Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Resumen

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Resumen

La experiencia sensorial olfativa temprana induce una dramática remodelación de los glomérulos sinápticos en el cerebro juvenil de Drosophila , que depende de la dosis de la experiencia, está restringida temporalmente y es transitoriamente reversible solo en un período crítico corto y bien definido. La direccionalidad de la remodelación de la conectividad sináptica de los circuitos cerebrales está determinada por el odorante específico que actúa sobre la clase de receptores respondientes de las neuronas sensoriales olfativas. En general, cada clase de neurona expresa un solo receptor odorizante e inerva un solo glomérulo sináptico olfativo. En el modelo genético de Drosophila , la gama completa de glomérulos olfativos se ha mapeado con precisión mediante la capacidad de respuesta del odorante y la producción conductual. El odorante de butirato de etilo (EB) activa las neuronas receptoras Or42a que inervan el glomérulo VM7. Durante el período crítico de los primeros años de vida, la experiencia de EB impulsa la eliminación de sinapsis dependiente de la dosis en las neuronas sensoriales olfativas Or42a. Los períodos cronometrados de exposición al odorante EB dosificado permiten investigar la poda de la conectividad del circuito dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La microscopía confocal de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal se realiza con marcadores transgénicos impulsados por el receptor Or42a que proporcionan cuantificación del número de sinapsis y el volumen de inervación. El sofisticado conjunto de herramientas genéticas de Drosophila permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la remodelación de los circuitos cerebrales.

Introducción

La remodelación de los circuitos cerebrales juveniles durante los primeros años de vida representa la última oportunidad para que los cambios en la conectividad sináptica a gran escala coincidan con el entorno altamente variable e impredecible en el que nace un animal. Como el grupo más abundante de animales, los insectos comparten^{este mecanismo de} remodelación del período crítico fundamental y conservado evolutivamente. Los períodos críticos se abren con el inicio de la entrada sensorial, exhiben cambios de circuito reversibles para optimizar la conectividad y luego se cierran cuando las fuerzas de estabilización se resisten a una mayor remodelación². Los insectos dependen particularmente de la información sensorial olfativa y muestran un período crítico olfativo bien definido. Drosophila proporciona un excelente modelo genético para investigar este período crítico dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La experiencia odorífera durante los primeros días después de la eclosión provoca cambios sorprendentes en la conectividad del circuito en los glomérulos sinápticos identificados individualmente ^3,4. La dirección de la remodelación depende de la experiencia específica del odorante de entrada. Algunos odorantes causan un aumento en el volumen del glomérulo sináptico durante un par de días después de la eclosión (dpe)3,5,6,7, mientras que otros odorantes causan una rápida eliminación de sinapsis durante el período crítico de 0-2 dpe, lo que resulta en una disminución del volumen de inervación ^8,9,10. Específicamente, la experiencia odorífera del butirato de etilo (EB) impulsa la poda sináptica dependiente de la dosis de las neuronas receptoras olfativas Or42a solo durante este período crítico de vida temprana⁸. La eliminación de sinapsis es completamente reversible mediante la modulación de la entrada de odorante EB dentro del período crítico, pero se vuelve permanente después del cierre del período crítico. Esta poda sináptica dependiente de la experiencia olfativa proporciona un valioso sistema experimental para dilucidar los mecanismos temporalmente restringidos que subyacen a la remodelación de los circuitos cerebrales juveniles.

Aquí, presentamos un protocolo detallado utilizado para inducir y analizar la poda sináptica dependiente de la experiencia EB de las neuronas sensoriales olfativas del receptor Or42a durante el período crítico de la vida temprana. Demostramos que los terminales sinápticos de Or42a en el glomérulo del lóbulo antenal VM7 pueden marcarse específicamente mediante la conducción transgénica de un marcador mCD8::GFP unido a la membrana, ya sea fusionado directamente con el promotor de Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ o utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS (Or42a-Gal4 impulsando UAS-mCD8::GFP)¹². Las sinapsis individuales de las neuronas Or42a pueden marcarse de manera similar utilizando la expresión transgénica dirigida de marcadores de zona activa presinápticos fusionados con una matriz de etiquetas fluorescentes (p. ej., Bruchpilot::RFP)⁸ o una señal densa en electrones para análisis de sinapsis ultraestructural (p. ej., miniSOG-mCherry)⁸. Las imágenes de los terminales sinápticos Or42a se pueden obtener con una combinación de microscopía confocal de barrido láser y microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que la poda de glomérulos sinápticos de Or42a depende de la dosis de EB, escalando a la concentración de la experiencia odorífera cronometrada. El porcentaje de odorante EB disuelto en el aceite mineral utilizado como vehículo puede variar, al igual que la duración programada de la exposición al odorante en animales en etapa de desarrollo. Por último, se muestran los métodos utilizados para analizar el alcance de la poda sináptica de los glomérulos mediante la medición de la intensidad y el volumen de la fluorescencia de inervación de VM7. El número de sinapsis también se puede cuantificar mediante el recuento de puntos sinápticos marcados y la medición de los parámetros de la ultraestructura sináptica mediante microscopía electrónica de transmisión⁸. En general, el protocolo que se muestra aquí es un enfoque poderoso que permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la poda de conectividad sináptica del circuito olfativo de Drosophila durante un período crítico juvenil. La configuración general de exposición a olores descrita en este estudio se ha utilizado en estudios previos utilizando otros olores y ensayando otros glomérulos ^3,7.

