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Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

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DOI:

10.3791/66626

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19 de abril de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Resumen

El sistema de Síntesis de Proteínas Libres de Células (CFPS) se ha empleado ampliamente para facilitar el ensamblaje ascendente de células sintéticas. Sirve como anfitrión para la maquinaria central del Dogma Central, erigiéndose como un chasis óptimo para la integración y el ensamblaje de diversos sistemas de mimetismo celular artificial. A pesar de su uso frecuente en la fabricación de células sintéticas, el establecimiento de un sistema CFPS robusto y adaptado para una aplicación específica sigue siendo un reto no trivial. En este artículo de métodos, presentamos un protocolo completo para el sistema CFPS, empleado rutinariamente en la construcción de células sintéticas. Este protocolo abarca etapas clave en la preparación del sistema CFPS, incluido el extracto celular, la preparación de plantillas y la optimización de la expresión de rutina utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, mostramos resultados representativos al encapsular el sistema CFPS dentro de varios microcompartimentos, como gotas monocapa, vesículas de doble emulsión y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Finalmente, dilucidamos los pasos críticos y las condiciones necesarias para el ensamblaje exitoso de estos sistemas CFPS en distintos entornos. Esperamos que nuestro enfoque facilite el establecimiento de buenas prácticas de trabajo entre varios laboratorios dentro de la comunidad de células sintéticas en continua expansión, acelerando así el progreso en el campo del desarrollo de células sintéticas.

Introducción

La síntesis de células sintéticas o artificiales se ha convertido en un campo muy destacado de investigación interdisciplinaria, que atrae un interés sustancial de los científicos de todos los dominios de la biología sintética, la química y la biofísica. Estos científicos están unidos por el objetivo común de construir una célula viva mínima 1,2,3. El rápido crecimiento de este campo ha ido en sintonía con avances significativos en tecnologías críticas, como la manipulación del ADN recombinante4, los materiales biomiméticos5 y las técnicas de microfabricación para la compartimentación6, incluido el método de síntesis de proteínas libres de células (CFPS)7. Los sistemas CFPS abarcan la maquinaria celular esencial para la transcripción y la traducción, proporcionando el marco fundamental para el desarrollo y la integración de células artificiales multifuncionales.

Aunque las técnicas de CFPS se utilizan con frecuencia en el ensamblaje de células sintéticas, el desarrollo de un sistema de CFPS robusto y adaptado para el ensamblaje de varios sistemas de células sintéticas sigue siendo un desafío complejo. En la actualidad, se dispone de numerosos sistemas de CFPS, derivados de organismos modelo tanto procariotas como eucariotas8, cada uno especializado para aplicaciones particulares en la síntesis de células sintéticas. Más allá de sus funciones centrales en la transcripción y la traducción, los sistemas CFPS varían en sus componentes principales y en los procedimientos de preparación asociados. Estas variaciones, que incluyen diferencias en los extractos celulares, las ARN polimerasas, los métodos de preparación de plantillas y las composiciones de los tampones, se deben en gran medida a las distintas trayectorias de desarrollo seguidas por los grupos de investigación que han optimizado intensamente sus sistemas para obtener el máximo rendimiento de proteínas.

Entre los diversos componentes del sistema CFPS, el extracto celular es un grupo enzimático crítico para la transcripción y la traducción y, por lo tanto, un determinante clave del rendimiento de CFPS9. El CFPS basado en Escherichia coli (E. coli) es el sistema más utilizado debido a su condición de organismo procariota mejor comprendido. Además, el grupo de investigación de Ueda ha desarrollado un sistema de CFPS totalmente reconstituido que comprende proteínas y ribosomas purificados individualmente, conocido como PURE10, que es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren un fondo claro. Hoy en día, incluso los sistemas de CFPS basados en E. coli se han diversificado, especialmente en términos de las cepas fuente para el extracto11 y los métodos de preparación12,13, ARN polimerasa14,15, fuentes de energía16,17 y sistemas tampón18,19. Las cepas más utilizadas incluyen derivados de la cepa K12 y B, como A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 y Rossetta223, junto con sus contrapartes modificadas genéticamente.

