Artículo de método

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 de enero de 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo ofrece un método para estudiar la dinámica celular utilizando una sencilla técnica de cultivo in vitro . Proporciona una oportunidad para que los investigadores y educadores del pez cebra estudien los procesos celulares, como los relacionados con la homeostasis ósea y la biología celular básica, mediante la visualización de núcleos fluorescentes y células apoptóticas dentro de las escamas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las escamas de pez cebra ofrecen una variedad de ventajas para su uso en laboratorios estándar con fines de enseñanza e investigación. Las escamas se recogen fácilmente sin necesidad de eutanasia, se regeneran en un par de semanas y son translúcidas y pequeñas, lo que permite observarlas con un microscopio estándar. Las escamas de pez cebra son especialmente útiles en entornos educativos, ya que brindan una oportunidad única para que los estudiantes participen en experiencias de aprendizaje práctico, particularmente en la comprensión de la dinámica celular y los métodos de cultivo in vitro . El objetivo principal de este protocolo es describir un método para recolectar y mantener escamas de pez cebra en cultivo para su uso en una variedad de estudios biológicos utilizando equipos básicos de laboratorio. Además, el protocolo detalla su uso en la comprensión de la homeostasis ósea mediante el examen de la actividad de las células óseas involucradas en la resorción y deposición ósea. También incluye protocolos adicionales para técnicas generales, como la visualización de núcleos y células apoptóticas. El protocolo de cultivo in vitro produce resultados fiables con un mínimo de reactivos y equipos. Este artículo analiza los beneficios del uso de cultivos in vitro de escamas de pez cebra para fomentar la investigación científica y describe los recursos necesarios para apoyar su integración en entornos educativos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los últimos años, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un valioso organismo modelo en diversos campos científicos, como la genética, la biología del desarrollo y la toxicología 1,2,3. El pez cebra es un pequeño pez tropical de agua dulce nativo de los ríos del sudeste asiático4. Se han convertido en un organismo modelo popular en biología debido a su fácil mantenimiento, pequeño tamaño, ciclo reproductivo rápido y embriones translúcidos. Esto permite una fácil observación de su desarrollo interno, lo que los hace ideales para estudiar diversos procesos biológicos en biología del desarrollo. El pez cebra comparte similitudes genéticas con los humanos; Aproximadamente el 70% de los genes humanos tienen al menos una contraparte del pez cebra, lo que los convierte en un excelente modelo para el estudio de trastornos genéticos y enfermedades en humanos 5,6. Al manipular genes específicos en el pez cebra, los investigadores pueden obtener información valiosa sobre la función y el comportamiento de los genes, que luego se puede aplicar a la investigación en salud humana6, la edición de genes y la creación de líneas transgénicas 7,8.

Las escamas del pez cebra se regeneran después de la extracción 9,10 y pueden cultivarse durante uno a tres días con una incubadora básica (sin CO2) mientras se utilizan para los experimentos11. El uso de escamas de pez cebra es ventajoso en los laboratorios básicos, ya que se pueden extraer de los peces anestesiados sin necesidad de eutanasia. Las escamas de pez cebra son un componente del esqueleto dérmico, que consta principalmente de dos capas: la capa interna, que es gruesa y está hecha de tejido parcialmente mineralizado formado por capas de fibrillas de colágeno, y la capa externa, que está altamente mineralizada y contiene una red de fibrillas de colágeno entretejidas 12,13 (Figura 1A-C). Estas características morfológicas y celulares de la escama se observan fácilmente bajo un microscopio compuesto estándar. Estas características hacen que las escamas de pez cebra sean un buen modelo para el estudio celular y molecular. Por ejemplo, las escamas de pez cebra se han utilizado para estudiar la homeostasis ósea, incluida la actividad de las células óseas11,12. También se han utilizado para comprender la regeneración de tejidos 9,14,15, las vías y señales génicas14,16, el metabolismo17, los estudios de microbiota18, etc. El pez cebra, al igual que otros teleósteos, también es muy sensible a factores ambientales como contaminantes y toxinas 19,20,21,22. Como tal, las escamas de pescado se utilizan para estudiar la exposición a toxinas en las poblaciones de peces. Estas características hacen que las básculas sean un excelente modelo para enseñar a los estudiantes sobre los impactos de los factores ambientales en los organismos vivos. Además, las escamas de líneas de peces cebra transgénicos, como Tg(osterix:mCherry) y Tg(runx2a:GFP), podrían añadir otro nivel de complejidad a los experimentos de los estudiantes.

