Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.
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Artículo de método
Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas
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En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema de Síntesis de Proteínas Libres de Células (CFPS) se ha empleado ampliamente para facilitar el ensamblaje ascendente de células sintéticas. Sirve como anfitrión para la maquinaria central del Dogma Central, erigiéndose como un chasis óptimo para la integración y el ensamblaje de diversos sistemas de mimetismo celular artificial. A pesar de su uso frecuente en la fabricación de células sintéticas, el establecimiento de un sistema CFPS robusto y adaptado para una aplicación específica sigue siendo un reto no trivial. En este artículo de métodos, presentamos un protocolo completo para el sistema CFPS, empleado rutinariamente en la construcción de células sintéticas. Este protocolo abarca etapas clave en la preparación del sistema CFPS, incluido el extracto celular, la preparación de plantillas y la optimización de la expresión de rutina utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, mostramos resultados representativos al encapsular el sistema CFPS dentro de varios microcompartimentos, como gotas monocapa, vesículas de doble emulsión y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Finalmente, dilucidamos los pasos críticos y las condiciones necesarias para el ensamblaje exitoso de estos sistemas CFPS en distintos entornos. Esperamos que nuestro enfoque facilite el establecimiento de buenas prácticas de trabajo entre varios laboratorios dentro de la comunidad de células sintéticas en continua expansión, acelerando así el progreso en el campo del desarrollo de células sintéticas.
Introducción
La síntesis de células sintéticas o artificiales se ha convertido en un campo muy destacado de investigación interdisciplinaria, que atrae un interés sustancial de los científicos de todos los dominios de la biología sintética, la química y la biofísica. Estos científicos están unidos por el objetivo común de construir una célula viva mínima 1,2,3. El rápido crecimiento de este campo ha ido en sintonía con avances significativos en tecnologías críticas, como la manipulación del ADN recombinante4, los materiales biomimé....
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Protocolo
1. Preparación del extracto
- Pasar la cepa de E. coli BL21 (DE3) de un caldo de glicerol a una placa de agar Luria Bertani (LB) e incubar durante al menos 15 h a 37 °C.
- Prepare un precultivo durante la noche inoculando una sola colonia de la placa LB recién preparada en un matraz de 50 mL de medio Luria Bertani (LB).
- Inocular 5 mL de precultivo en 500 mL de medio 2xYTPG en un matraz Erlenmeyer deflector de 3 L. Cultivarla a 37 °C con agitación vigorosa (entre 220 rpm y 250 rpm) y cosechar las células cuando alcancen la fase de registro medio (OD600 ~ 3). A continuación,....
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Resultados
Para cada nuevo lote de extracto celular y ARN polimerasa T7, se recomienda realizar un cribado básico de las concentraciones de Mg2+ y K+ para garantizar el rendimiento óptimo del sistema CFPS. La fluorescencia de la GFP de la superplegadora puede servir como indicador del rendimiento general del sistema CFPS en condiciones variables, como se ilustra en la Figura 1A, B. Además, en la Figura 1C se muestra una comparación pa.......
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Discusión
Este manuscrito describe un sistema modificado de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) diseñado para su uso en varios microcompartimentos en plataformas celulares sintéticas, incluidas gotas de agua en aceite, GUV y SLB. Utilizamos la cepa huésped estándar de expresión de proteínas recombinantes de E. coli, BL21 (DE3), como extracto fuente para la construcción de sistemas celulares sintéticos centrados en proteínas. Este enfoque produjo aproximadamente 0,5 mg/mL de pro.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Agradecimientos
M. Y. agradece la financiación del Programa de Investigación de Posgrado e Innovación Práctica de la Provincia de Jiangsu, China (Subvención No. KYCX22_2803). L.K. agradece el apoyo de la Investigación en Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu de China, China (Subvención No. 17KJB180003), la Fundación de Ciencias Naturales de la Universidad Normal de Jiangsu, China (Subvención No. 17XLR037), el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu, China, y el programa de Profesores Especialmente Designados de Jiangsu, China.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina(DOPC) | Avanti | 850375P | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal sódica)(DOPS) | Avanti | 840035P | |
| 1,4 ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) | Avanti | 850457P | |
| 3,5-AMP cíclico (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Tubos de 50 mL | Eppendorf | Tubos Eppendorf BioBased | |
| 50% peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| Acetato | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar en polvo | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| Alanin | Sigma-Aldrich | A4349 | |