Inicialmente, se eligieron cepas de E. coli con actividades reducidas de ARNasa y proteasa para mejorar la estabilidad del ARNm y la estabilidad de las proteínas recombinantes recién sintetizadas, lo que condujo a un mayor rendimiento final de proteínas24. Posteriormente, los extractos de E. coli se diseñaron para facilitar modificaciones postraduccionales específicas, incluida la glicosilación25, la fosforilación26 y la lipidación27, para lograr las modificaciones postraduccionales anteriores. Además, se han incorporado una serie de aditivos como acompañantes moleculares28 y estabilizadores químicos para ayudar al plegamiento de las proteínas objetivo, lo que contribuye a la diversificación de los sistemas CFPS. La ARN polimerasa del bacteriófago T7, conocida por su alta procesividad, se emplea predominantemente para la transcripción, aunque también se han utilizado otras polimerasas como la SP629. La ARN polimerasa endógena de E. coli ha sido adaptada para la creación de prototipos de circuitos genéticos aprovechando los factores sigma30. Por último, se han optimizado sistemáticamente una variedad de precursores de energía 31,32,33 y diferentes sales y componentes tampón 19,34,35 para mejorar la productividad.

Además del propio sistema CFPS, los métodos de encapsulación y los materiales de compartimentación también son vitales para el éxito del ensamblaje de células sintéticas. Varios sistemas que se han desarrollado para encapsular con éxito la reacción CFPS incluyen gotas de agua/aceite estabilizadas con surfactante, lípidos/polímeros y sus vesículas unilaminares híbridas (con diámetros que van desde 50 nm hasta varios μm), así como bicapas lipídicas soportadas planas. Sin embargo, debido al contenido de moléculas complejadas del sistema CFPS, la tasa de éxito de la encapsulación depende de casos específicos, particularmente para la formación de vesículas. Para mejorar la tasa de éxito y la eficiencia de la encapsulación de CFPS, se han desarrollado varios chips de microfluidos para facilitar la formación de gotas y vesículas36. Sin embargo, será necesario establecer chips y dispositivos adicionales.

Este protocolo delinea un sistema CFPS de E. coli que utiliza la cepa BL21 (DE3), que es un huésped comúnmente empleado para la producción de proteínas recombinantes. El protocolo abarca una descripción detallada de la preparación del extracto celular, la preparación de la plantilla y la optimización de la expresión estándar utilizando una proteína reportera fluorescente. Además, presentamos resultados ejemplares logrados al encapsular el sistema CFPS dentro de diversos microcompartimentos, incluidas gotas monocapa, vesículas de emulsión doble y cámaras situadas sobre bicapas lipídicas soportadas. Por último, exponemos los elementos procedimentales fundamentales y las condiciones necesarias indispensables para el establecimiento exitoso de estos sistemas de PPC en contextos ambientales distintos.

Protocolo

1. Preparación del extracto

  1. Pasar la cepa de E. coli BL21 (DE3) de un caldo de glicerol a una placa de agar Luria Bertani (LB) e incubar durante al menos 15 h a 37 °C.
  2. Prepare un precultivo durante la noche inoculando una sola colonia de la placa LB recién preparada en un matraz de 50 mL de medio Luria Bertani (LB).
  3. Inocular 5 mL de precultivo en 500 mL de medio 2xYTPG en un matraz Erlenmeyer deflector de 3 L. Cultivarla a 37 °C con agitación vigorosa (entre 220 rpm y 250 rpm) y cosechar las células cuando alcancen la fase de registro medio (OD600 ~ 3). A continuación, colocar los cultivos celulares en agua helada fría durante 10 min y centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C.
    NOTA: En este paso, la glucosa en el medio 2xYTPG se puede omitir para aplicaciones específicas 9,12.
  4. Vuelva a suspender los gránulos de celda resultantes en 35 mL de tampón S30 A preenfriado, seguido de una centrifugación a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  5. Repita el paso 1.4 dos veces.
    NOTA: Los pellets de celda pueden almacenarse a -80 °C si no se utilizan inmediatamente.
  6. Vuelva a suspender los gránulos finales en el tampón S30 B (por ejemplo, use 1,1 ml de tampón S30 B por 1 g de gránulo de celda) y rompa las celdas en una pasada a través de French Press a 17,000 psi.
    1. Para usar la prensa francesa, siga el manual del usuario y transfiera la suspensión de la celda a la cámara de disrupción metálica de la prensa francesa, asegurándose de que todos los componentes estén ensamblados y que la válvula inferior de la cámara de interrupción esté cerrada.
    2. Transfiera la cámara de interrupción ensamblada a la plataforma hidráulica y asegure el bloqueo de seguridad.
    3. Encienda la bomba hidráulica e inicie la interrupción.
    4. Controle la válvula de salida para permitir que la suspensión de la celda fluya fuera del tubo de salida a un nuevo tubo de 50 mL. Ajuste la velocidad del flujo para garantizar una interrupción eficiente, idealmente una gota a la vez. Mantenga la presión por encima del límite inferior de 15.000 psi.
  7. Centrifugar el lisado resultante a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Repita la centrifugación una vez y recoja el sobrenadante. Añadir 0,3 volumen de tampón de preincubación en el sobrenadante recogido e incubar agitando suavemente a 37 °C durante 80 min.
    NOTA: El uso de tampón de preincubación podría aumentar el rendimiento final, aunque se ha reportado que una escorrentía vacía (sin tampón de preincubación) también podría mejorar la eficiencia37,38, que depende de la cepa fuente correspondiente.
  8. Diálisis la mezcla de escorrentía resultante durante 2 h frente a 2 L de tampón S30 C, cambio el tampón de diálisis una vez por 2 L de tampón S30 C fresco y dializamos durante la noche a 4 °C39.
    NOTA: El segundo paso de la diálisis nocturna se puede acortar a aproximadamente 3 h.
  9. Recoger la muestra dializada y centrifugar a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante y la alícuota en volúmenes apropiados y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
    NOTA: La muestra congelada puede almacenarse a -80 °C al menos durante 6 meses a 1 año sin pérdida de eficiencia.

