilina-estreptomicina 5000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina/ml	ThermoFisher	15140122	Para los medios de cultivo a escala
Equipo de protección personal (EPP): guantes de nitrilo desechables, gafas de seguridad/gafas antisalpicaduras y bata de laboratorio.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	Para la fijación de incrustaciones
Acetato de sodio	Sigma	S2889	Para tampón de acetato
Microscopio compuesto estándar	n/a	n/a
Placa de agitación	n/a	n/a
Ácido tartárico	Sigma	T6521	Para tampón Tartrato
Tris base	Roche	03 118 142 001	Para tampón Tris-Maleate

N,N-dimetilformamida