| Amicon Células Agitadas | MerckMillipore | UFSC05001 | |
| Acetato de amonio (NH4OAc) | Sigma-Aldrich | A7262 | |
| Arginina | Sigma-Aldrich | A4474 | |
| Asparagin | Sigma-Aldrich | A0884 | |
| Aspartato | Sigma-Aldrich | A5474 | |
| ATP | Roche | 11140965001 | |
| Atto 488 DOPE | Sigma-Aldrich | 67335 | |
| Atto 647N DOPE | Sigma-Aldrich | 42247 | |
| Matraz Erlenmeyer deflector | Shuniu | 250 mL, 1000mL | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Roche | 10711454001 | |
| Tubo centrífugo | Eppendorf | Tubos Eppendorf 3810X | |
| Rack de tubos centrífugos | Eppendorf | 0030119819 | |
| Sistema de imagen de quimioluminiscencia y epifluorescencia | Uvitec | Alliance Q9 Advanced | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Confocal Microscopía de barrido láser (LSM) | ZEISS | LSM 780 | |
| Countess Portaobjetos de cámara de recuento de células | Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Cubreobjetos | Thermo Scientific | Menzel BB02400500A113MNZ0 | |
| creatina quinasa (CK) | Roche | 10127566001 | |
| Fosfato de creatina (CP) | Sigma-Aldrich | 10621714001 | |
| Plato de cultivo | Huanqiu | 90 mm | |
| Cystein | Sigma-Aldrich | C5360 | |
| Cytidine 5'-trifosfato sódico sal (CTP) | aladdin | C101487 | |
| membrana de diálisis | Espectro | estándar RC Tubo MWCO: 12-14 kD | |
| E.Z.N.A. Ciclo Pure Kit | Omega Bio-Tek | D6492-01 | |
| Electrocalentamiento Cultivador de temperatura estacionaria | Instrumento Yiheng | DHP-9602 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Biosharp | ||
| Lector de placas fluorescentes | BioTek | Synergy 2 | |
| Aceite fluorado | Suzhou CChip instrumento científico | 2%HFE7500 | |
| Ácido folínico | Sigma-Aldrich | 47612 | |
| Prensa francesa | G.Heinemann | HTU-DIGI-Prensa | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glutamat | Sigma-Aldrich | G5667 | |
| Glutamina | Sigma-Aldrich | G5792 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycin | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Guanosina 5'-trifosfato Sal sódica hidrato (GTP) | Roche | 10106399001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HiPrep Q FF 16/10 | Cytiva | 28936543 | |
| Histidina | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| Isoleucina | Sigma-Aldrich | I5281 | |
| Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Leucina | Sigma-Aldrich | L6914 | |
| Lisina | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Acetato de magnesio tetrahidratado (Mg(OAc)2 ) | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Metionina | Sigma-Aldrich | M8439 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424 R | |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Systems | Bio-Rad | 1645050 | |
| Centrífuga Multipropósito | Eppendorf | 5810 R | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Ácido nucleico & Mediciones de ensayos UV de proteínas | IMPLEN | NanoPhotoPhotometer N60 | |
| NucleoBond Xtra Maxi kit para plásmido de grado de transfección DNA | MACHEREY-NAGEL | 740414.5 | |
| Nunc-Immuno MicroWell 96 pocillos placas de poliestireno | Sigma-Aldrich | P8616 | |
| PCR termociclador | Eppendorf | Mastercycler nexus | |
| Peptona | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Fenilalanina | Sigma-Aldrich | P8740 | |
| Fosfoenolpiruvat (PEP) | GLPBIO | GC44635 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | PMSF-RO | |
| Polietilenglicol 8000 (PEG 8000) | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Acetato de potasio(KOAc) | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| Cloruro de potasio( KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Glutamato de potasio (K-glutamato) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Prolin | Sigma-Aldrich | P8865 | |
| Piruvato quinasa (PK) | Sigma-Aldrich | P9136 | |
| Serina | Sigma-Aldrich | S4311 | |
| Agitador | Zhichushakers | ZQZY-AF8 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sacarosa | aladdina | S112226 | |
| Ácido sulfúrico | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Filtros de jeringa | Jinteng | 0.45 μ m | |
| Tubo de ensayo | Shuniu | 20 mL | |
| TGX FastCast Acrylamida Kit, 12% | Bio-Rad | #1610175 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | ThermoMixer C | |
| Threonin | Sigma-Aldrich | T8441 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Triptona | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Triptófano | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| Tirosina | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| UTP Sal trisódica (UTP) | aladdin | U100365 | |
| Bomba de vacío con sistema de agua circulante | Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.Ltd | SHB- | |
| Valin | Sigma-Aldrich | V4638 | |
| Mezcladores de vórtice | Kylin-Bell | Vortex QL-861 | |
| Sistema de purificación de agua | MerckMillipore | Direct agua ultrapura (Tipo 1) | |
| Extracto de levadura | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | 444203 |
Referencias
- Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
- Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like art....
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Reimpresiones y permisos