2. ARN polimerasa T7

  1. Transformar el plásmido pAR1219 en células competentes de E. coli estrella BL21 (DE3)40.
  2. Inocular 10 mL de un cultivo nocturno en 1 L de medio LB (que contiene 100 μg/mL de ampicilina). Cultive las células a 37 °C hasta que el OD600 alcance 0,6-0,8.
  3. Inicie la inducción añadiendo una concentración final de 1 mM de IPTG. Inducir las células durante 5 h adicionales y cosechar por centrifugación a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C. Almacene los gránulos de celdas a -80 °C durante varias semanas.
  4. Vuelva a suspender los gránulos de células en 30 ml de tampón T7 A y rompa las células en una sola pasada a través de la prensa francesa a 15.000 psi. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
  5. Añadir sulfato de estreptomicina gota a gota al sobrenadante del paso anterior, alcanzando una concentración final del 4% (p/v). Después de una breve incubación en hielo, centrifugar a 20.000 × g durante 30 min a 4 °C.
  6. Filtre el sobrenadante a través de una membrana filtrante de 0,45 μm y cargue la muestra filtrada en una columna de intercambio aniónico fuerte (volumen de columna de 40 mL), que se preequilibró con volúmenes de 10 columnas de tampón T7 B, a través de un sistema automatizado de cromatógrafo de líquidos.
  7. Lave la columna cargada con 50 volúmenes de columna de tampón T7 B y eluya la muestra con 10 volúmenes de columna de mezclas de tampón C T7 con bajo contenido de sal (50 mM) y alto contenido de sal (500 mM), estableciendo un gradiente de concentración lineal de NaCl de 50 a 500 mM a un caudal de ~3 mL/min41.
  8. Recoja las fracciones de pico y analícelas por SDS-PAGE.
    NOTA: La polimerasa T7 exhibe una banda predominante a ~ 100 kDa, mientras que aún aparecen cantidades significativas de impurezas en el gel SDS-PAGE.
  9. Agrupar las fracciones que contienen T7 polimerasa y dializar contra 2 L de tampón T7 C durante la noche.
  10. Añadir glicerol hasta alcanzar una concentración final del 10% y concentrar la mezcla resultante hasta una concentración final de 3-4 mg/mL por ultrafiltración42.
    NOTA: Si aparece precipitación durante el proceso de concentración, deténgase inmediatamente y elimine los precipitados por centrifugación.
  11. Ajusta la concentración de glicerol al 50%. Alícuota y congelación instantánea de la muestra con nitrógeno líquido. Almacenar a -80 °C durante más tiempo.
    NOTA: Una pequeña alícuota también podría almacenarse a -20 °C durante al menos 1 mes sin pérdida de eficiencia.

3. Preparación del tampón

  1. Prepare los tampones como se indica en la Tabla 1 un día antes de su uso.

4. Diseño y preparación de plantillas

  1. Clone el gen de interés en un vector basado en el promotor T7 o genere un producto de PCR lineal que contenga el gen de interés.
    NOTA: Consulte la sección de discusión para conocer los principios de diseño.
  2. Prepare el plásmido a partir de un cultivo nocturno utilizando un kit de extracción de plásmido.
    NOTA: Recomendamos seleccionar un kit de plásmidos que incluya un paso de precipitación de isopropanol seguido de un procedimiento de lavado con etanol al 70%.
  3. Disuelva el ADN seco en un pequeño volumen de agua ultrapura hasta una concentración entre 200 μg/mL y 500 μg/mL, según lo determine un espectrofotómetro de microvolúmenes.
  4. Opcional: Exprima directamente proteínas de productos de PCR lineal.
    NOTA: En este caso, se necesita un paso de purificación por PCR.