En resumen, mediante el uso de escamas de pez cebra, los investigadores pueden diseñar y realizar experimentos para estudiar varios aspectos de la biología, desde los mecanismos celulares hasta los cambios ambientales. El pez cebra también es un recurso valioso en la educación superior, ya que puede proporcionar experiencias prácticas en diseño experimental, recopilación de datos y análisis. El pez cebra también se puede utilizar en cursos avanzados y programas centrados en la investigación para explorar áreas específicas de interés. Este artículo describe un protocolo para el uso de escamas de pez cebra en entornos de investigación y aprendizaje en el aula.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos descritos aquí siguen las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados anualmente por el comité de Cuidado Animal de la Universidad de Saint Mary's / Mount Saint Vincent University bajo los números de protocolo 20-14 y 21-12. Antes de llevar a cabo este protocolo, los usuarios deben asegurarse de que se sigan las directrices federales y provinciales sobre el uso de animales en la investigación o la enseñanza23. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos para el cultivo a escala

  1. Preparar el medio DMEM con HEPES (10 g de DMEM en polvo, 5,95 g de HEPES, en 1 L de agua destilada o dH2O, pH: 6,91), alícuota, y almacenar a 4 °C.
  2. Preparar el medio de cultivo - solución de trabajo (medio DMEM al 88% con HEPES, 10% suero fetal bovino y 2% de penicilina-estreptomicina [5000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina por mL] ajustado al volumen necesario el día de la realización del experimento.
    NOTA: La solución de trabajo debe prepararse fresca diariamente y no se puede almacenar. El medio de cultivo debe mantenerse frío (a 4 °C o con hielo) hasta su uso.
  3. Alícuota la solución de trabajo del medio de cultivo en los recipientes en los que se llevará a cabo el experimento. En este caso, se utilizaron tubos de 0,2 mL o una placa de 96 pocillos. Mantenga estas alícuotas en hielo hasta que sea necesario.
    NOTA: Esta solución debe prepararse fresca y no se puede almacenar durante más de 1 día. Consulte la Tabla 1 para ver todos los reactivos.