Protocolo

1. Exposición a olores

1. Con un pincel fino, clasifique 40-50 animales en etapa de desarrollo como pupas oscuras de farato (90+ h después de la puparición a 25 °C) en viales de poliestireno Drosophila de 25 mm x 95 mm que contienen alimento estándar de melaza de harina de maíz (Figura 1A).
2. Coloque una malla fina de alambre de acero inoxidable sobre el extremo de los viales de Drosophila para contener las moscas y al mismo tiempo permitir un buen flujo de aire. Asegure las tapas de malla de alambre con una película transparente pegada con cinta adhesiva en el costado de los viales de Drosophila .
3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, coloque 1 mL de aceite 100% mineral (control de vehículos) o disuelva el odorante de butirato de etilo (EB) en aceite mineral en otro tubo para producir la concentración deseada (por ejemplo, 15% (150 μL) o 25% (250 μL)).
4. Coloque los tubos de microcentrífuga de control del vehículo o odorante en posición vertical dentro de un recipiente hermético Glasslock de 3700 ml. Con cinta adhesiva, ancle los tubos de forma segura en el centro de las cámaras de odorante junto con los viales de Drosophila (Figura 1B).
5. Coloque las cámaras selladas de control del vehículo y de odorizante EB que contienen los viales de pupas de pharate de Drosophila en una incubadora humidificada (70%) y con temperatura controlada (25 °C) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
6. Retire las moscas recién encerradas después de 4 h de exposición a la cámara de odorante y transfiera rápidamente de 20 a 25 moscas a viales frescos de Drosophila en cámaras con odorante recién hecho (Figura 1A, B). Deseche las pupas sin cerrar.
7. Mantenga las moscas en sus cámaras odoríferas selladas en las incubadoras durante un total de 24 h. Para una dosificación de odorante más prolongada, transfiera rápidamente las moscas a nuevos viales de Drosophila en cámaras odoríferas recién hechas cada 24 h.
8. Anestesiar a las moscas en etapa de desarrollo sumergiéndolas en un plato de etanol al 70% durante 1 minuto en preparación para la disección inmediata del cerebro y el procesamiento inmunocitoquímico.

2. Disección cerebral

1. Marque los viales como control de vehículo (100% aceite mineral solamente) o expuestos a EB (% EB) mediante el etiquetado y mantenga estas designaciones durante toda la disección del cerebro y el procesamiento posterior. Procese de 10 a 20 animales para cada condición de genotipo/olor.
2. Con fórceps, transfiera una sola mosca anestesiada a un plato pequeño de solución salina tamponada con fosfato (PBS) recién ^hecha13. Sumerja la mosca en PBS y continúe con la disección completa del cerebro con la mosca completamente sumergida.
3. Con pinzas finas # 4 afiladas en ambas manos, coloque la mosca con el lado ventral hacia arriba y agarre la parte superior del tórax con una pinza y la cabeza debajo de la probóscide con las otras pinzas. Tenga cuidado de no penetrar en el cerebro.
4. Retire la cabeza del resto del cuerpo tirando suavemente en direcciones opuestas con ambas manos. La cabeza debe desprenderse fácilmente del tórax; dejar la cabeza aislada para la disección (Figura 1C).
5. Deslice las pinzas utilizadas anteriormente para agarrar el tórax por debajo del lado opuesto de la probóscide. Comience a tirar suavemente de la cutícula del exoesqueleto en direcciones opuestas para que se desgarre entre los ojos y revele el cerebro.
6. Al tirar, los lóbulos ópticos del cerebro pueden separarse junto con el exoesqueleto. Para evitar esto, use un tirón lento y constante con las dos pinzas mientras retira la cutícula del exoesqueleto (Figura 1C, centro).
7. Continúe retirando la cutícula del exoesqueleto de la cabeza. Asegúrese de que se hayan retirado todas las partes del exoesqueleto. Extirpa todos los tejidos adheridos al cerebro, incluido el cuerpo graso y la tráquea que sobresalga.
8. Para evitar que se pegue, enjuague la punta de una pipeta P20 con PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Inmediatamente después de la disección, transfiera los cerebros a la solución de fijación (4% de paraformaldehído (PFA) + 4% de sacarosa) en un tubo tapado (Figura 1C, D).

