Artículo de método

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

DOI:

10.3791/66653

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18 de octubre de 2024

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1Department of Anatomy and Neurobiology, National Defense Medical College, 2Department of Pharmacology, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se desarrolló un método para visualizar la extravasación del tinte debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) mediante la administración de dos tintes fluorescentes a ratones en diferentes puntos de tiempo. El uso de glicerol como crioprotector facilitó la inmunohistoquímica en la misma muestra.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tintes fluorescentes se utilizan para determinar el grado de extravasación del tinte que se produce debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB). El marcaje con estos colorantes es un proceso complejo influenciado por varios factores, como la concentración de colorantes en la sangre, la permeabilidad de los vasos cerebrales, la duración de la extravasación del tinte y la reducción de la concentración de colorantes en el tejido debido a la degradación y difusión. En un modelo de lesión cerebral traumática leve, la exposición a las ondas de choque inducidas por explosiones (BSW) desencadena la ruptura de la BHE dentro de un período de tiempo limitado. Para determinar la secuencia precisa de la degradación de la BBB, se inyectó azul de Evans e isotiocianato-dextrano de fluoresceína por vía intravascular e intracardíaca en ratones en varios puntos de tiempo relacionados con la exposición a BSW. A continuación, se registró la distribución de la fluorescencia del colorante en los cortes de cerebro. Las diferencias en la distribución e intensidad entre los dos colorantes revelaron la secuencia espacio-temporal de la ruptura de la BBB. La inmunotinción de los cortes de cerebro mostró que las respuestas astrocíticas y microgliales se correlacionaron con los sitios de descomposición de la BBB. Este protocolo tiene un amplio potencial de aplicación en estudios que involucran diferentes modelos de desglose de BBB.

Introducción

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La ruptura y disfunción de la barrera hematoencefálica (BBB) es causada por inflamación sistémica, infecciones, enfermedades autoinmunes, lesionesy enfermedades neurodegenerativas. En el traumatismo craneoencefálico leve (TCEm) resultante de la exposición a ondas de choque inducidas por explosiones (BSW), se ha observado una correlación significativa entre la intensidad de las BSW y la cantidad de fuga de colorante fluorescente debido a la degradación de la BHE 2,3,4. Una característica notable de la degradación de la BHE en el TCE leve es que comienza inmediatamente o a las pocas horas después de la exposición a los BSW y suele ser un proceso transitorio que dura aproximadamente una semana antes de que surjan trastornos neurológicos crónicos tardíos 3,5,6,7. Aunque los detalles siguen sin estar claros, la degradación de la BHE es parte de la cascada patológica de larga duración y también puede servir como factor pronóstico en el mTBI6. Por lo tanto, es importante comprender las distribuciones espaciales y temporales de la descomposición de la BHE en el cerebro.

Los tintes fluorescentes se utilizan para determinar el grado de descomposición de la BBB 3,8. Debido a que la concentración sanguínea de los tintes y la magnitud y el alcance de la descomposición de la BHE cambian con el tiempo, se requiere precaución al interpretar las imágenes de la extravasación del colorante. Por ejemplo, la ausencia de extravasación del tinte no indica necesariamente la ausencia de descomposición de la BBB. Es posible que no se detecte una descomposición de la BHE antes o después de un aumento en la concentración del tinte en la sangre. Incluso si el tinte se acumuló con éxito donde ocurrió la descomposición de BBB, es posible que se haya perdido con el tiempo después de que cesó la descomposición. En general, las sustancias solubles en agua y biológicamente inertes se excretan rápidamente en la orina9. Por lo tanto, para determinar si la descomposición de la BHE se produce en un momento específico, los resultados más fiables se obtienen cuando se administra un colorante fluorescente en el torrente sanguíneo durante un corto período inmediatamente antes de fijar al animal. De esta manera, se debe utilizar el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano disponible en el mercado con un peso molecular específico.

El azul de Evans es un colorante azoico azul ampliamente reconocido con una fuerte afinidad por la albúmina sérica. El colorante exhibe fluorescencia roja cuando es excitado por la luz verde en los sistemas biológicos2. Debido a su naturaleza inerte, el complejo albúmina azul-sérica de Evans permanece en la sangre hasta 2 h, lo que lo convierte en un trazador útil de 69 kDa para marcar regiones con una BHE comprometida durante al menos esta duración 10,11. Por lo tanto, es importante tener en cuenta las posibles incertidumbres en torno a la farmacocinética y la toxicidad del azul de Evans9. Sin embargo, un estudio reciente mostró que el azul de Evans continúa acumulándose en áreas donde la BBB está ausente o alterada7. Esta característica permitió a Evans Blue registrar el historial de la avería de la BBB, mientras que FITC-dextrano se utilizó para registrar la avería de la BBB en un momento específico después de la exposición a la BSW. Aunque el azul de Evans puede administrarse por vía intravenosa ointraperitoneal 10, se prefiere la administración intravenosa para los experimentos sensibles al tiempo. Este estudio tuvo como objetivo demostrar el uso del azul de Evans y el dextrano FITC para detectar la distribución espacio-temporal de la degradación de la BHE tras la exposición a BSW.

