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Carga cardíaca mediante presurización pasiva de la aurícula izquierda y poscarga pasiva para la evaluación del injerto

DOI:

10.3791/66624

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August 2nd, 2024

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1Division of Cardiac Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Shriners Children's Boston, 3VentriFlo Inc

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe un sistema de perfusión cardíaca ex vivo porcino en el que la carga directa del ventrículo izquierdo puede servir como técnica de evaluación de la salud del injerto y, al mismo tiempo, proporcionar una evaluación holística de la función del injerto. También se proporciona una discusión sobre el diseño del sistema y las posibles métricas de evaluación.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La perfusión en máquina ex vivo o perfusión en máquina normotérmica es un método de conservación que ha cobrado gran importancia en el campo de los trasplantes. A pesar de la inmensa oportunidad de evaluación debido al estado de latidos del corazón, la práctica clínica actual depende de tendencias metabólicas limitadas para la evaluación del injerto. Las mediciones hemodinámicas obtenidas a partir de la carga ventricular izquierda han atraído una atención significativa en el campo debido a su potencial como parámetros de evaluación objetiva. En efecto, este protocolo proporciona una manera fácil y efectiva de incorporar capacidades de carga a los sistemas de perfusión de Langendorff establecidos a través de la simple adición de un depósito adicional. Además, demuestra la viabilidad de emplear la presurización pasiva de la aurícula izquierda para la carga, un enfoque que, hasta donde sabemos, no se ha demostrado anteriormente. Este enfoque se complementa con una poscarga pasiva de la base Windkessel, que actúa como una cámara de distensibilidad para maximizar la perfusión miocárdica durante la diástole. Por último, destaca la capacidad de capturar métricas funcionales durante la carga cardíaca, incluida la presión del pulso ventricular izquierdo, la contractilidad y la relajación, para descubrir deficiencias en la función del injerto cardíaco después de períodos prolongados de tiempos de conservación (˃6 h).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trasplante cardíaco ortotópico es el estándar de oro actual para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal1. Desafortunadamente, el campo está significativamente limitado por una grave crisis de escasez de donantes, lo que resulta en solo 2,000 trasplantes de corazón que se realizan cada año, cuando más de 20,000 personas se beneficiarían deeste procedimiento que salva vidas. Se espera que esta escasez de órganos empeore, ya que se prevé que la prevalencia de la insuficiencia cardíaca solo en los Estados Unidos supere los 8 millones de personas para 20303. El aumento constante de los tiempos de supervivencia en lista de espera, como resultado de la mejora de la gestión médica, los avances en el soporte circulatorio mecánico y las modificaciones de la política de asignación de la UNOS, han dado lugar a un nuevo aumento en el número de pacientes que necesitan trasplante en un momento dado 4,5.

La perfusión en máquina ex vivo o perfusión normotérmica (NMP) es una modalidad de preservación que ha facilitado la expansión del pool de suministro al permitir el uso de órganos donados después de la muerte circulatoria (DCD) y al mismo tiempo lograr cierta extensión de los tiempos de preservación 5,6,7,8. A diferencia del almacenamiento en frío estático, el estándar de oro actual para la preservación, NMP mantiene los órganos en un estado metabólicamente activo, lo que crea la oportunidad para el monitoreo en tiempo real y la evaluación del injerto, convirtiéndose en el método de preservación estándar para los injertos DCD 8,9. Sin embargo, los dispositivos NMP utilizados clínicamente en la actualidad se limitan al modo de perfusión de Langendorff, que carece de métricas cuantitativas para predecir los resultados del trasplante y es incapaz de capturar los parámetros funcionales6. Por ejemplo, la acumulación de lactato durante la perfusión de Langendorff se ha denotado como el mejor predictor metabólico de los resultados postrasplante y actualmente se utiliza en el entorno clínico como un indicador de la salud del injerto cardíaco10. Sin embargo, a pesar de ser el mejor biomarcador de evaluación, no logra anticipar de manera confiable la necesidad de soporte circulatorio mecánico después del trasplante11,12. De manera similar, las capacidades predictivas de los parámetros hemodinámicos comúnmente utilizados (es decir, la presión aórtica y el flujo sanguíneo coronario) están limitadas en gran medida por la naturaleza retrógrada de las configuraciones actuales clínicamente utilizadas para la perfusión de la máquina cardíaca9.

El desarrollo de protocolos de evaluación para la determinación exacta y precisa de la salud del injerto cardíaco durante la NMP tendría un impacto inmenso en el campo más allá de mejorar los resultados posteriores al trasplante. Las herramientas predictivas objetivas permitirían la evaluación fiable y la probable utilización de órganos de criterio marginal o extendido (i.e., tiempos de isquemia prolongados cálidos (> 30 min) y fríos (> 6 h), aumento de la edad del donante (> 55 años), otras comorbilidades, etc.) de donantes tanto con DCD como con muerte encefálica (DBD) que actualmente están rechazados para trasplante debido a los estrictos criterios de selección13. Al permitir el uso de corazones marginales, la NMP podría facilitar un aumento en el suministro de órganos, ya que se estima que el trasplante exitoso de la mitad de los corazones que actualmente no se utilizan sería suficiente para eliminar la lista de espera cardíaca dentro de 2-3 años14. Las mediciones hemodinámicas obtenidas a partir de la carga ventricular izquierda durante la NMP han atraído una atención significativa en el campo debido a su potencial como parámetros de evaluación objetiva. Estudios previos han demostrado que estos parámetros, como la presión del pulso ventricular izquierdo, la contractilidad y la relajación, son más indicativos de la función del injerto cardíaco que las tendencias metabólicas 15,16,17.