2. Quitar las escamas de los peces vivos

  1. Prepare un recipiente o tanque para el pez cebra con un volumen de agua de aproximadamente 2 L para 4-5 peces adultos.
    NOTA: Los parámetros típicos del agua que son apropiados para el pez cebra son pH 7,5, temperatura 28,5 °C, conductividad 640-781 μS y un ciclo de luz y oscuridad de 12-12 horas. Asegúrese de que la temperatura se mantenga constantemente en el tanque.
  2. Use una red de pesca para capturar 4-5 peces cebra adultos y colóquelos en el tanque de retención de pez cebra preparado anteriormente.
  3. Prepare un recipiente con al menos 60 mL de agua donde se anestesiará al pez.
    NOTA: Los peces deben poder moverse en el recipiente y ser lo suficientemente profundos para evitar que salten. Este recipiente debe contener metano-sulfonato de tricaína al 0,01% tamponado (MS222), que debe estar compuesto por agua de pez cebra (Diluido al 0,1% MS222, que se prepara con 0,3 g de MS222, 615 μL de NaOH 1 M en 300 mL de sistema de agua de pez cebra, diez veces).
    PRECAUCIÓN: Las personas que realicen estos experimentos deben contar con la aprobación de la junta institucional de ética animal para capturar, anestesiar y manipular peces cebra. De manera similar, el anestésico utilizado es una baja concentración de metano-sulfonato de tricaína (MS222), que es un producto químico comúnmente utilizado en la biología de los peces, pero que requiere un manejo adecuado, como equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes de nitrilo desechables, anteojos de seguridad/gafas antisalpicaduras y bata de laboratorio (consulte la hoja de datos de seguridad de MS222 para obtener más información).
  4. Prepare un recipiente de recuperación con las mismas especificaciones que se utilizaron anteriormente en el paso 1 (al menos 2 L de agua) donde se colocarán los peces después de la eliminación de las incrustaciones. Este recipiente debe tener suficiente espacio y los parámetros de agua correctos, como se indicó anteriormente.
  5. Con una red, transfiera con cuidado un solo pez cebra adulto al contenedor con 0.01% MS222. Espere hasta que el pez esté completamente inmóvil y tenga un movimiento opercular mínimo (esto generalmente toma menos de 10 minutos).
    NOTA: Todo este paso se lleva a cabo un pez a la vez. No anestesiar al siguiente pez hasta que las escamas se hayan retirado con éxito del pez que se está manipulando y hasta que el pez haya sido transferido al contenedor de recuperación.
  6. Coloque individualmente el pez cebra adulto en una placa de Petri invertida forrada con una toalla de papel húmeda.
  7. Bajo un microscopio estereoscópico de disección y usando pinzas finas, retire un máximo de 10-12 escamas de un pez individual. Las escamas se retiran de la región lateral del pez, donde las escamas son más grandes y tienen un tamaño más constante en comparación con las otras partes del cuerpo (Figura 2). Se pueden utilizar ambos lados del pescado.
    1. Retire las escamas una a la vez tirando suavemente en la dirección natural de la escama (es decir, en la dirección de anterior a posterior). Esto debe hacerse lo más rápido posible.
  8. Coloque cada escama individual en un tubo separado de 0,2 mL que contenga la solución de trabajo del medio de cultivo de incrustaciones (preparada en el paso 1.1) para evitar que las escamas se degraden. Se puede utilizar una placa de 96 pocillos como alternativa.
    NOTA: El aislamiento de las escalas individuales en tubos o pocillos separados evita que las escalas se peguen entre sí y permite el seguimiento de las escalas individuales que pueden ser necesarias para múltiples experimentos.
  9. Si el experimento específico requiere un tratamiento de escala, aplíquelo en este paso. Para ver ejemplos de algunos protocolos, consulte los pasos 4 y 5.
  10. Coloque los tubos con las básculas dentro de una incubadora a 28 °C. El medio de cultivo debe cambiarse cada 24 h (con la solución de trabajo del medio de cultivo). Se utilizó una incubadora sin CO2 para los experimentos descritos aquí.
  11. Después de quitar las escamas, regrese con cuidado el pez cebra al tanque de recuperación y monitoree hasta que se reanude el movimiento. Se utiliza una pipeta o piedra de aireación para proporcionar aire en el tanque para acelerar la recuperación.
  12. Una vez que se restablezca el movimiento, regrese el pez cebra a un tanque de cría regular. Recuerde mantener los peces que se usaron separados de cualquier otro pez para que puedan recuperarse por separado y para realizar un seguimiento de qué peces están regenerando activamente sus escamas.
  13. Espere ~ 2 semanas antes de repetir la eliminación de escamas de estos mismos peces. Esto les da tiempo para regenerar sus escamas de forma natural.

3. Fijación de escalas

  1. Lave las escamas tres veces con 200 μL de 1x de solución salina tamponada con fosfato (PBS) preparada a partir de 10x PBS (para 1 L, agregue 80 g de NaCl, 2 g de KCl y 11,2 g de Na2HPO4, agregue dH2O hasta 1 L).
  2. Retire el 1x PBS y agregue 200 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante la noche a 4 °C. Para 100 ml de PFA, agregue 4 g de paraformaldehído y 0,1 g de NaOH, luego agregue 1x PBS hasta 100 mL. Mezcle en una placa caliente a fuego lento y revuelva hasta que la solución esté clara, luego deje que la solución se enfríe y estabilice el pH a 7.4. Conservar a -20 °C. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 1).
  3. Después de la fijación, lavar las escamas tres veces con 200 μL de 1x PBS. Guarde las básculas a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: El PFA es perjudicial. Consulte la hoja de datos de seguridad para obtener más información. Todos estos procesos requieren un manejo adecuado, como el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes de nitrilo desechables, gafas de seguridad/gafas antisalpicaduras y una bata de laboratorio.

4. Homeostasis ósea

NOTA: A continuación se describen dos procedimientos de homeostasis ósea. La tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y fosfato alcalino (AP) se utilizan normalmente para identificar osteoclastos y osteoblastos activos, respectivamente. Los osteoclastos reabsorben la matriz ósea mientras que los osteoblastos depositan la matriz ósea. La AP es la principal enzima liberada por los osteoblastos durante la formación ósea, mientras que la TRAP es secretada por los osteoclastos en el espacio ácido entre el osteoclasto y la matriz ósea, ayudando en la descomposición y reabsorción ósea 24,25,26. Este protocolo también está disponible en The Zebrafish Information Network27y fue publicado anteriormente28. La fosfatasa alcalina es una enzima producida por múltiples tipos de células como parte del proceso metabólico. Este proceso no es totalmente específico de los osteoblastos, pero en el tejido óseo se utiliza como marcador de la función de los osteoblastos.