5. Optimizaciónde Mg 2+ y K+

  1. Prepare una mezcla maestra para el cribado de concentración de Mg2+ como se indica en la Tabla 2, o para el cribado de concentración de K+ como se indica en el Cuadro 3.
  2. Transfiera la mezcla maestra a tubos de microfuga individuales o a una placa de 96 pocillos en forma de V.
  3. Pipetear el volumen exacto de soluciones madre de Mg2+ o K+ en tubos de microfuga individuales o en la placa de 96 pocillos en forma de V y completar las reacciones CFPS con agua ultrapura. Incubar las reacciones durante al menos 2 h.
    NOTA: Si usa una placa de 96 pocillos en forma de V, selle la placa con una cubierta de plástico para evitar la evaporación.
  4. Extraiga 2 μL de la mezcla de reacción y transfiéralo a una placa negra de 96 pocillos para mediciones de fluorescencia mediante un lector de placas.
    NOTA: Utilizamos un lector de placas fluorescentes con la siguiente configuración: excitación/emisión: 485/528, Ganancia: 50, Altura de lectura: 7,00 mm. Sin embargo, sería necesario ajustar su lector de placas para generar una curva de calibración específica utilizando proteínas fluorescentes purificadas.

6. Encapsulación

  1. Gotita
    1. Prepare un aceite fluorado que contenga surfactante (2% de PFPE-PEG en HFE7500) o una solución de aceite mineral y lípidos disolviendo el lípido en aceite mineral (consulte el paso 6.2.1)
    2. Prepare un volumen total de 100 μL de reacción de CFPS combinando los reactivos correspondientes 2-18 de la Tabla 4. Agregue la reacción de CFPS a 500 μL del aceite previamente preparado en un tubo de 1,5 mL y luego, frote el tubo vigorosamente sobre la rejilla de tubos 50x para formar gotas finas (agua en aceite). Incubar el tubo a 30 °C para realizar la reacción.
      NOTA: Los chips de microfluídica simples también podrían usarse para generar gotas homogéneas43.
  2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs)
    1. Preparación de la solución de lípidos y aceite mineral
      1. Agregue 57 μL de cloroformo en un vial de vidrio de 4 mL y luego agregue 18 μL de 25 mg/mL de lípidos de 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina (POPC) para formar la solución lipídica de cloroformo, logrando una concentración final de 8 mM (use otros lípidos con concentraciones finales similares).
        NOTA: Este paso de mezcla fue para asegurar una mezcla homogénea de diferentes lípidos.
      2. Evapore el cloroformo bajo un flujo de argón durante 15 minutos y, a continuación, evapore aún más al vacío durante 1 h.
      3. Disolver los lípidos secos resultantes en 1.500 μL de aceite mineral, alcanzando una concentración final de 400 μM. Incubar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
    2. Formación de una capa lipídica interfacial
      1. Añada 500 μL de la solución exterior (véase la Tabla 5) a un tubo de 1,5 mL y coloque lentamente 250 μL de solución de aceite mineral y lípidos sobre la solución exterior. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para formar una capa lipídica interfacial estable.
    3. Preparación de la solución interna
      1. Mezcle todos los reactivos de la Tabla 6 para formar la solución preinterna y manténgala en hielo hasta su uso. Complete la solución interna agregando T7RNAP, extracto S30 y plantilla de ADN en la solución preinterna como los reactivos 16-18 enumerados en la Tabla 4.
        NOTA: El aumento de la concentración de sacarosa encapsulada por encima de 250 mM podría inhibir la traducción libre de células44.
    4. Formación de GUVs
      1. Añada 50 μL de solución interna a un tubo nuevo de 1,5 mL que contenga 500 μL de aceite mineral lipídico, pipetee hacia arriba y hacia abajo rápidamente y haga un vórtice vigoroso.
      2. Deje el tubo en hielo durante 10 minutos y añada lentamente 20 μL de la mezcla de emulsión en la parte superior de la fase oleosa en el tubo de 1,5 mL del paso 6.2.2.
      3. Centrifugar a 800 × g (utilizar una velocidad de centrifugación que oscile entre 100 × g y 1000 × g) durante 10 min a 4 °C y observar la formación de GUV en el fondo del tubo.
        NOTA: Se podría utilizar una velocidad de centrifugación específica más alta; sin embargo, se podría considerar que la velocidad de centrifugación podría influir en el tamaño de los GUV formados45.
      4. Retire la fase superior de aceite.
      5. Aspire 30 μL de GUV en la parte inferior del tubo con cuidado. Incubar los GUV recolectados a 30 °C.
        NOTA: La temperatura óptima de incubación varía para las diferentes proteínas.
      6. Utilice la microscopía de barrido láser confocal (LSM) para monitorizar la expresión de proteínas fluorescentes.
  3. Bicapa lipídica compatible (SLB)
    1. Preparación de cámaras SLB
      1. Cubreobjetos Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 agregando siete gotas de ácido sulfúrico y dos gotas de peróxido de hidrógeno al 50% en el centro de cada portaobjetos de cubierta. Incubar los reactivos en los cubreobjetos durante al menos 45 min; Enjuague bien con agua ultrapura.
      2. Ensamble la cámara de reconstitución conectando un tubo de microfuga cortado de 0,5 mL en los cubreobjetos limpios con pegamento óptico curado bajo una lámpara ultravioleta (365 nm) durante 10 minutos para formar una cámara de reacción.
    2. Formación de SLB
      1. Disuelva 80% mol 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), 19,95 mol% 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfo-L-serina (DOPS) y 0,05 mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina = DOPE), mezcle en cloroformo, seque con un flujo de nitrógeno suave y aspire durante 1 h para eliminar el solvente por completo.
      2. Rehidratar la película lipídica seca en el tampón SLB A, lo que da como resultado una concentración final de lípidos de 4 mg/mL.
      3. Vórtice y sonique las muestras resultantes hasta que se aclaren.
      4. Diluir 4 mg/mL de SUV con 130 μL de tampón SLB A, transferir 75 μL de la suspensión a las cámaras de reacción preformadas e incubar en un bloque de calor a 37 °C durante 1 min. Añada 150 μL de tampón SLB A a la cámara de reacción para una mayor incubación durante 2 min.
      5. Lave la cámara con 2 mL de tampón SLB B (tampón SLB A sin MgCl2) antes de un cambio de tampón al tampón S30 C con 0,4% (p/v) de BSA para reacciones de CFPS, dejando 100 μL de tampón dentro de la cámara para evitar que el SLB formado se seque.
      6. Retire el tampón S30 C residual y añada la mezcla de reacción CFPS en la cámara SLB con cuidado. Incubar la cámara a 30 °C y monitorizar la expresión bajo un microscopio de barrido láser confocal.