En efecto, se han dedicado esfuerzos al desarrollo e identificación de métodos de carga óptimos para maximizar la precisión de la evaluación. A través de estos esfuerzos, otros grupos han identificado el modo más relevante de perfusión aórtica durante la carga, donde se observó una correlación más fuerte entre los parámetros hemodinámicos y la función post-trasplante cuando se implementó una poscarga pasiva (es decir, sin perfusión retrógrada a la aorta durante la carga) en comparación con la poscarga soportada por bomba (es decir, perfusión retrógrada a la aorta durante la carga)18. Esto indica que la perfusión coronaria asistida probablemente enmascara las deficiencias funcionales. Estudios previos han incorporado con éxito poscargas pasivas en configuraciones de perfusión mediante la implementación de sistemas que imitan el efecto Windkessel 18,19,20. El efecto Windkessel ayuda a amortiguar la fluctuación de la presión arterial, manteniendo el flujo sanguíneo continuo a los tejidos y mejorando la perfusión coronaria. Este protocolo logra la poscarga pasiva basada en Windkessel utilizando una bolsa intravenosa (IV) modificada encerrada en dos placas accionadas por resorte, donde la perfusión coronaria depende exclusivamente de la eyección del corazón (pendiente de patente).

El uso de la presurización pasiva de la aurícula izquierda (LA) (es decir, la presurización dependiente de la gravedad) durante la carga, aunque es una práctica común en las perfusiones cardíacas de animales pequeños, rara vez se utiliza en la carga de corazones grandes 21,22,23. En cambio, la gran mayoría de los métodos reportados en la literatura se basan en bombas secundarias para la presurización de LA 18,24,25,26,27,28. La presurización del LA a través de un depósito dependiente de la gravedad, en lugar de por bomba, simplifica significativamente la implementación de los protocolos de carga. El uso de la gravedad proporciona una fuente de presión fija y constante, lo que disminuye en gran medida la necesidad de sistemas de control complicados para lograr y mantener una presurización LA adecuada. Además, a través de este enfoque de presurización, se elimina la necesidad de una bomba secundaria, lo que facilita la incorporación de capacidades de carga en las configuraciones actuales de Langerdoff, ya que solo se necesita un depósito adicional. La integración de las capacidades de carga en los sistemas de perfusión de las máquinas clínicamente utilizados amplificaría la aplicación de los dispositivos NMP cardíacos al facilitar la evaluación detallada de los injertos cardíacos durante el período de preservación. En efecto, maximizar la utilidad de un sistema que representa un compromiso financiero significativo para el cuidado del paciente debido al transporte y la utilización de dispositivos29.

Este protocolo demuestra la factibilidad de emplear tanto la poscarga pasiva como la presurización pasiva de LA durante la carga ventricular izquierda. A través de la validación de la poscarga pasiva/presurización LA como método de carga, este protocolo también proporciona una manera fácil y efectiva de incorporar capacidades de carga en los sistemas de perfusión de Langendorff establecidos. Es importante destacar la capacidad de la evaluación funcional para descubrir diferencias entre los corazones viables y los que fallan después de períodos prolongados de preservación (˃6 h).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), el Hospital General de Massachusetts y las directrices de Jove para animales. Los corazones (170 - 250 g) se cosecharon de cerdos Yorkshire (30 - 35 kg, 3-4 meses de edad, sexo mixto) utilizando un modelo de donación después de la muerte encefálica y se perfundieron retrógradamente (Langendorff) durante 6 h antes de la carga. Todos los injertos fueron expuestos a un tiempo de isquemia fría de aproximadamente 1h durante la instrumentación.

1. Diseño del sistema

  1. Compruebe que el sistema esté compuesto por una cámara de órgano (11,046 pulgadas x 7,595 pulgadas x 3,095 pulgadas), dos depósitos (4 L y 1 L), un oxigenador de doble camisa y una bolsa Windkessel (WB). Compruebe que ambos depósitos contengan un antiespumante incorporado, que elimina la formación de espuma.
  2. Verifique que los componentes estén conectados de forma segura con tubos de silicona, con el depósito más pequeño, el WB, y la cámara del órgano en dos configuraciones diferentes (Figura 1A) dependiendo de la modalidad de perfusión (es decir, Langendorff frente a carga).
    1. Conecte la base de la cámara del órgano a la parte superior del depósito grande (venoso) usando un tubo de 3/8 de pulgada. Coloque el depósito grande debajo de la cámara del órgano para permitir que la gravedad haga circular la perfusión desde la cámara hasta el depósito.
    2. Conecte la parte inferior del depósito grande al puerto de entrada del cabezal de la bomba con un tubo de 3/8 de pulgada.
    3. Conecte el puerto de salida del cabezal de la bomba a un tubo de 3/8 de pulgada equipado con un reductor de 3/8 de pulgada a 1/4 de pulgada y un tubo de 1/4 de pulgada en el otro extremo. Conecte el 1/4 de pulgada al puerto de entrada del oxigenador.
    4. Coloque el puerto de salida del oxigenador con un tubo de 1/4 de pulgada con un conector Y en el extremo. Coloque ambos extremos del conector Y con un tubo de 1/4 de pulgada.
    5. Secuencia 1 - Patrón de flujo de perfusión durante la perfusión de Langendorff (línea discontinua azul en la Figura 1A)
      1. Coloque el primer extremo del conector Y con un expansor de 1/4 de pulgada a 3/8 de pulgada con una conexión luer integrada. Conecte el tubo de 3/8 de pulgada al primer puerto en la parte inferior del WB. Conecte una válvula luer de tres vías a la conexión luer en el expansor y utilícela para la administración de goteo de adenosina.
    6. Secuencia 2 - Perfusar el patrón de flujo durante la perfusión cargada (línea discontinua naranja en la Figura 1A)
      1. Conecte el segundo extremo del conector Y a la parte superior del depósito más pequeño (de carga). Conecte una abrazadera Hoffman a la tubería y utilícela para controlar el llenado del depósito.
      2. Coloque una línea de desbordamiento desde la parte superior del depósito de carga hasta el depósito más grande.
      3. Coloque la parte inferior del depósito de carga con un tubo de 1/4 de pulgada y conéctelo a un puerto en la base de la cámara del órgano. Agregue una válvula Luer de tres vías a la mitad de la longitud del tubo para la administración de adenosina y una válvula unidireccional justo antes de llegar a la cámara del órgano.
      4. Conecte el otro extremo del puerto de la cámara del órgano a una cánula en ángulo recto.
    7. Coloque la bolsa Windkessel (WB) directamente encima de la cámara del órgano. Coloque el segundo puerto de desbordamiento en la parte inferior del WB con un tubo de 3/8 de pulgada y conéctelo a cualquier puerto de entrada del depósito venoso. Coloque una pinza Hoffman y ciérrela completamente para detener el líquido a través de este puerto durante Langendorff y ajústela durante el modo cargado para modular las presiones aórticas.
    8. Conecte una válvula luer de tres vías al puerto de desbordamiento en la parte superior del WB y use un tubo de 1/4 de pulgada para conectar el WB a cualquier puerto de entrada en el depósito venoso. Conecte una abrazadera Hoffman al tubo de 1/4 de pulgada. Mantenga la pinza completamente cerrada durante la perfusión de Langendorff y ajústela durante el modo de carga para modular las presiones aórticas.
    9. Conecte el tercer puerto de salida del WB al puerto aórtico de la cámara del órgano a través del tubo de 3/8 de pulgada, con una interrupción en los 3/4 inferiores de la longitud para una sonda de temperatura.