  1. Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP)
    1. Coloque cada báscula fija en un tubo de 0,2 ml o en una placa de 96 pocillos con 200 μL dedH2O. Lave las básculas añadiendo y quitando alrededor de 150 μL dedH2O durante 15 minutos tres veces. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 2).
    2. Retire las escamas del tubo o pocillo de 0,2 mL y colóquelas en un tubo nuevo que contenga 200 μL de tampón de tartrato de 50 mM. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
      1. Para 100 mM de tampón tartrato, prepare un recipiente de vidrio, agregue 2,3 g de ácido tartárico y mezcle con tampón de acetato 0,2 M (pH 5,5) hasta obtener 100 mL de solución. Remover bien y conservar a 4 °C. Para preparar 50 mM de tampón de tartrato, agregue volúmenes iguales de dH2O y 100 mM de tampón de tartrato. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 3 y Tabla 4).
    3. Retire el tampón de tartrato del tubo y añada 200 μL de solución de sustrato TRAP. Incubar las muestras durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras permanezcan en la oscuridad.
      1. Prepare un recipiente de vidrio oscuro y agregue 30 mL de tampón de tartrato de 100 mM, 1 mL de PRS hexazotizado (solución de clorhidrato de pararosanilina) y 2 mL de solución de sustrato enzimático. Revuelva bien.
        NOTA: Esta solución no se puede almacenar; Manténgalo en la oscuridad a temperatura ambiente mientras lo usa. Para conocer las soluciones necesarias para preparar la solución de sustrato TRAP, consulte el Archivo Suplementario 1 (Tablas 5-9).
    4. Retire la solución de sustrato TRAP y lave las escamas agregando y quitando alrededor de 150 μL de dH2O durante 15 min, tres veces.
    5. Retire las escamas del tubo y colóquelas en un tubo nuevo o pozo con 200 μL de glicerol al 80% (para 100 mL, mezcle 80 mL de glicerol con 20 mL de dH2O) envueltas en papel de aluminio para evitar la decoloración y guárdelas a 4 °C.
    6. Para visualizar las escamas bajo el microscopio, use un portaobjetos de depresión o cóncavo.
  2. Tinción de fosfato alcalino (AP)
    1. Coloque cada escala fija en un tubo de 0,2 mL o en una placa de 96 pocillos con 200 μL de dH2O y lávelos agregando y quitando alrededor de 150 μL de dH2O durante 15 minutos, tres veces. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 2).
    2. Retire las escamas de los tubos o pocillos de 0,2 ml y colóquelas en un tubo nuevo que contenga 200 μl de tampón tris-maleato e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
      1. Para este tampón, prepare un recipiente de vidrio y agregue 0,605 g de tampón tris y 0,55 g de ácido maleico. AñadirdH 2O hasta 25 mL y remover bien. Estabilizar a pH 8.3. Conservar a 4 °C. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 10).
    3. Retire el tampón de tris-maleato del tubo y agregue 200 μL de solución de sustrato AP. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras permanezcan en la oscuridad.
      1. Para esta solución, prepare un recipiente de vidrio oscuro, agregue 8 mg de sal de diazonio y mezcle con 0,1 mL de fosfato de naptol-AS-TR en N,N-dimetilformamida y 10 mL de tampón tris-maleato (pH 8,3), revuelva bien. Prepare esta solución fresca. Para más detalles, véase el Archivo Complementario 1 (Tabla 11).
    4. Retire la solución de sustrato AP y lave las escamas agregando y quitando 200 μL de dH2O durante 15 min, tres veces.
    5. Retire las escamas del tubo y colóquelas en un nuevo tubo o pozo con 200 μL de glicerol al 80% envuelto en papel de aluminio para evitar la decoloración. Conservar a 4 °C.
    6. Para visualizar las escamas con un microscopio, colóquelas en un portaobjetos cóncavo o de depresión.
      PRECAUCIÓN: La mayoría de los reactivos utilizados en la tinción TRAP y AP pueden ser perjudiciales. Consulte la hoja de datos de seguridad de cada producto químico. Todos estos procedimientos requieren un manejo adecuado, como equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes de nitrilo desechables, anteojos de seguridad/gafas protectoras contra salpicaduras y una bata de laboratorio.