3. Inmunocitoquímica cerebral

1. Fije el cerebro durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) con rotación de extremo a extremo. Mientras mantiene los cerebros en el tubo, pipetee y deseche adecuadamente el fijador peligroso. Lave rápidamente los cerebros fijos 3 veces con PBS (Figura 1D).
2. Los cerebros a menudo se pueden encontrar atascados en la tapa de los tubos después de la rotación. Para evitar la pérdida accidental de cerebros, que es un peligro constante en todas las transferencias, use un microscopio de disección mientras pipetea líquidos.
3. En preparación para el marcaje de anticuerpos, bloquee los cerebros fijos durante 1 h en RT en PBST + 1% de albúmina sérica bovina (BSA) + 0,5% de suero normal de cabra (NGS) con rotación constante de extremo a extremo (Figura 1D).
4. Retire el bloqueo e incube los cerebros con el anticuerpo primario seleccionado diluido adecuadamente en PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubar los cerebros durante la noche (14-16 h) a 4 °C con rotación constante.
   NOTA: Ejemplos de anticuerpos utilizados: anti-CadN de rata (dilución 1:50)¹⁴ para marcar glomérulos sinápticos y anti-GFP de pollo (1:1000)⁸ para marcar Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipetear el anticuerpo primario. Lave los cerebros 3 veces durante 20 minutos cada uno con PBST. Incubar cerebros con anticuerpos secundarios diluidos en PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS durante 2 h en RT con rotación constante.
   NOTA: Alternativamente, incubar los cerebros durante la noche (14-16 h) a 4 °C. Diluir anticuerpos en PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS; Anticuerpos secundarios utilizados aquí: 488 cabras anti-gallinas (1:250) y 546 cabras anti-ratas (1:250).
6. Pipetear los anticuerpos secundarios. Lave los cerebros 3 veces durante 20 minutos cada uno con PBST. Termine lavando los cerebros durante 20 minutos con PBS (Figura 1D).
7. Prepare portaobjetos de microscopio de vidrio (75 mm x 25 mm) añadiendo dos tiras finas de cinta adhesiva de doble cara al portaobjetos a una distancia de ~25 mm entre sí. Esto proporciona un espaciador para evitar aplastar los cerebros.
8. Pipetea ~10-15 μL de medio de montaje entre las dos tiras de cinta para montar los cerebros. Con una punta de pipeta P20 previamente enjuagada con PBST, transfiera los cerebros marcados al portaobjetos del microscopio (Figura 1E).
9. Una vez que se hayan transferido los cerebros, use un pincel fino para alinearlos, asegurándose de que los lóbulos de las antenas estén hacia arriba. Busque el lado que tiene la joroba arqueada, que contendrá los lóbulos de las antenas.
10. Una vez que los cerebros estén correctamente orientados, cúbralos con un cubreobjetos de vidrio (n.º 1.5H), asegurándose de que el cubreobjetos esté seguro en la cinta. A continuación, rellene los lados del cubreobjetos con un medio de montaje adicional (Figura 1E).
11. Sella los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje que el portaobjetos se seque completamente y luego guárdelo en el refrigerador para obtener imágenes posteriores.

4. Imagen confocal

1. Ciega todas las láminas cerebrales tanto al genotipo como a las condiciones de experiencia antes de la obtención de imágenes marcando la lámina con una etiqueta codificada para su posterior decodificación.
2. Utilice un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 63x. Utilizamos un microscopio Zeiss 510 META en todas las imágenes que se muestran aquí (Figura 1F).
3. Utilice líneas láser apropiadas para los fluoróforos empleados. En este caso, se utiliza un láser Argon 488 y HeNe 543 para obtener imágenes de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal y de las neuronas sensoriales olfativas Or42a (Figura 2).
4. Determine la ganancia y el desplazamiento óptimos para ambos canales, manteniendo idealmente la ganancia para ambos canales <750 y el desplazamiento ≈0. Esto se hace para garantizar que la relación señal-ruido sea óptima al tiempo que se limita el fondo.
5. Coloque las imágenes en el centro del cerebro. Al tomar imágenes, los glomérulos VM7 residen proximalmente al orificio que queda en el centro del cerebro después de la extirpación del esófago durante la disección (Figura 2A).
   NOTA: Los glomérulos VM7 siempre estarán cerca de la abertura del esófago. Sin embargo, la ubicación y el tamaño exactos varían ligeramente en función de la disección del cerebro y las diferencias de montaje, así que tenga esto en cuenta al tomar imágenes.
6. Seleccione la resolución de imagen y el grosor óptico del corte. En este caso, se utiliza una resolución de 1024 x 1024 con un grosor de corte de pila Z de 0,37 μm.
7. Tome una proyección confocal completa de la pila Z a través del lóbulo antenal, asegurando la captura de la inervación completa de la neurona Or42a de los glomérulos VM7.

