Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.
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Artículo de método
Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario
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Resumen
Resumen
Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Este proceso es crucial para el correcto funcionamiento del cerebro, y su desregulación puede dar lugar a trastornos del neurodesarrollo y psiquiátricos después del nacimiento. De hecho, se ha descubierto que muchos genes responsables de estas enfermedades están involucrados en este proceso y, por lo tanto, revelar cómo estas mutaciones afectan la dinámica celular es importante para comprender la patogénesis de estas enfermedades. Este protocolo introduce una técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales en cortes de cerebro obtenidos de embriones de ratón. Las células se marcan con proteínas fluorescentes mediante electroporación en el útero , que visualiza células individuales migrando desde la zona ventricular con una alta relación señal-ruido. Además, este sistema de transferencia de genes in vivo nos permite realizar fácilmente experimentos de ganancia o pérdida de función en los genes dados mediante co-electroporación de su expresión o vectores de knockdown/knockout. Utilizando este protocolo, se puede analizar el comportamiento migratorio y la velocidad de migración de las células individuales, información que nunca se obtiene de cerebros fijos.
Introducción
Durante el desarrollo de la corteza cerebral, la glía radial (apical) en la zona ventricular paleal (VZ) que recubre el ventrículo lateral produce primero neuronas y luego progenitores gliales con algún período de superposición1. Las neuronas también se generan a partir de progenitores intermedios o glía radial basal en la zona subventricular (SVZ) adyacente a la VZ, los cuales se originan en la glía radial (apical) 2,3. En ratones, las células gliales radiales producen solo neuronas en el día embrionario (E) 12-14, tanto neuronas como progenitores gliales en E15-16, y progenitores glia....
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Protocolo
El presente estudio se realizó con la aprobación y siguiendo las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación del Desarrollo, el Centro de Discapacidad del Desarrollo de Aichi (#2019-013) y la Universidad de Keio (A2021-030). Se obtuvieron comercialmente ratones ICR (de tipo salvaje) preñados cronometrados (véase la Tabla de Materiales). Para observar la relación entre las células migratorias y los vasos sanguíneos, se utilizaron ratones Flt1-DsRed, en los que las células endoteliales expresan DsRed22. Los ratones machos Flt1-DsRed se cruzaron con ratones hembra ICR (ambos ratones tenían en....
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Resultados
Las células gliales radiales en la VZ paleal producen solo neuronas hasta E14, y tanto las neuronas como las células gliales en E15 y E16. Para observar los comportamientos migratorios de las neuronas y las células gliales simultáneamente, las marcamos con GFP mejorada (EGFP) y RFP, respectivamente, utilizando un promotor específico de neurona, el promotor27 de Tα1, y el promotor28 de la proteína ácida fibrilar glial humana (hGFAP), que se activa preferentemente en.......
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Discusión
Este protocolo introdujo un método para la observación en lapso de tiempo de células derivadas de la VZ paleal (cortical). Para etiquetar las células migratorias de la VZ, utilizamos la electroporación en el útero, en la que las células individuales se marcaron claramente con una relación señal-ruido más alta que en el etiquetado mediado por vectores virales. Utilizando la electroporación intrauterina, cualquier tipo de vector en cualquier combinación puede introducirse fácilmente en las células gliales.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
El promotor de Tα1 es un regalo de P. Barker y F.D. Miller. El promotor Dcx es un regalo de Q. Lu. hGFAP-Cre fue un regalo de Albee Messing. El sistema vectorial de transposones PiggyBac fue proporcionado por el Instituto Sanger. Los ratones Flt1-DsRed fueron proporcionados por M. Ema (Universidad de Shiga). Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Subvención Número JP21K07309 a H. Tabata, JP20H05688 y JP22K19365 a K. Nakajima) y la Fundación de Ciencias Takeda, el Fondo Conmemorativo Keio Gijuku Fukuzawa para el Avance de la Educación y la Investigación, los Fondos de Desarrollo Académico Keio Gijuku para K. Nakajima.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Conjunto de tubo aspirador | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezol (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | 9 mm |
| B27 suplemento | Gibco | 17504-044 | |
| Butorfanol (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Inserto de cultivo celular | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Microscopio confocal | Nikon A1RHD25 | Equipado con una lente de larga distancia de trabajo (S Plan Fluor ELWD 20XC) | |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cámara de cultivo | Tokken | TK-NBCMP | Electroporador a medida |
| NEPA Gene | NEPA21 | ||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Mezclador de gas | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Plato | Iwaki | 3910-035 | El diámetro de la base de vidrio es de 27 mm |
| Capilares de vidrio | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Unidad de calefacción | Tokken | TK-0003HU20 | Hecho a medida, incluyendo campana y calentador |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | Un regalo de Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutamina (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Agarosa a baja temperatura de fusión | Lonza | 50100 | |
| Medetomidina (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microinyector | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Medio neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | El ADNc de hyPBasa de pCMV-hyPBasa (un regalo del Instituto Sanger) se insertó en el promotor CAG de pCAGGS (un regalo de J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | El promotor Dcx de Dcx4kbEGFP70 (un regalo de Q. Lu) se intercambió con el promotor CAG de pCAG-NLS-HA-Dre34 (un regalo de Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicilina + estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Kit de purificación de plásmidos | Invitrogen | PureLink HiPure plásmido kit midiprep (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL de pCALNL-DsRed (un regalo de Connie Cepko, Addgene #13769) y el ADNc TurboRFP (Evrogen, FP232) se insertaron en el sitio de clonación de pPB-CAG.EBNXN (un regalo del Instituto Sanger). | ||
| secuencia que contiene sitios de rox sintéticos, casete de DIO sintético y ADNc de EGFP de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) en dirección inversa se insertaron en el sitio de clonación de pPB-CAG.EBNXN (un regalo del Instituto Sanger). La secuencia se proporciona en el Archivo Complementario. | |||
| Tirador | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | un plugin para ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Aguja de sutura | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 círculo, longitud 14 mm |
| Hilo de sutura | Nazme | C-23-B2 | Seda, tamaño 5-0 |
| Ratones ICR (tipo salvaje) embarazadas cronometradas Ratón | |||
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Electrodo tipo pinza | BEX o NEPA Gene CUY650P5 | ||
| T&alfa; El ADNc de EGFP 1-EGFP | de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) se insertó en el flujo descendente del Tα 1 promotor en plásmido 253 (regalo de P. Barker y F.D.Miller) | ||
| Microtomo vibratorio | Leica o Zeiss | Microtomo de cuchilla vibratoria VT1000S o Hyrax V50. |
Referencias
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric d....
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Reimpresiones y permisos