2. Preparación del sistema de perfusión

  1. Prepare una base de perfusión compuesta por 0.96% de tampón Krebs-Henseleit, 9.915 mM de dextrano, 25 mM de bicarbonato de sodio, 1.054 mM de albúmina sérica bovina, 1% de estreptococo de pluma, 0.13% de insulina, 0.02% de hidrocortisona, 0.5% de heparina y 2.75 mM de cloruro de calcio. Lleve el volumen a 4 L con agua destilada.
  2. Configuración del sistema de perfusión
    1. Enjuague todos los tubos, componentes del sistema y depósitos con agua destilada y vuelva a conectarlos en la secuencia correcta (Figura 1A).
    2. Coloque la bolsa Windkessel entre dos placas acrílicas y apriétela con la configuración de resorte de tornillo (Figura complementaria 1).
    3. Conecte una válvula Luer de tres vías a la conexión Luer del puerto aórtico y el puerto auricular de la cámara del órgano (Figura 1B). Conecte dos sensores de presión a la caja del órgano, uno en la válvula conectada al puerto aórtico en la parte superior de la cámara del órgano, y otro en la válvula conectada al puerto auricular en la parte inferior de la cámara del órgano.
    4. Calibre los sensores de presión abriéndolos al aire (0 mmHg de presión) y ajustando esta lectura a 0 en el dispositivo de registro.
    5. Conecte dos sensores de flujo a la tubería del sistema. Conecte el sensor que mide el flujo aórtico al tubo de 3/8 de pulgada que conecta el WB con el puerto aórtico. Conecte el sensor que mide el flujo auricular a la tubería que conecta el depósito de carga con el puerto auricular.
    6. Conecte una sonda de temperatura al tubo de 3/8 de pulgada que conecta el WB al puerto aórtico. Conecte un tubo de desaireación al tercer puerto de la válvula conectado al puerto aórtico y manténgalo abierto en todo momento. Conecte el otro extremo de la línea a cualquier entrada del depósito venoso.
    7. Conecte el intercambiador de calor al oxigenador y ajústelo a 38 °C. Conecte la línea de oxígeno al 100% del puerto de entrada de gas del oxigenador. Encienda el oxígeno a 0,5 L/min.
  3. Cebado del sistema
    1. Agregue 2 L de perfusión al sistema usando la cámara del órgano. Encienda la bomba pulsátil y deje que el perfusto circule (saltándose el depósito de carga) hasta que la perfusión se oxigene a un mínimopO2 de 400 mmHg y la temperatura haya alcanzado ~35 °C.
    2. Deje que la perfusión circule y llene todos los componentes del sistema para eliminar el aire. Masajea los tubos que contengan los restos de burbujas de aire para eliminarlas. Luego, elimine el aire atrapado en el puerto aórtico aumentando la presión ocluyendo parcialmente el flujo de salida de líquido y aumentando el caudal de la bomba. Este aumento de presión forzará el aire a través del tubo de purga/desaireación.
    3. Dejar circular la perfusión hasta alcanzar la temperatura deseada (37 °C, controlada continuamente mediante una sonda de temperatura), realizar una primera evaluación de los parámetros bioquímicos para garantizar una correcta concentración de iones (Tabla 1) y una oxigenación adecuada.
      NOTA: Lea los niveles de iones y pH después de que la solución haya alcanzado la temperatura (37 °C) y se haya oxigenado correctamente.