5. Mediciones sinápticas

1. Cargue la imagen cegada por genotipo/condición en Fiji (1.54f). Divida los canales de línea láser haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales.
2. En el canal sensorial olfativo Or42a, determine qué cortes contienen la inervación de Or42a desplazándose por la totalidad de la pila Z, identificando dónde comienza y termina la fluorescencia.
3. Cree una proyección de segmentos de suma que incluya solo segmentos que contengan inervación de neuronas Or42a haciendo clic en Imagen > Pilas > Proyecto Z > Segmentos de suma e ingresando el rango deseado.
4. En Fiji, haga clic en la herramienta Lazo en la barra superior para trazar el contorno de la inervación de las neuronas Or42a en el glomérulo VM7, tratando cada glomérulo del lado del cerebro de forma independiente (Figura 3).
5. Multiplique la circunferencia por el número de cortes de la pila Z y el grosor de cada corte para obtener el volumen de inervación del glomérulo sináptico VM7. Para cuantificar el número de sinapsis, se puede utilizar la herramienta encontrar máximos junto con la macro encontrar pilas de máximos para contar los puntos de sinapsis en la región descrita ^8,15.

Resultados

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para los métodos de imagen cerebral, exposición a odorantes y período crítico dependientes de la experiencia olfativa. El protocolo comienza con la coincidencia de edad de las pupas oscuras de farato inmediatamente antes de la eclosión (Figura 1A). Las pupas se colocan en cámaras odoríferas durante 4 h, y luego los adultos recién encerrados se voltean a viales nuevos en las cámaras odoríferas del vehículo o en las cámaras odoríferas EB dosificadas (Figura 1B). Por lo general, nos exponemos al odorante durante 24 horas, aunque es posible cualquier duración. Después de la exposición al odorante, la disección del cerebro comienza retirando la cabeza del tórax y luego retirando el exoesqueleto de la cutícula con pinzas finas (Figura 1C). El cerebro aislado se limpia de cualquier tejido asociado que pueda interferir con la imagen y luego se fija inmediatamente en paraformaldehído al 4% y sacarosa al 4% en PBS. Una solución corta de 30 minutos es suficiente para una buena integridad del tejido cerebral. El protocolo inmunocitoquímico comienza con un bloqueo de 1 h (p. ej., BSA, NGS), incubación nocturna en anticuerpos primarios (p. ej., anti-GFP, -CadN) y luego una breve incubación de 2 h en anticuerpos secundarios (Figura 1D). Los cerebros marcados se montan en portaobjetos de vidrio debajo de cubreobjetos sellados con la superficie dorsal del cerebro hacia arriba para obtener una mejor imagen de los lóbulos antenales (Figura 1E). Tenga en cuenta que todas las muestras se ciegan tanto al genotipo como a las condiciones de experiencia marcando el portaobjetos con una designación codificada para su posterior decodificación. Se utiliza un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 63x para obtener imágenes de los lóbulos de las antenas centrales del cerebro (Figura 1F). Se seleccionan líneas láser óptimas para los fluoróforos utilizados (por ejemplo, Argon 488 y HeNe 543) para obtener imágenes de la inervación de las neuronas sensoriales olfativas Or42a de VM7 en el contexto de los glomérulos circundantes.