Resultados

Para cada nuevo lote de extracto celular y ARN polimerasa T7, se recomienda realizar un cribado básico de las concentraciones de Mg2+ y K+ para garantizar el rendimiento óptimo del sistema CFPS. La fluorescencia de la GFP de la superplegadora puede servir como indicador del rendimiento general del sistema CFPS en condiciones variables, como se ilustra en la Figura 1A, B. Además, en la Figura 1C se muestra una comparación paralela del rendimiento del sistema CFPS en diferentes compartimentos, lo que demuestra un rendimiento consistente en sistemas CFPS encapsulados, aunque con una ligera disminución de los GUV, posiblemente debido a la influencia de la sacarosa46. Además, las reacciones de CFPS se encapsularon con éxito en gotas (Figura 2), GUV (Figura 3) y encima de SLB (Figura 4).

La Figura 2A destaca la formación de gotas de emulsión, evidentes cuando la solución de aceite se volvió turbulenta. La expresión de proteínas fluorescentes verde/roja (GFP y mCherry) se capturó mediante una microscopía de barrido láser confocal. La Figura 3 mostró el éxito de la encapsulación de la reacción de CFPS dentro de GUV a través del simple proceso de transferencia de emulsión. El canal rojo indicaba los lípidos marcados; el canal verde mostró la expresión de GFP de superplegadora; y el canal amarillo representaba un tinte fluorescente inerte. La Figura 4A muestra la cámara SLB donde se podría depositar la reacción de CFPS. Dentro de esta cámara, se formó un SLB en la parte superior del cubreobjetos de vidrio, con la mezcla de reacción CFPS colocada sobre el SLB preformado, lo que permitió obtener imágenes a través de una microscopía de escaneo láser confocal. Como se indica en la Figura 4B, el SLB se visualizó mediante lípidos marcados, que se mostraron en verde, mientras que la pequeña GTPasa Cdc42 expresada con mCherry se mostró en magenta. La expresión in situ de mCherry-Cdc42 fue observable, junto con el proceso de focalización de membrana reversible, bajo el microscopio. Sin embargo, el sistema CFPS utilizado se complementó con maquinaria de prenilación, como se detalla en una publicación reciente47.