3. Obtención de injerto cardíaco

  1. Sedar a los animales con una inyección intramuscular de atropina (0,04 mg/kg), telazol (4,4 mg/kg) y xilacina (2,2 mg/kg).
  2. Una vez sedados, transfiera a los animales al quirófano y obtenga acceso venoso mediante una vía intravenosa colocada en cualquiera de los oídos.
  3. Administrar un bolo de propofol (0,16-0,33 mg/kg) a través de la vía intravenosa y probar los estímulos nocivos 3 min después de la inyección. Si no hay reflejos, intubar al animal y mantener la anestesia mediante inhalación continua de isoflurano (3%-5%) y fentanilo intravenoso (5-20 μg/kg/h) según sea necesario.
  4. Una vez intubado, coloque un manguito de presión en cualquiera de las extremidades delanteras y conecte un sensor de electrocardiograma en el vértice del labio inferior para monitorear la saturación de oxígeno.
  5. Inicie un goteo de solución salina y adminístrelo a través de la vía intravenosa del oído. Coloque un paño quirúrgico sobre la cara ventral del animal.
  6. Administrar un bolo de citrato de fentanilo (5 μg/kg) por vía intravenosa en preparación para la esternotomía.
  7. Haga una incisión vertical entre la muesca esternal y el xifoides con un bisturí de 10 hojas (~25 cm). Después de la incisión, utilice un electrocauterio para dividir la grasa subcutánea y la fascia hasta llegar al esternón.
  8. Una vez expuesto, separar el pericardio adherido del esternón mediante una disección roma con los dedos en la cara caudal del esternón. Para ello, coloque el dedo en la cara dorsal del esternón y separe cualquier tejido adherente entre el esternón y las vísceras.
  9. Inserta un cincel en la cara caudal del esternón. Mientras aplicas fuerza hacia el cielo al cincel, usa un mazo para hacer avanzar el cincel a través del hueso esternal.
  10. Una vez completada la esternotomía mediana, determinada por la separación completa del esternón (desde el xifoides hasta la escotadura esternal), se coloca un retractor esternal y se abre hasta la exposición completa.
  11. Incidir el pericardio cranealmente con unas tijeras de Metzenbaum hasta que la aorta y la arteria pulmonar sean visibles.
  12. Coloque dos suturas de cuerda de bolsa (4-0 Prolene) en la aorta y asegúrelas con una trampa de torniquete. Tenga cuidado de que las suturas atraviesen la capa media de la aorta, pero no a través de la luz. Las suturas superficiales no lograrán mantener la cánula de la raíz aórtica en su lugar, y las suturas profundas harán que la aorta sangre.
  13. Administrar un bolo de heparina (100 U/kg) por vía intravenosa y dejar circular durante 3 min.
  14. Inserte una cánula de raíz aórtica 9F perpendicular a la aorta entre las suturas del cordón y asegúrela apretando suavemente el lazo del torniquete. Asegúrese de que no haya fugas alrededor del sitio de canulación. Permita que la línea de cardioplejia de la cánula de la raíz aórtica se desairee permitiendo que la sangre fluya desde la aorta.
  15. Conecte una bolsa de solución cardiopléjica a la conexión Luer Lock. Presurice la bolsa de cardioplejia con una bolsa de presión para obtener 80 mmHg durante el lavado. Conecte una bomba peristáltica a la segunda línea de la cánula de la raíz aórtica y utilícela para extraer 1 L de sangre directamente de la aorta.
  16. Separe los glóbulos rojos con un dispositivo de recuperación de sangre (los glóbulos rojos se centrifugan y se lavan con solución salina). Agregue glóbulos rojos al sistema de perfusión después de que haya alcanzado la temperatura deseada.
  17. Una vez que se haya recolectado suficiente sangre, utilice una cruz transtorácica para pinzar la aorta y abrir la línea de cardioplejia para enjuagar el órgano.
  18. Inmediatamente después del inicio de la pinza cruzada y el enjuague, ventile el corazón a través de una incisión de 5 cm en el apéndice auricular izquierdo y cortando completamente la vena cava inferior. Agregue hielo a la cavidad torácica en este momento para ayudar a reducir la temperatura del órgano.
  19. Después de una ventilación exitosa, corte o ate la vena cava superior para evitar que la sangre caliente de la cabeza llegue al corazón enfriado.
  20. Una vez que el corazón se haya lavado con 1 litro de solución para cardioplejia, divida los grandes vasos, incluida la aorta, la arteria pulmonar principal, las venas cavas superior e inferior y las venas pulmonares bilaterales. Esto completa el explante cardíaco. Retira el corazón de la cavidad.
    NOTA: Mantenga la mayor longitud posible de los grandes vasos unidos al injerto. Corta las venas pulmonares lo más cerca posible de los pulmones.
  21. Envuelva el órgano en una esponja de laparotomía y colóquelo sobre hielo.

4. Preparación del injerto

  1. Corta las ramas del arco aórtico para crear un tracto de salida. Inserte la cánula aórtica a través de este tracto y asegúrela con una brida y una sutura de seda 4-0 (Figura 2).
  2. Colocar un alambre de estimulación bipolar en la pared posterior del ventrículo derecho. Corta las venas pulmonares para formar un solo tracto de entrada en la aurícula izquierda.
  3. Cree dos suturas de prolina 4-0 con cuerdas de bolsa a través del perímetro del tracto de la aurícula izquierda. Asegure las suturas con asas de torniquete y déjelas desatadas hasta que se carguen.
  4. Cierre el apéndice de la aurícula izquierda con una sutura continua simple (4-0 Prolene). Registre el peso cardíaco inicial.