5. Visualización de la dinámica celular en escamas de pez cebra

NOTA: Se puede utilizar una variedad de métodos de tinción para visualizar las diferencias entre las escalas y para etiquetar las celdas dentro de la escala (Figura 3B). Por ejemplo, a continuación se describen los métodos para teñir núcleos y lisosomas dentro de las células de la escala.

  1. Tinción de DAPI para la visualización de núcleos celulares
    NOTA: DAPI se utiliza para marcar los núcleos de todas las células marcando el ADN. DAPI es un marcador fluorescente que se une fuertemente a las regiones enriquecidas con adenina y timina en las secuencias de ADN.
    1. Antes de usar DAPI, asegúrese de que las incrustaciones estén fijadas en paraformaldehído al 4% (paso 3). Lave las escamas con 200 μL 1x PBS durante 5 minutos después de la fijación.
    2. Prepare una solución de trabajo DAPI en una dilución 1:10 de la siguiente manera. Mezcle 1 μL de DAPI con 9 μL de 1x PBS para obtener un volumen total de 10 μL.
    3. Después de preparar la solución de DAPI, use pinzas o una pipeta de plástico para colocar la escala en un portaobjetos cóncavo, elimine el exceso de PBS y agregue alrededor de 10 μL de la solución de DAPI preparada.
      NOTA: DAPI teñirá la escala inmediatamente, por lo que se puede visualizar utilizando un microscopio de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 352-402 nm y una longitud de onda de emisión de 417-477 nm. DAPI teñirá todos los núcleos celulares de un color azul brillante. Para ver toda la escala en el campo de visión, se utilizó el objetivo 4x. Los núcleos individuales teñidos son visibles con el objetivo 20x.
    4. Cuente el número de núcleos teñidos con DAPI para determinar el número de células en la escala.
  2. Tinción apoptótica para la visualización de la muerte celular en muestras vivas
    NOTA: Las tinciones fluorescentes se pueden usar para marcar las células apoptóticas. Por ejemplo, el protocolo de marcador de fluorescencia utilizado aquí es para ambientes ácidos y se puede utilizar para marcar y rastrear orgánulos ácidos como los lisosomas. Un aumento en el número de estos orgánulos se correlaciona con un aumento de la muerte celular. Este tinte debe aplicarse a las escamas no fijadas que estén recién arrancadas o que hayan sido cultivadas durante un máximo de 2 días.
    1. Prepare una solución de la tinción fluorescente para el seguimiento de la apoptosis de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el medio de cultivo como diluyente.
      NOTA: La concentración de la tinción fluorescente puede cambiar drásticamente dependiendo del método de apoptosis utilizado. Consulte el protocolo comercial de la tinción de elección para obtener detalles específicos sobre las concentraciones recomendadas.
    2. Retire con cuidado el medio de cultivo de cada tubo o pocillo de 0,2 ml de una placa de 96 pocillos si las escamas se cultivaron previamente.
    3. Agregue suficiente solución de tinción fluorescente para cubrir toda la escala (alrededor de 50 μL).
    4. Cubre todos los tubos con papel de aluminio para evitar que se desvanezcan y déjalos reposar durante 30 min.
    5. Retire la solución de tinción fluorescente de los tubos o pocillos.
    6. Lave las muestras añadiendo 200 μL de 1x PBS a los tubos o pocillos durante 5 min.
    7. Retire el PBS y agregue 200 μL de PFA al 4% a los tubos o pocillos para fijar las muestras durante 1 h a temperatura ambiente.
    8. Lave las muestras añadiendo 200 μL 1x PBS a los tubos o pocillos durante 5 min.
    9. Transfiera las básculas a un nuevo tubo o pocillo de 0,2 mL y agregue 200 μL de PBS fresco 1x. Cubra estos tubos/pocillos con papel de aluminio para evitar que se desvanezcan. Conservar a 4 °C.
    10. Para visualizar las escamas con un microscopio de fluorescencia, utilice un portaobjetos cóncavo o de depresión y el filtro correcto. La señal fluorescente utilizada aquí tiene una excitación y emisión máxima de 577-590 nm. La tinción fluorescente muestra células apoptóticas que contienen lisosomas en rojo.
    11. Cuente el número de células teñidas para determinar el número de células que experimentan apoptosis.