Es importante seleccionar la ganancia, el desplazamiento, la resolución de imagen y el grosor de corte óptico óptimos para capturar toda la proyección de la pila Z de la inervación de las neuronas Or42a en los glomérulos VM7. Todos los genotipos y condiciones de experiencia que se van a comparar se visualizan con idénticos ajustes de microscopio. Las pilas Z se procesan utilizando el software ImageJ con cambios dependientes de la experiencia evaluados principalmente por el volumen de inervación ^7,14. Hay dos formas en las que se han calculado las mediciones volumétricas. Se calcula el área de inervación rebanada por rebanada utilizando la función de lazo ImageJ y luego se multiplica cada valor por el grosor de cada rebanada (μm)^8,9. El otro utiliza proyecciones Z de suma de segmentos y multiplica el número de segmentos de pila Z por el grosor del segmento para determinar el volumen promedio. Ambos métodos dan resultados consistentes. Además de las mediciones de volumen, la intensidad de fluorescencia también se puede evaluar con la proyección de intensidad máxima de VM7 glomérulos¹⁶. La suma ponderada de todos los píxeles se evalúa a través de la proyección máxima de corte de suma de ImageJ, con el número de píxeles en cada nivel de intensidad sumado para calcular la intensidad general ^8,9. El fondo se puede restar cuantificando una región extraglomerular de tamaño idéntico. Este método de sustracción requiere más tiempo pero es más preciso, ya que tiene en cuenta los diferentes niveles de marcaje de anticuerpos de fondo en cada muestra de cerebro para producir una cuantificación más representativa de los valores de intensidad de fluorescencia de inervación. Las mediciones de intensidad se realizan en un rango típico de 18-30 cortes ópticos (0,37 μm/corte) dentro de una pila Z, promediada para cada cerebro¹⁶. En casi todos los casos, las mediciones de intensidad y volumen de fluorescencia por inervación dan resultados consistentes.

En todas las modalidades de medición, los resultados representativos siguen siendo inquebrantables; La experiencia temprana con el odorante EB resulta en una pérdida significativa de la inervación de las neuronas Or42a. El glomérulo VM7 puede identificarse de forma fiable por su tamaño, forma y ubicación, entre otros glomérulos olfativos del lóbulo antenal mapeados con precisión (Figura 2A) y por la expresión dirigida de la marca de membrana Or42a-mCD8::GFP acoplada al marcaje glomerular con cadherina antineural (CadN; Figura 2B). La exposición programada al control del vehículo odorante (aceite mineral) da como resultado una inervación de las neuronas Or42a indistinguible de la de un animal normal no tratado. Aun así, la experiencia con el odorante EB en los primeros días después de la eclosión (dpe) provoca la poda sináptica de los glomérulos (Figura 2C). Este mecanismo de poda está totalmente restringido al breve período crítico de los primeros años de vida ^8,10. Por lo general, ahora utilizamos exposiciones a odorantes de 24 h para evaluar la poda sináptica de los glomérulos VM7 y la disminución resultante en el volumen de inervación en el cerebro juvenil de Drosophila. Una exposición de 24 h (0-1 dpe) al control del vehículo odorante (aceite mineral) mantiene la inervación normal y densa de Or42a-mCD8::GFP (verde) en los glomérulos sinápticos VM7 (círculos discontinuos blancos) en ambos lóbulos antenales del hemisferio cerebral (Figura 2D, izquierda). En contraste, la exposición de 24 horas (0-1 dpe) al 25% de olor EB disuelto en el aceite mineral da como resultado una fuerte poda de la inervación de Or42a-mCD8::GFP (verde) y una pérdida del volumen glomerular sináptico (Figura 2D, derecha). Estos resultados son visualmente obvios y consistentemente claros. Uno de los mayores atributos de este protocolo de experiencia odorífera es la claridad de los resultados de las imágenes cerebrales, que también son extremadamente susceptibles a cuantificaciones directas de inervación, fluorescencia, intensidad y volumen.

La principal ventaja de este protocolo de experiencia odorífera es la capacidad de aprovecharlo para el estudio de la restricción temporal y los mecanismos dependientes de la dosis odorífera durante la poda sináptica del período crítico. Para la eliminación de sinapsis de la neurona Or42a impulsada por EB en el glomérulo VM7, el mecanismo de remodelación se restringe principalmente a los juveniles tempranos (0-2 dpe), sin poda sináptica detectable dependiente de la experiencia en la madurez (7-9 dpe), excepto una modulación menor en los niveles más altos de exposición a EB⁸. Tal restricción temporal define un período crítico, y la comprensión de este mecanismo de tiempo es un objetivo importante. Otro atributo de este protocolo es que la poda sináptica dependiente de la experiencia depende de la dosis de EB (Figura 3). La exposición programada al control del vehículo odorante (aceite mineral) con odorante 0% EB da como resultado una inervación normal de las neuronas Or42a del glomérulo sináptico VM7, que es indistinguible de un animal no tratado. El cálculo del volumen tridimensional de inervación de la neurona Or42a muestra un tamaño típico de un cerebro juvenil normal (2260 μm³; Figura 3A, izquierda). Los resultados representativos muestran que el aumento de la concentración de odorante EB provoca una poda de glomérulos sinápticos progresivamente mayor. Por ejemplo, una exposición de 24 horas (0-1 dpe) al 15% de olor EB da como resultado una pérdida de inervación clara y consistente (Figura 3A, centro). La cuantificación del volumen de inervación 3D muestra una reducción sorprendente en comparación con los controles del vehículo (760 μm³ frente a 2260 μm³). Una exposición de 24 h (0-1 dpe) al 25% de olor EB causa aún más pérdida de inervación (281 μm³; Figura 3A, derecha). Las cuantificaciones representativas para este rango de concentraciones de odorante EB muestran resultados consistentes para la intensidad de fluorescencia (Figura 3B) y el volumen de inervación (Figura 3C). Esta dependencia de la dosis permite el estudio de los medios para prevenir la poda sináptica, así como mejorar la poda con exposiciones más bajas a los odorantes para demostrar una mayor remodelación sináptica de los glomérulos. Algunos estudios previos han demostrado el efecto contrario al aumento del volumen glomerular utilizando otros odorantes con este protocolo¹⁰. La exposición al odorante EB en el período crítico siempre resulta en una poda de glomérulos sinápticos impactante y fácilmente detectable.