5. Reactivación del injerto cardíaco

  1. Sujete el tubo de 3/8 de pulgada justo antes del puerto aórtico para detener el flujo de perfusión. Coloque el corazón con la pared posterior mirando hacia el operador. Inclina la cámara del órgano aproximadamente 20°.
    NOTA: Esta posición de la perfusión del injerto se elige para aumentar el drenaje pasivo y es consistente con los datos publicados anteriormente que demuestran una mejora significativa en la función en comparación con la suspensión26.
  2. Coloque la cánula aórtica en un ángulo de 90° con respecto al puerto aórtico y suelte lentamente la línea aórtica. Desairear la cánula aórtica mediante el flujo progresivo de perfusión en ella.
  3. Disminuya lentamente el ángulo de la cánula aórtica hasta que esté en línea con el puerto aórtico y completamente conectada a la línea aórtica.
  4. Una vez que esté completamente conectado, masajee suavemente el corazón de forma intermitente para evitar la distensión debida al llenado del ventrículo izquierdo. Durante este período, ventile el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda abierta.
  5. Concomitantemente, controle las presiones aórticas y manténgalas dentro del rango aceptable (30 - 40 mmHg).
  6. Inicie la adquisición de datos e inicie el goteo de adenosina a una velocidad de 333 uL/min
    NOTA: La adenosina (2 mg/mL) se añade al protocolo de perfusión para imitar las condiciones actuales de perfusión clínica. Sin embargo, es importante señalar que la vasodilatación asociada puede exacerbar el edema de órganos no deseados 30,31,32.
  7. Conecte los cables de estimulación a la caja de estimulación y configúrela a 60 bpm como estimulación de respaldo.
  8. Si hay fibrilación, desfibrilar el corazón con paletas con 30 J. Administrar tantas descargas como sea necesario hasta lograr contracciones rítmicas.
  9. Una vez que haya un ritmo organizado (acelerado o intrínseco), suspenda la ventilación manual y coloque los cables del electrocardiograma directamente en el corazón con agujas de gancho.
  10. Apriete los tornillos de la bolsa Windkessel hasta que la forma de onda mostrada por el sensor de presión aórtica imite una onda sinusoidal. Perfundir el corazón en configuración de Langendorff durante 6 h como se ha descrito anteriormente33.

6. Carga del injerto cardíaco

  1. Conecte la cánula de ángulo recto al puerto auricular de la cámara del órgano. Una vez conectada, sujete la cánula y permita que el fluido entre en el depósito de carga soltando la abrazadera Hoffman en la línea entre el oxigenador y el depósito de carga.
  2. Llene el depósito de carga hasta que la presión alcance los 15 - 20 mmHg. Aumente la producción de la bomba para mantener la presión aórtica y auricular.
  3. Inserte la mitad de la punta metálica en ángulo recto en la aurícula izquierda con la punta apuntando hacia el apéndice. Esta ubicación promueve de manera más consistente la competencia con la válvula mitral.
  4. Inserte el sensor de presión dentro del ventrículo izquierdo para registrar la presión ventricular izquierda. Suelte la pinza de la cánula y deje que la aurícula izquierda se llene.
  5. Una vez desaireado, utilice las suturas y las trampas de torniquete previamente colocadas para cerrar completamente la abertura de la aurícula izquierda. Ajuste la cánula y los asas según sea necesario para minimizar las fugas de líquido.
  6. Después de asegurar la cánula en la aurícula izquierda, detenga completamente la perfusión retrógrada a la aorta sujetando la línea desde el oxigenador hasta el WB.
  7. Mueva el goteo de adenosina desde la línea que conduce al WB hasta la línea entre el depósito de carga y el puerto auricular.

7. Fin de la perfusión

  1. Registre las lecturas bioquímicas, la frecuencia cardíaca, el flujo aórtico/auricular y las presiones cada 30 minutos durante la duración del experimento (10 h). Obtenga lecturas bioquímicas de la vía auricular para la medición del flujo de entrada y directamente de la arteria pulmonar para las lecturas de flujo de salida.
  2. Al final de la perfusión, detenga la adquisición de datos, extraiga el corazón y deséchelo.
  3. Movilice las partes no fijas del sistema a un fregadero grande, desmonte, enjuague y limpie con abundante agua.
  4. Una vez que no haya restos de sangre visibles en los componentes, vuelva a ensamblar el sistema. Agregue grandes cantidades de agua al sistema a través de la cámara del órgano y aproximadamente 100 ml de detergente alcalino líquido para que circule con el agua.
  5. Una vez que el detergente se haya mezclado bien con el agua, sujete las líneas del sistema para mantener todos los depósitos llenos con la solución de detergente.
  6. Desconecte el oxigenador del resto del sistema y enjuague una vez más con agua para eliminar todo el jabón.
  7. Una vez que el jabón se haya eliminado por completo, seque el oxigenador lanzando aire a través de la entrada de líquido a la velocidad más alta posible.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los corazones de 4 cerdos Yorkshire (30 - 35 kg) se cosecharon y conservaron a través de Langendorff NMP durante 6 h antes de 4 h de carga continua. Se eligió esta condición experimental debido a que 6 h es el tiempo promedio de conservación clínica (5,1 ± 0,7 h)34. A través de la adición de 4 horas adicionales de carga continua (total de 10 h de tiempo ex vivo ), se esperaba algún grado de insuficiencia cardíaca, ya que previamente se había reportado una clara correlación entre el tiempo de perfusión y la disminución de la función miocárdica35. Como tal, esto brindó la oportunidad de destacar la importancia de las métricas funcionales para la evaluación del injerto y su capacidad para discernir corazones viables frente a corazones fallidos. En este sentido, la mayoría de las métricas basadas en Langendorff no indicaron diferencias perceptibles en la viabilidad entre los injertos cardíacos, ya que la resistencia vascular (CVR, Figura 2C), la tasa de absorción de oxígeno (OUR, Figura 2D), la acumulación de lactato (Figura 2E), el consumo de glucosa (Figura 2F) y la acumulación de potasio (Figura 2G) no fueron estadísticamente diferentes durante todo el tiempo de perfusión. Del mismo modo, no se observaron diferencias en el peso ganado por los injertos (Figura 2H). Sin embargo, se observó una disminución constante de la frecuencia cardíaca en los injertos fallidos después de 2 h de tiempo de carga (Figura 2A), siendo el área bajo la curva no estadísticamente diferente hasta las 3 h de perfusión (Figura 2B). Además, las métricas dependientes de la carga que se presentan en la Figura 3 sugirieron una pérdida de la función cardíaca a los 30 minutos del tiempo de carga, siendo la medida de la contractilidad (dP/dtmáx.) la primera métrica que indica la pérdida de la función (Figura 3C). De manera similar a la frecuencia cardíaca, se observó una disminución constante de la presión del pulso en el ventrículo izquierdo (Figura 3A) después de 2 h de perfusión cargada, con diferencias estadísticamente significativas entre la presión del pulso de los injertos (Figura 3B) y la relajación (dP/dtmin, Figura 3D) después de 1,5 h de perfusión.