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Figura 1: Optimización y comparación del sistema CFPS. Cribado de concentraciones de (A) Mg2+ y (B) K+ para el sistema CFPS a granel. (C) Un gráfico de barras que muestra los rendimientos de la expresión de proteínas en diferentes compartimentos. La fluorescencia de la superplegadora GFP se utilizó para determinar el rendimiento del sistema CFPS, medido por un lector de placas o un microscopio de barrido láser confocal. Abreviaturas: CFPS = síntesis de proteínas libres de células; GFP = proteína verde fluorescente; sfGFP = GFP de la supercarpeta; GUV = vesícula unilaminar gigante; SLB = bicapa lipídica soportada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Síntesis de proteínas libres de células en gotas. (A) Una foto de reacciones de CFPS encapsuladas en gotas de agua en aceite estabilizadas con surfactante. (B) Imágenes de campo claro y fluorescencia (C,D) de CFPS de (C) mCherry y (D) supercarpeta GFP encapsuladas en gotas visualizadas por microscopía de barrido láser confocal. Superfolder GFP se indica en verde; mCherry está indicado en magenta. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: CFPS = síntesis de proteínas libres de células; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Síntesis de proteínas libres de células en GUVs. (A) Una foto de reacciones de CFPS encapsuladas en GUVs. (B-D) Imagen de fluorescencia de CFPS encapsulados dentro de GUVs POPC, expresando GFP de supercarpeta. (B) La bicapa lipídica se marcó con un 0,05% de lípidos Atto647N-DOPE, se mostró en rojo, (C) un colorante inerte se mostró en amarillo, y (D) la supercarpeta GFP se indicó en verde. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: CFPS = síntesis de proteínas libres de células; GFP = proteína verde fluorescente; GUV = vesícula unilaminar gigante; POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glicerol-3-fosfocolina; DOPE = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Síntesis de proteínas libres de células de la pequeña proteína GTPasa-Cdc42 en la parte superior de SLB. (A) Ilustración esquemática de la reconstitución de la orientación de la membrana de Cdc42 y la extracción de membrana dependiente de RhoGDI en SLB, visualizada por microscopía de barrido láser confocal. La maquinaria de prenilación se implementó a través de un extracto enriquecido con prenlytransferasa, que se detalla en otra parte. 47. (B) Una vista ortogonal de la pre y postprenilación de la mezcla de reacción sobre SLB. (C,D) Series temporales de la intensidad de mCherry-Cdc42 en la membrana (rosa) y en solución (negro) durante la focalización de la membrana (C) y la extracción de la membrana (D). Las barras de escala = 10 μm. (A-D) fueron adaptadas de Kai et al.47. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de búferes. NOTA: Agregue β-mercaptoetanol y DTT justo antes de usar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Esquema de pipeteo para el cribado de concentraciones de Mg2+ . Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Esquema de pipeteo para el cribado de concentración de K+ . Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Composición de la solución interna. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Composición de la solución externa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Composición de la solución preinterna. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este manuscrito describe un sistema modificado de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) diseñado para su uso en varios microcompartimentos en plataformas celulares sintéticas, incluidas gotas de agua en aceite, GUV y SLB. Utilizamos la cepa huésped estándar de expresión de proteínas recombinantes de E. coli, BL21 (DE3), como extracto fuente para la construcción de sistemas celulares sintéticos centrados en proteínas. Este enfoque produjo aproximadamente 0,5 mg/mL de proteína en diferentes compartimentos. Si bien se podrían utilizar otras cepas de fuentes de extracto personalizadas, estos sistemas se han optimizado principalmente para un tipo específico de proteína o actividad metabólica, que puede ser subóptima para la expresión general de proteínas. Los avances recientes en el análisis cuantitativo de espectrometría de masas han facilitado estudios piloto sobre el análisis proteómico del lisado celular48,49, particularmente en diversas condiciones de preparación.

A pesar de obtener información de estos estudios, establecer una correlación cuantitativa entre estos factores proteicos identificados y el rendimiento general de los sistemas CFPS sigue siendo un desafío. Esta brecha dejó preguntas sin respuesta sobre cómo evaluar cuantitativamente el rendimiento de un lote determinado de extracto. Además, no se ha realizado una comparación sistemática y paralela de las diferentes cepas fuente reportadas. En este estudio, utilizamos el medio 2xYPTG para aumentar la producción de biomasa, una estrategia recomendada para la transición a 2xYPT cuando se utiliza la ARN polimerasa endógena para la transcripción. A pesar de las sugerencias de que la polimerasa T7 podría integrarse en el procedimiento de preparación del extracto45, optamos por un protocolo de preparación separado para el extracto S30 y la ARN polimerasa T7 para reducir las altas variaciones de lote a lote.