Figura 1: Diagrama de flujo de los estudios de exposición a olores en el cerebro juvenil de Drosophila . (A) Las pupas oscuras de farato (90+ h después de la puparición a 25 °C) se recogen y se colocan en cámaras odoríferas. En condiciones de olor, se permiten 4 h para la eclosión, y luego las moscas juveniles se transfieren a un vial nuevo. (B) Las moscas de la misma edad se dividen en las condiciones de control del vehículo (100% de aceite mineral) o de butirato de etilo (EB; % v/v en aceite mineral). Una malla de alambre fina (recuadro) permite el acceso al odorante. Por lo general, las moscas se exponen durante 20 horas adicionales para un total de 24 horas de exposición, 0-1 día después de la eclosión (dpe). (C) Las moscas se diseccionan quitando primero la cabeza, y luego se utilizan pinzas finas para quitar delicadamente el exoesqueleto de la cutícula y aislar el cerebro juvenil. El cerebro aislado se limpia de todos los tejidos circundantes y de la tráquea que sobresale. (D) Los cerebros aislados se fijan, se bloquean y luego se incuban secuencialmente en anticuerpos primarios y secundarios. La gama de anticuerpos utilizados suele incluir una sonda de membrana general para revelar los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal y una sonda de membrana específica para las neuronas sensoriales olfativas Or42a. (E) Los cerebros marcados se colocan en un medio de montaje en un portaobjetos de microscopio de vidrio con espaciadores de cinta debajo de un cubreobjetos sellado. La orientación correcta del cerebro (superficie dorsal hacia arriba) es fundamental para obtener imágenes óptimas de los lóbulos antenales. (F) Los cerebros se visualizan utilizando un microscopio fluorescente confocal de barrido láser. Todas las muestras se ciegan al genotipo y experimentan condiciones previas a la obtención de imágenes y a los análisis cuantificados posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Poda de glomérulos sinápticos del período crítico dependiente de la experiencia odorante. (A) Los glomérulos olfativos del lóbulo antenal (AL) se mapean con precisión. Se muestran algunos glomérulos sinápticos representativos. La clase de neuronas sensoriales olfativas (OSN) del receptor Or42a inerva específicamente los glomérulos VM7. (B) Las neuronas marcadas con Or42a-mCD8::GFP (verde) inervan densamente los glomérulos VM7 emparejados en los lados izquierdo (L) y derecho (R) del cerebro, con el marcaje de anticuerpos N-Cadherina (CadN) de todos los glomérulos sinápticos AL (magenta). La línea de mosca es w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Representación gráfica esquemática de la inervación OSN Or42a de los glomérulos sinápticos VM7 en la condición de control del vehículo (100% de aceite mineral; izquierda) y exposición al butirato de etilo (% EB v/v en aceite mineral; derecha) durante el período crítico juvenil. La poda de inervación dependiente de la experiencia solo ocurre con la exposición temprana a EB, con las sinapsis eliminadas y los axones perdidos, lo que resulta en una reducción del volumen de inervación. (D) Imágenes confocales representativas de la inervación OSN de Or42a de los glomérulos sinápticos VM7 emparejados (círculos de contorno blanco discontinuos; Or42a-mCD8::GFP, verde) después del control del vehículo de petróleo (izquierda) y una exposición al 25% de EB (derecha) durante 24 h (0-1 dpe). La experiencia odorífera de EB impulsa la poda sináptica y la pérdida de volumen de inervación. Este mecanismo dependiente de la experiencia está temporalmente restringido y transitoriamente reversible solo dentro de un período crítico olfativo bien definido en los primeros días después de la eclosión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cuantificación de la inervación de los glomérulos sinápticos dependientes de la dosis de EB, intensidad y volumen de fluorescencia. (A) Inervación marcada con Or42a-mCD8::GFP en un glomérulo sináptico VM7 (verde) expuesto de 0-1 dpe al control de aceite mineral del vehículo odorante (0% EB, izquierda), 15% EB (centro) o 25% EB (derecha). Abajo: Las mismas imágenes con la inervación glomerular delineada (círculos blancos) y el volumen de inervación tridimensional calculado. El vehículo de control tiene inervación del glomérulo sináptico VM7 por neuronas Or42a que es indistinguible de los animales no tratados. La experiencia del período crítico con una exposición al 15% del odorante EB da como resultado una poda evidente del glomérulo sináptico, con una disminución del 66% en el volumen de inervación tridimensional en este caso. La exposición al nivel más alto de 25% de EB resulta en una mayor poda, con una pérdida de casi el 90% del volumen del glomérulo sináptico en este caso. Por lo tanto, se puede imaginar la poda dependiente de la dosis a medida que aumenta la experiencia del olor. (B) Resultados representativos de la intensidad de fluorescencia marcada con Or42a-mCD8::GFP dentro de los glomérulos sinápticos VM7 expuestos de 0-1 dpe al control del vehículo odorante (aceite, verde), 15% EB (medio, naranja) o 25% EB (derecha, negro). (C) Resultados representativos de los volúmenes de inervación tridimensional de los glomérulos VM7 en las mismas condiciones de exposición al odorante del período crítico. Los diagramas de dispersión muestran todos los puntos de datos individuales con la media ± SEM. La significación se indica como p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) y p ≤ 0,0001 (****). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La exposición a olores y el protocolo de imágenes cerebrales presentados aquí se pueden utilizar para inducir y cuantificar de manera confiable la poda de glomérulos sinápticos de las neuronas sensoriales olfativas dependientes de la experiencia durante un período crítico en los primeros años de vida. Los estudios anteriores que utilizaron este paradigma de tratamiento para explorar la remodelación del circuito olfativo comenzaron la exposición al odorante el^{segundo día después} de la eclosión ^3,4,5. Por el contrario, comenzamos la exposición al odorante en las pupas de fanato antes de la eclosión adulta y encontramos que la gran mayoría de la remodelación ocurre dentro de las primeras 24 h después de la eclosión ^8,9. Por lo tanto, un paso esencial en este protocolo de exposición al odorante es colocar pupas oscuras en etapas en cámaras de olor antes de la eclosión (Figura 1). Esto no es para la exposición al odorante de la pupa per se, sino más bien para asegurar la exposición al odorante inmediatamente después de la eclosión adulta. Se seleccionaron adultos juveniles cerrados 4 h después de la estadificación para sincronizar las edades dentro de una ventana temporal ajustada y evitar diferencias en los tiempos de exposición al odorante. Este intervalo de experiencia más temprano está en línea con estudios recientes que demuestran que la habituación al olfato de EB se cierra después de solo 2 días después de la eclosión¹⁰. Sin embargo, las consecuencias de las diferencias en el tiempo de exposición a los odorantes dentro del período crítico (por ejemplo, 0-1 vs. 1-2 días) no han sido bien caracterizadas. Las neuronas sensoriales olfativas Or42a inervan selectivamente el glomérulo VM7 en el lóbulo antenal, que se identifica fácilmente en función de los mapas glomerulares precisos y el etiquetado de inervación dirigida (p. ej., Or42a-mCD8::GFP; Figura 2). La exposición al odorante EB durante el período crítico no altera la expresión del promotor de Or42a ni los niveles de reportero⁸. La exposición programada a un odorante provoca la eliminación secuencial de la sinapsis y la pérdida de inervación de los axones de las neuronas receptoras Or42a. Esta poda es completamente reversible dentro del período crítico temprano de vida (0-2 dpe), pero no en la madurez adulta (7-9 dpe), cuando los cambios en el ambiente odorante ya no alteran la inervación. La estricta restricción temporal de este mecanismo dependiente de la experiencia sensorial es una de las principales cuestiones pendientes en el campo. Se están haciendo muchos intentos para reabrir la plasticidad de un período crítico en la madurez. El protocolo que se da aquí es una poderosa vía para la investigación.