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Figura 1: Configuración del sistema de perfusión. (A) Configuración de perfusión. Las líneas negras indican el flujo de perfusión durante ambas modalidades de perfusión. La línea discontinua azul indica el flujo de perfusión solo durante la perfusión de Langendorff, y las líneas naranjas indican el flujo de perfusión durante la perfusión de carga. (B) Ubicación de los sensores de presión aórtica (línea continua) y auricular (línea discontinua). Dado que el sensor de presión auricular está ubicado espacialmente debajo de la aurícula, se tuvo en cuenta la diferencia de altura para una presurización adecuada de LA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Métricas de evaluación convencionales. Las métricas se denotan como convencionales si su adquisición es posible durante la perfusión de Langendorff. (A) La frecuencia cardíaca se calculó a partir de las ondas de presión obtenidas utilizando el sensor de presión intraventricular izquierdo. Sin embargo, como esta métrica se puede calcular fácilmente a partir de las trazas de electrocardiograma, también disponibles durante Langendorff, se considera una métrica convencional. La línea continua es la mediana y la región sombreada es el rango intercuartílico (IQR). (B) Área bajo la curva (AUC) de los datos de frecuencia cardíaca por cada 30 min de tiempo de perfusión. (C) Resistencia vascular (RCV) de los injertos. (D) Tasa de absorción de oxígeno (OUR). E) Acumulación de lactato. (F) Consumo de glucosa. (G) Acumulación de potasio. (H) Porcentaje de aumento de peso como indicador del edema. Todos los datos se expresan como mediana ± rango intercuartílico (RIC, n = 4). Medidas repetidas: ANOVA de dos vías y análisis post-hoc HSD de Tukey-Kramer sobre medias de mínimos cuadrados estándar. * = p <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Métricas de evaluación no convencionales. Las métricas se denotan como no convencionales cuando su adquisición solo es posible durante la perfusión cargada. (A) Presión de pulso del ventrículo izquierdo (VI) trazada a lo largo del tiempo. La línea continua es la mediana y la región sombreada es el IQR. (B) El área bajo la curva (AUC) de la presión de pulso del VI por cada 30 min de tiempo de perfusión. (C) El AUC de la contractilidad cardíaca se obtuvo a partir de la derivada máxima de la presión de pulso del VI por cada 30 min de perfusión. (D) El AUC de relajación cardíaca se obtuvo a partir de la derivada mínima de la presión de pulso del VI durante 30 min de tiempo de perfusión. Todos los datos se expresan como mediana ± rango intercuartílico (RIC, n = 4). Medidas repetidas: ANOVA de dos vías y análisis post-hoc HSD de Tukey-Kramer sobre medias de mínimos cuadrados estándar. * = p <0,01, ** = p <0,05, *** = p < 0,001, **** = p <0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

IonConcentración (mmol/L) 
Na+ 135-145
K + 3.5-6.0
Ca +2 1.0-1.3
Cl - 96-106

Tabla 1: Rango aceptable de concentraciones de iones en el perfusato.

Figura complementaria 1: Configuración del sistema de perfusión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La máquina de perfusión normotérmica es una poderosa modalidad para la preservación y evaluación de órganos que ha tenido un gran impacto en el campo del trasplante cardíaco al ampliar el grupo de donantes de corazones adultos36. Esta expansión es el resultado de la capacidad de utilizar actualmente un pequeño grupo de corazones que anteriormente se consideraban inadecuados para el trasplante. La máquina de perfusión normotérmica conserva los injertos cardíacos en un estado de latido, lo que ofrece la oportunidad de realizar evaluaciones funcionales y metabólicas. Sin embargo, a pesar de su potencial, la aplicación actual de la NMP sigue estando restringida a un subconjunto limitado de órganos marginales (es decir, órganos donados después de la muerte circulatoria con < 30 minutos de isquemia caliente de donantes < 55 años de edad y sin comorbilidades). Esta limitación se debe a la falta de técnicas de evaluación exactas y precisas, que dificultan la evaluación fiable de una gama más amplia de corazones marginales.