La producción de la proteína diana está intrínsecamente ligada al proceso central de transcripción/traducción. El diseño adecuado de la plantilla y la pureza son cruciales para una expresión exitosa sin células. Además de la plantilla de plásmido, también se puede emplear ADN lineal de doble cadena generado por PCR, lo que ofrece idoneidad para aplicaciones de cribado y de alto rendimiento. A diferencia del diseño de plantilla convencional para la expresión in vivo en E. coli, el diseño de plantilla en el sistema libre de células de E. coli se simplifica sin necesidad de consideraciones de inducción de expresión. El único elemento esencial de una plantilla de expresión sin células es una secuencia reguladora T7. Sin embargo, en algunos casos, la secuencia 5' del gen diana podría influir en el inicio de la traducción, dependiendo de la estructura secundaria formada por el ARNm transcrito correspondiente. Si el sitio de unión al ribosoma se encuentra dentro de un bucle de tallo estable del ARNm transcrito, el inicio de la traducción podría verse obstaculizado significativamente, lo que llevaría a una expresión general deficiente. Del mismo modo, los codones raros consecutivos pueden dificultar la expresión y deben optimizarse, de forma similar a los estudios in vivo . Esto se puede lograr a través de servidores de código abierto dedicados a la optimización de codones50 y la predicción de la estructura secundaria del ARNm51.

En cuanto al sistema tampón, utilizamos un tampón de acetato suplementado con fosfato de creatina y creatina quinasa como fuentes de regeneración energética en nuestro montaje experimental. Esta configuración produjo un nivel de expresión moderado y una cinética relativamente rápida, atribuible a la reacción de regeneración de energía de un solo paso catalizada por la creatina quinasa utilizando fosfato de creatina. Si bien algunos investigadores han cambiado a un sistema tampón de glutamato, citando su mayor parecido con el entorno celular52, no observamos diferencias significativas en los rendimientos de expresión de proteínas con nuestros protocolos actuales. Sin embargo, análisis proteómicos recientes indicaron que diferentes sistemas de tampón en combinación con métodos de procesamiento de extractos podrían influir en el rendimiento final de la expresión19. En cuanto a los precursores energéticos, numerosos grupos de investigación han investigado diversos sustratos para lograr una rentabilidad y una mayor expresión53,54. En el contexto del sistema CFPS presentado, se eligieron deliberadamente el fosfato de creatina y la creatina quinasa. Esta selección estuvo motivada por la eficiencia de la regeneración de energía que se puede lograr a través de una reacción de un solo paso y la ausencia de interferencia con las enzimas endógenas heredadas del extracto. En consecuencia, esta configuración establece un sistema sencillo pero robusto que se adapta bien a diversos entornos de microcompartimentos.

Como se indica en los resultados representados, demostramos una expresión exitosa de proteínas en tres microcompartimentos distintos: gotas de agua en aceite estabilizadas por aceite semifluorado, GUV formados a través de la transferencia de emulsión y encima de una bicapa lipídica soportada. La versatilidad de la expresión de proteínas a través de diferentes microcompartimentos pone de manifiesto la robustez de nuestro sistema CFPS para la construcción de células sintéticas. Entre estos métodos de encapsulación, la técnica de gotas de emulsión fue un enfoque notablemente sencillo para encapsular el sistema CFPS, que solo requería agitación o vórtice. Sin embargo, estas gotas tienden a ser inestables debido a la precaria interfase del agua, una limitación que podría abordarse añadiendo lípidos o tensioactivos a la fase oleosa. A pesar de la practicidad de las gotas estabilizadas de agua en aceite, no replican completamente el entorno celular natural, que consta de dos compartimentos acuosos separados por una membrana celular. En lugar de gotas, se establecieron vesículas unilamelares gigantes (GUV) con tamaños superiores a 1 micra para imitar más de cerca a las células. El sistema CFPS se encapsuló dentro de la bicapa lipídica de estas vesículas, proporcionando maquinaria de transcripción y traducción para diversos sistemas celulares sintéticos55.

La transferencia de emulsión, también conocida como emulsión doble, se destaca como la técnica típica para encapsular reacciones de CFPS, debido a su proceso de preparación suave y su eficiencia de encapsulación relativamente alta en comparación con los métodos sin solventes. Sin embargo, la generación de vesículas de doble emulsión puede variar desde simples etapas de centrifugación hasta el uso de la transferencia de emulsión asistida por microfluidos, cada método con sus ventajas y desventajas asociadas, como se resume en otra parte36. La encapsulación exitosa del sistema CFPS dentro de los GUV se basa en el ajuste de la osmolaridad y la aplicación de la fuerza adecuada para atravesar la interfaz aceite-agua. Aunque el método de transferencia de emulsión descrito aquí es el más sencillo y no requiere ningún equipo de laboratorio específico, la eficiencia y la homogeneidad de los GUV generados pueden variar entre los diferentes lotes. Además, todos los métodos de transferencia de emulsión deben lidiar con el aceite residual en el lumen de la interfaz bicapa formada, lo que requiere un paso adicional de eliminación de aceite56, lo que puede plantear desafíos en proyectos cinéticos.