      NOTA: El papel de aluminio se utiliza durante la tinción y el almacenamiento para evitar la decoloración. Las muestras se pueden almacenar en la oscuridad durante un par de horas o incluso días, dependiendo de la tinción fluorescente que se utilice. Para almacenar muestras fluorescentes durante períodos más largos, utilice un protocolo de fijación y montaje que sea compatible con la tinción fluorescente. Todas las tinciones fluorescentes se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de al menos 20x. El filtro utilizado fue el siguiente: para DAPI 417-477 nm; para seguimiento de apoptosis 577-590 nm.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recientemente, este protocolo de cultivo a escala se utilizó para estudiar la homeostasis ósea11. Las escamas pueden sobrevivir en el medio de cultivo durante al menos 2 días. Se analizó el número de células apoptóticas en cada día de cultivo, hasta un máximo de tres días, mediante el recuento de las células marcadas. Estos resultados mostraron que las células apoptóticas aumentaron significativamente en el tercer día de cultivo, lo que indica que el tiempo de cultivo debe limitarse a dos días uti...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las escamas de pez cebra son un modelo in vitro de fácil acceso para estudiar una variedad de procesos biológicos diferentes que se pueden mantener hasta 2 días utilizando un método de cultivo y una incubadora para simular su entorno natural11. Las básculas tienen una distribución regular y proporcional de las células presentes, lo que permite a los investigadores ver, contar y etiquetar las células y realizar experimentos sencillos de biología celular ut...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al personal de las Instalaciones Acuáticas de la Universidad Mount Saint Vincent y a todos los miembros del laboratorio de Desarrollo Óseo Franz-Odendaal por proporcionar el cuidado necesario para los peces. Un agradecimiento específico a Alisha McNeil, Keely A. MacLellan y Shirine Jeradi por ayudar a optimizar algunos protocolos. Esta investigación fue financiada por la Agencia Espacial Canadiense (CSA) [19HLSRM01] y el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de 0,2 mLn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4Para la estabilización del pH y la preparación de PRS
Corredera cóncavan/an/a
DAPIVectashieldH-1200Para la visualización de núcleos celulares
Sal de diazonio (Fast Blue B)SigmaD9805Para solución de sustrato AP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en polvo Sigma D5523Para medios de cultivo a escala 
3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (MS222) Sigma E10521Para la preparación de suero fetal bovino MS222 al 0,1
% Sigma F4135Para medios de cultivo a escala 
Microscopio de fluorescencian/an/a
Ácido acético glacial Pescador A38 212Para tampón de acetato
GlicerolVWRBDH1172-4LPPara glicerol al 80% - básculas de almacenamiento
HEPES ThermoFisher 15630106Para los medios de cultivo a escala 
Placa calefactoran/an/a
KCl SigmaP217-10Para la preparación de PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Para la visualización de lisosomas 
Ácido maleicoSigmaM0375Para tampón Tris-Maleato 
Micropipetan/an/a
Sigma319937Para solución de sustrato AP
N,N-dimetilformamida Sigma319937para solución de sustrato enzimático
Na2HPO4 EMDSX0720-1Para la preparación de PBS
NaCl Sigma S9888Para la preparación de PBS
NaNO2SigmaS-2252para 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881Para la preparación de 4% PFA
NaOH Sigma S5881Para la fijación de incrustaciones y la estabilización del pH
Napthol-AS-TR-fosfatoSigmaN6125Para la solución de sustrato AP
Napthol-AS-TR-fosfato SigmaN6125para solución de sustrato enzimático
clorhidrato de pararosanilina  SigmaP3750para PRS
Penicilina-estreptomicina 5000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina/mlThermoFisher 15140122Para los medios de cultivo a escala 
Equipo de protección personal (EPP): guantes de nitrilo desechables, gafas de seguridad/gafas antisalpicaduras y bata de laboratorio.n/an/a
PFA Sigma P6148Para la fijación de incrustaciones
Acetato de sodio  Sigma S2889Para tampón de acetato
Microscopio compuesto estándarn/an/a
Placa de agitaciónn/an/a
Ácido tartáricoSigmaT6521Para tampón Tartrato
Tris baseRoche03 118 142 001Para tampón Tris-Maleate 
N,N-dimetilformamida

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Homeostasis seaactividad celular searecolecci n de escamasresorci n seadeposici n seamicroscopio estereosc picoperturbaci n ambiental

Artículos relacionados