La carga ventricular izquierda durante la NMP se ha convertido en una técnica de evaluación prometedora, ya que los parámetros hemodinámicos obtenidos durante la carga pueden estar altamente correlacionados con los resultados postrasplante 15,16,18. En efecto, la incorporación de la carga cardíaca durante la NMP como técnica de evaluación podría facilitar la evaluación y la probable utilización de órganos con criterios extendidos, ampliando aún más el grupo de donantes. A pesar del inmenso impacto potencial, las capacidades de carga no están disponibles actualmente en los sistemas clínicos NMP37. Para simplificar y estandarizar la incorporación de capacidades de carga en los sistemas NMP establecidos, este protocolo demuestra la viabilidad de la presurización pasiva de la aurícula izquierda (LA) (es decir, la presurización dependiente de la gravedad), un enfoque que rara vez se utiliza en la perfusión cardíaca grande. Este método de presurización elimina la necesidad de bombas secundarias, lo que simplifica significativamente la implementación de la carga cardíaca. Sin embargo, dado que la gravedad es el principal determinante de la presión de la AI, el conocimiento de la ubicación espacial del depósito de carga y el sensor de presión que lo acompaña (sensor de presión auricular) es fundamental para el éxito de la carga cardíaca. Se debe tener mucho cuidado para tener en cuenta las diferencias de presión inducidas por la altura, ya que tanto la sobrepresurización como la subpresurización del LA dan como resultado condiciones de carga subóptimas y pueden conducir al fracaso del injerto a través de diferentes mecanismos.

La exposición de la AI a presiones anormalmente altas da lugar a presiones de llenado cardíacas elevadas (es decir, apertura de la válvula mitral antes de la relajación completa del ventrículo izquierdo), un fenómeno conocido por causar daño al injerto cardíaco y mal pronóstico38. Además, y menos evidentes, las altas presiones exponen a la AI a estiramientos no fisiológicos, lo que conduce a una mecanomodulación anormal y a un aumento potencial en la secreción de péptidos natriuréticos auriculares (ANPs)39. Tanto la mecanomodulación como las ANPs son causas conocidas de la fibrilación auricular 40,41. Por otro lado, las presiones no fisiológicamente bajas de la aurícula izquierda pueden dar lugar a un llenado inadecuado del ventrículo izquierdo durante la diástole, lo que conduce a una disminución del gasto cardíaco. Dado que este protocolo utiliza una poscarga pasiva (es decir, sin perfusión retrógrada a la aorta durante la carga con una dependencia completa del flujo sanguíneo coronario de la perfusión anterógrada del ventrículo izquierdo), la disminución del gasto cardíaco puede dar lugar a una reducción de la perfusión miocárdica y a una isquemia relativa. La presurización excesiva o insuficiente del LA también puede ocurrir durante el proceso de carga, por lo que es fundamental llenar previamente el depósito de carga y verificar cuidadosamente su presión antes de cerrar el atrio alrededor de la cánula de carga. La presurización auricular incorrecta es la fuente más probable de lesión del injerto dependiente de la técnica. También fue la sección más difícil de ejecutar correctamente, con numerosas iteraciones que se llevaron a cabo para determinar la secuencia de mejor rendimiento y el tamaño ideal de la cánula de carga.

Otro elemento particularmente importante para el éxito y la relevancia del protocolo es el uso de una poscarga pasiva que imita el efecto Windkessel observado en la circulación in vivo. En condiciones fisiológicas, el efecto Windkessel se refiere a la capacidad de las grandes arterias centrales, en particular la aorta, para actuar como reservorio durante la sístole y como conducto durante la diástole. Durante la sístole, las paredes elásticas de la aorta se expanden para acomodar un aumento en el volumen sanguíneo42. Esta sangre almacenada se libera gradualmente durante la diástole, ayudada por el retroceso elástico de las paredes arteriales. Este mecanismo reduce la variabilidad temporal del flujo sanguíneo, asegurando una perfusión orgánica algo continua43. Esto es especialmente importante para el corazónya que 43 a diferencia de otros órganos, la perfusión del miocardio ocurre casi exclusivamente durante la diástole44. Como tal, la incorporación del efecto Windkessel en los sistemas de perfusión ex vivo proporciona una fuente más fisiológica de perfusión coronaria, beneficiosa tanto en el modo de perfusión retrógrado como en el de perfusión cargada. Además, la implementación de este sistema en la perfusión cargada con fines de evaluación parece aumentar las capacidades predictivas con el rendimiento cardíaco de los injertos perfundidos con poscarga basada en Windkessel correlacionándose más fuertemente con los resultados posteriores al trasplante, como se muestra en otros18. El efecto Windkessel en esta configuración se logra utilizando una bolsa IV modificada encerrada entre dos placas acrílicas conectadas a través de un resorte atornillado (Figura suplementaria 1), un sistema relativamente más simple que otros aparatos Windkessel reportados 18,19,20. Además, la capacidad de apretar o desapretar el resorte de carga proporcionó un inmenso control sobre la presión de retroceso, lo que facilitó el ajuste fino de los ajustes experimentales.

Con nuestro sistema, el método de perfusión se puede alternar fácilmente entre el modo Langendorff y el modo cargado. El modo cargado permitió la adquisición de datos funcionales del ventrículo izquierdo de los injertos (es decir, presión del pulso del ventrículo izquierdo, contractilidad, relajación, Figura 3). Estos datos funcionales revelaron una clara diferencia en la viabilidad del injerto que no era evidente en las tendencias bioquímicas (Figura 2), incluyendo el lactato (Figura 2B), el estándar clínico para la evaluación del injerto cardíaco en sistemas de perfusión ex vivo 10. Además, la perfusión en modo cargado, tal como se describe en este protocolo, permite la posibilidad de medir el gasto cardíaco (CO = frecuencia cardíaca * volumen sistólico), proporcionando una métrica adicional y más convencional de la función cardíaca45,46. El volumen sistólico, la variable más difícil de adquirir a partir de la configuración actual, podría obtenerse cuantificando el flujo coronario, que, junto con el flujo auricular y aórtico, se puede utilizar para calcular los volúmenes diastólico y telesistólico. Del mismo modo, el volumen sistólico se puede obtener mediante mediciones de ecocardiograma o bucles de presión-volumen. Es importante destacar que esta configuración solo es capaz de cargar el lado izquierdo del corazón, lo que da como resultado datos funcionales del ventrículo izquierdo. Este método no proporciona información sobre la función ventricular derecha. Esta es probablemente la mayor limitación del protocolo actual, particularmente porque la disfunción ventricular derecha es una ocurrencia más común en los trasplantados que en la disfunción ventricular izquierda47. Sin embargo, se ha reportado que la disfunción ventricular derecha se resuelve después de un par de semanas después del trasplante, tal vez despriorizando su importancia47.