Finalmente, hemos demostrado la expresión exitosa de CFPS sobre una bicapa lipídica soportada (SLB), lo que ofrece un enfoque valioso para proyectos que requieren síntesis de proteínas en proximidad al entorno de biomembrana lipídica. A través de la utilización del sistema CFPS presentado, hemos demostrado su aplicación exitosa en la caracterización del proceso de orientación de membrana reversible de Cdc4247, una molécula de proteína central crucial para la polaridad celular. En resumen, los rendimientos consistentes de expresión del medio y la robustez inherente observada en varios microcompartimentos resaltan el potencial de este sistema CFPS en la construcción de diversos sistemas celulares sintéticos. Esta capacidad puede ampliarse aún más para incluir varios modelos centrados en proteínas, avanzando en última instancia hacia la realización de células mínimas.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

M. Y. agradece la financiación del Programa de Investigación de Posgrado e Innovación Práctica de la Provincia de Jiangsu, China (Subvención No. KYCX22_2803). L.K. agradece el apoyo de la Investigación en Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu de China, China (Subvención No. 17KJB180003), la Fundación de Ciencias Naturales de la Universidad Normal de Jiangsu, China (Subvención No. 17XLR037), el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu, China, y el programa de Profesores Especialmente Designados de Jiangsu, China.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal sódica)(DOPS)Avanti840035P
1,4 ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)Avanti850457P
3,5-AMP cíclico (cAMP)Sigma-AldrichA9501
Tubos de 50 mLEppendorfTubos Eppendorf BioBased
50% peróxido de hidrógenoSigma-Aldrich516813
AcetatoSigma-AldrichA6283
Agar en polvoSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Células AgitadasMerckMilliporeUFSC05001
Acetato de amonio (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininaSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatoSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Matraz Erlenmeyer deflectorShuniu250 mL, 1000mL
Albúmina sérica bovina (BSA)Roche10711454001
Tubo centrífugoEppendorfTubos Eppendorf 3810X
Rack de tubos centrífugosEppendorf0030119819
Sistema de imagen de quimioluminiscencia y epifluorescenciaUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Confocal Microscopía de barrido láser (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Portaobjetos de cámara de recuento de célulasThermo Fisher ScientificC10283
CubreobjetosThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatina quinasa (CK)Roche10127566001
Fosfato de creatina (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Plato de cultivoHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-trifosfato sódico sal (CTP)aladdinC101487
membrana de diálisisEspectroestándar RC Tubo MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Ciclo Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Electrocalentamiento Cultivador de temperatura estacionariaInstrumento YihengDHP-9602
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Biosharp
Lector de placas fluorescentesBioTekSynergy 2
Aceite fluoradoSuzhou CChip instrumento científico2%HFE7500
Ácido folínicoSigma-Aldrich47612
Prensa francesaG.HeinemannHTU-DIGI-Prensa
GlucosaSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminaSigma-AldrichG5792
GlicerolSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosina 5'-trifosfato Sal sódica hidrato (GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinaSigma-AldrichH6034
IsoleucinaSigma-AldrichI5281
Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinaSigma-AldrichL6914
LisinaSigma-AldrichL5501
Acetato de magnesio tetrahidratado (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MetioninaSigma-AldrichM8439
MicrocentrífugaEppendorf5424 R
Aceite mineralSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Centrífuga MultipropósitoEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Ácido nucleico & Mediciones de ensayos UV de proteínasIMPLENNanoPhotoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit para plásmido de grado de transfección DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 pocillos placas de poliestirenoSigma-AldrichP8616
PCR termocicladorEppendorfMastercycler nexus
PeptonaSigma-Aldrich83059
FenilalaninaSigma-AldrichP8740
Fosfoenolpiruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polietilenglicol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Acetato de potasio(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Cloruro de potasio( KCl)Sigma-AldrichP9541
Glutamato de potasio (K-glutamato)Sigma-AldrichG1501
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Piruvato quinasa (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinaSigma-AldrichS4311
AgitadorZhichushakersZQZY-AF8
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SacarosaaladdinaS112226
Ácido sulfúricoSigma-Aldrich339741
Filtros de jeringaJinteng0.45 μ m
Tubo de ensayoShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamida Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TriptonaSigma-AldrichT7293
TriptófanoSigma-AldrichT8941
TirosinaSigma-AldrichT8566
UTP Sal trisódica (UTP)aladdinU100365
Bomba de vacío con sistema de agua circulanteZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Mezcladores de vórticeKylin-BellVortex QL-861
Sistema de purificación de aguaMerckMilliporeDirect agua ultrapura (Tipo 1)
Extracto de levaduraSigma-Aldrich70161
β-mercaptoetanolSigma-Aldrich444203
1100027

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