La facilidad de la exposición al odorante y el protocolo de imágenes cerebrales descrito aquí permite una amplia accesibilidad y una amplia adaptabilidad. El inicio, la terminación y la duración de la experiencia de exposición al odorante quedan completamente a discreción del investigador para permitir estudios específicos de las propiedades del período crítico, la reversibilidad de la remodelación y la reapertura de la plasticidad similar al período crítico. Del mismo modo, la intensidad de la experiencia odorífera puede manipularse fácilmente para el estudio de la poda de glomérulos sinápticos dependiente de la dosis (Figura 3). Es importante destacar que los estudios que utilizan concentraciones más bajas de EB (p. ej., 15% de EB) se pueden utilizar para probar manipulaciones que podrían mejorar la tasa o el alcance de la remodelación sináptica de los glomérulos. Por ejemplo, los resultados podrían mostrar que la poda sináptica a niveles más bajos de EB (p. ej., 15%) es indistinguible de los niveles más altos de EB (p. ej., 25%). A través de diferentes manipulaciones, los resultados se pueden comparar con la inervación constante de los controles del vehículo odorante y la poda robusta de los glomérulos sinápticos que ocurre al 25% de EB (Figura 3). Una limitación de este método es que la exposición al odorante depende completamente de la volatilidad del odorante disuelto. Factores variables como la temperatura y la humedad relativa afectan la efectividad de la exposición al odorante⁸. La densidad de moscas en las cámaras odoríferas también podría afectar potencialmente la exposición al odorizante, por ejemplo, a través de la producción de odorantes derivados de moscas. Se recomienda una densidad de no más de 20-25 moscas por vial. La concentración de odorante requerida para inducir una poda sináptica muy fuerte de los glomérulos es probablemente más alta de lo que se experimenta típicamente en la naturaleza^10,17. Se requerirían técnicas de imagen de resolución mucho más alta para analizar la eliminación de sinapsis a concentraciones de odorantes más bajas. Sin embargo, el protocolo actual permite estudios consistentes y confiables para una variedad de manipulaciones.