Cabe destacar que los cuatro injertos presentados en los resultados de este manuscrito se obtuvieron y perfundieron utilizando Langendorff durante 6 h exactamente de la misma manera. Se seleccionó esta condición experimental ya que 6 h es la duración promedio de la conservación de los injertos normotérmicos perfundidos con máquina, y se esperaba que la adición de 4 h adicionales de carga continua (un total de 10 h de tiempo ex vivo ) resultara en algún grado de fracaso del injerto. Este fracaso esperado brindó la oportunidad de resaltar la necesidad de métricas funcionales y demostró su capacidad de evaluación en comparación con las métricas basadas en Langendorff. De hecho, los resultados de este manuscrito demuestran la capacidad de algunos parámetros funcionales adquiridos a través de la presurización pasiva de LA y la carga pasiva de poscarga para desenmascarar las diferencias de viabilidad de los injertos cardíacos de DBD con tiempos de conservación prolongados. Aunque no se ha demostrado aquí, es razonable suponer que la efectividad de esta evaluación puede replicarse para determinar la viabilidad de injertos con otras lesiones y/o deficiencias funcionales conocidas (es decir, DCD, donantes mayores, comorbilidades), pero se requiere más investigación para determinar las características funcionales y las diferencias dentro de estos injertos. Del mismo modo, también se requiere más trabajo para determinar cómo las métricas funcionales se correlacionan con los injertos cardíacos trasplantables frente a los no trasplantables, así como otras posibles fuentes de índices de viabilidad. Por ejemplo, la diferencia entre las presiones de carga aórtica y auricular puede ser un índice de viabilidad fiable, ya que la diferencia entre estas lecturas de presión puede indicar una ausencia o presencia de shock cardiogénico48.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DV es empleado y fundador de VentriFlo, Inc., Pelham, NH, y tiene solicitudes de patentes relevantes para este estudio. Para obtener más información, consulte https://ventriflo.com/patents/. SNT tiene solicitudes de patentes relevantes para este estudio y forma parte del Consejo Asesor Científico de Sylvatica Biotech Inc., una empresa centrada en el desarrollo de tecnología de preservación de órganos. Todos los intereses contrapuestos son administrados por MGH y Partners HealthCare de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. AR y AAO reciben fondos de investigación de Paragonix Technologies Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos la financiación de SNT por parte del Instituto Nacional de Salud de EE. UU. (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R01DK134590; R24OD034189), la Fundación Nacional para la Ciencia, en virtud de la subvención No. EEC 1941543, el Premio Claflin Distinguished Scholar en nombre del Comité Ejecutivo de Investigación del MGH y el Premio de la Familia Polsky para Líderes en Cirugía. Reconocemos la financiación de la investigación a la AAO por parte de la Fundación de la Familia Hassenfeld, el Comité Ejecutivo de Investigación de MGH y el Centro para la Diversidad y la Inclusión de MGH. Agradecemos la financiación de la investigación a GO por parte de la Fundación de Investigación Cardiovascular Sarnoff.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Llave de paso de 4 vías Smiths Medical 
4-0 Suturas Prolene Ethicon 8711
5-0 SuturaFine Scientific Tools18020-50
Conector Aórtico VentriFLO Inc 
Cánula de raíz aórticaMedtronic Inc 10012
Albúmina sérica bovinaSigmaA7906
Cloruro de calcioSigmaC7902
Protector de células Medtronic Inc ATLG
Cell Saver Medtronic Inc ATLS00
DextranSigma31389
electrodos epicárdicos para electrocardiograma VentriFLO Inc de equipos hechos a medida
 VentriFLO Inc Marcapasos externo hecho a medida
 Medtronic Inc 5392
Tubos cónicos Falcon High Clarity 50mLFisher Scientific14-432-22
Sondas de flujo Sistemas TranSonic inc 1828
Inyección de heparina sódicaMedplusG-0409-2720-0409-2721
Oxigenador de fibra hueca y venoso  ReseviorMedtronic Inc BBP241Affinity Pixie, 1L
HTP 1500  Bomba de terapia de calorHTP6826619
insulinaHumulin RMGH Farmacia
Iworx Sistema de adquisición de datos IworxIworxIX-RA-834
Krebs-Henseleit BufferSigmaK3753
Filtro de leucocitosHaemoneticsSB1E
Cámara de órganosVentriFLO Inc hechos a medida
BiopolarMedtronic Inc 6495
Penicilina-estreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
Trasnductores de presión IworxBP100
Bomba pulsátilVentriFLO Inc 2100-0270
Tubería de PVC Medtronic Inc 
Cánula de punta metálica en ángulo recto 20FMedtronic Inc 67318
Bicarobonato de sodioSigma5761
Estándar PHD ULTRA CP Bomba de jeringaHarvard Aparatus88-3015
Kit de torniquete 7 pulgadas;Medtronic Inc 79006
Caja de flujo transónicaTranSonic Sytems Inc T402
Resarcimiento venoso Medtronic Inc CB841Affinity Fusion, 4L
WIndKessel BolsaVentriFLO Inc Adaptador Y hecho a medida
Medtronic Inc 10005
MX9341L hecha a medida Cartuchos Soporte y soportes Cables de estimulación HY10Z49R9

References

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