Hay inmensos beneficios en este protocolo de exposición a odorantes e imágenes cerebrales. Drosophila es un modelo animal enormemente ventajoso basado en un extenso y sofisticado conjunto de herramientas genéticas, que puede explotarse sistemáticamente para el estudio amplio de las interacciones gen-ambiente en la remodelación de circuitos olfativos de período crítico. Los ejemplos que se muestran aquí incluyen la línea controladora transgénica Or42a-Gal4, el marcador de membrana UAS-mCD8::GFP y la fusión directa Or42a-mCD8::GFP. No hay diferencias distinguibles entre la poda sináptica de glomérulos con los enfoques de marcaje directo de Or42a versus los de marcaje indirecto de Gal4/UAS ^8,9. El controlador Or42a-Gal4 proporciona la capacidad de manipular las neuronas receptoras olfativas objetivo y visualizar cambios dependientes de la experiencia en la inervación de VM7, mientras que la línea de fusión directa libera el sistema transgénico binario UAS-Gal4 para otras manipulaciones dirigidas a células. Muchas otras líneas mutantes y transgénicas del extenso conjunto de herramientas de Drosophila se pueden emplear para probar la restricción temporal y los mecanismos dependientes de la experiencia, incluida la identificación de células que median la poda sináptica, las vías de señalización intercelular que transmiten información de experiencia olfativa y la maquinaria intracelular necesaria para la eliminación de sinapsis dirigida. En general, este protocolo permite el interrogatorio sistemático de muchos mecanismos que impulsan la remodelación de los circuitos cerebrales dependientes de la experiencia olfativa. Este protocolo de exposición a olores e imágenes cerebrales también se puede utilizar para investigar la experiencia olfativa específica del período crítico, las modificaciones del comportamiento, las manipulaciones genéticas y farmacéuticas que pueden permitir la reapertura de la plasticidad crítica del período en la madurez y otros aspectos de la plasticidad del circuito olfativo más allá de la poda de los glomérulos sinápticos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
For Smell Exposure
Drosophila viales	Genesee Scientific	32-110
Butirato de etilo	Sigma Aldrich	E15701
Tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-129
Aceite mineral	Sigma Aldrich	M3516
Cámaras de olor	Glasslock
Pinceles	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Malla de alambre	Scienceware	378460000
Disección cerebral
190 pruebas	Decon Labs	2801	Diluido al 70%
Pinzas	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehído	Ciencias del Microscopio Electrónico	157-8	Diluido al 4%
Placas de Petri	Fisher Scientific	08-757-100B
Solución salina tamponada con fosfato	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluida a 1x
sacarosa	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Microscopio Electrónico Ciencias	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 cabra anti-pollo	Invitrogen	A11039
546 cabra anti-rata	Invitrogen	A11081
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9647
Pollo anti-GFP	Abcam	13970
Cubreobjetos	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Cinta adhesiva de doble cara	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Electron Microscope Sciences	17984-25
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Esmalte de uñas	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal suero de cabra	Sigma Aldrich	G9023
Rata anti-CadN	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	AB_528121
Confocal Confocal/Análisis
Cualquier ordenador/portátil
Microscopio confocal	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software	Fiji		Versión 2.14.0/1.54f