En segundo lugar, el estudio presentó una técnica para congelar cortes de cerebro después de observar la fluorescencia de la descomposición de BBB y preparar cortes más delgados adecuados para procedimientos inmunohistoquímicos. El uso de glicerol como medio de montaje y crioprotector simplifica el proceso de inmunohistoquímica. Al comparar las imágenes de la degradación de la BHE con las de la inmunohistoquímica, la distribución espacio-temporal de la degradación de la BHE se puede correlacionar con la respuesta tisular de la misma muestra.

Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas para experimentos con animales establecidas por el Colegio Médico de Defensa Nacional (Tokorozawa, Japón). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (aprobación n.º 23011-1). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 8 semanas de edad y entre 19 y 23 g de peso. Como se ilustra en la Figura 1, se realizó una única inyección de azul de Evans y perfusión de FITC-dextrano en varios puntos temporales en relación con una sola exposición a BSW. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Anestesia

NOTA: Se trata de un protocolo modificado que aumenta la cantidad de medetomidina 2,5 veces en comparación con el original12. Las dosis de clorhidrato de medetomidina, midazolam y butorfanol fueron de 0,75 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente.

  1. Prepare una mezcla de clorhidrato de medetomidina (75 μg/mL), midazolam (400 μg/mL) y butorfanol (500 μg/mL) en solución salina fisiológica.
  2. Administrar la mezcla por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón (10 μL/g)13.
  3. Después de aproximadamente 5-10 minutos, verifique que haya suficiente anestesia observando la falta de pinzamiento de la cola y los reflejos de retirada del pedal.
  4. Mantenga el ratón caliente hasta que se recupere de los efectos de la anestesia.

2. Exposición a BSW

NOTA: En este estudio se utilizó un tubo de choque interno14.

  1. Anestesia al ratón como se describe en el paso 1.
  2. Coloque el ratón a 5 cm del extremo de salida del tubo de choque, asegurándose de que el eje de su cuerpo esté paralelo al eje del tubo, pero no alineado con él.
  3. Proporcione una sola exposición BSW con una sobrepresión máxima de 25 kPa a la cabeza.
    NOTA: Mantenga el ratón caliente hasta que se recupere de los efectos de la anestesia. Supervise regularmente el estado del ratón tratado. Si se observan signos de angustia, como dificultad para alimentarse o beber, encorvarse o una apariencia anormal prolongada sin signos de recuperación, eutanasia al ratón y finalizar el experimento antes de tiempo. Evite administrar analgésicos, ya que pueden afectar potencialmente la respuesta glial.

3. Inyección de azul Evans en la vena de la cola

NOTA: La solución azul de Evans debe administrarse por vía intravenosa sin anestesia. En presencia de anestesia, el tinte a menudo no penetra lo suficiente en el cuerpo, probablemente debido a la disminución de la presión arterial y la temperatura corporal13. El azul de Evans se administró a una dosis de 100 mg/kg.

  1. Prepare la solución azul de Evans (4% p/v en solución salina) en un microtubo, luego en un vórtice y guárdela en la oscuridad antes de usarla.
  2. Inyectar la solución en la vena de cola (2,5 μL/g)13.

4. Perfusión transcárdica con solución y fijación de FITC-dextrano

  1. Agregue heparina a la solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una concentración de 1 U/mL, luego agregue FITC-dextrano al PBS heparinizado para lograr una concentración de 3 mg/mL.
  2. Disuelva completamente el polvo de FITC-dextrano antes de usar. Para hacer esto, agite suavemente la solución durante 30 minutos o más. Antes de usar, compruebe cuidadosamente si hay polvo de FITC-dextrano no disuelto. Si queda algo, continúe agitando hasta que se disuelva por completo.
  3. Anestesia al ratón como se describe en el paso 1.
  4. Continuar con el protocolo estándar de fijación de perfusión utilizando una bomba peristáltica 15,16. En primer lugar, perfundir con PBS heparinizado que contenga FITC-dextrano durante 2 min a una velocidad de 4,0 mL/min. A continuación, perfundir con una solución tampón neutra de formalina al 10% o paraformaldehído-PBS al 4% durante 2 min a una velocidad de 4,0 mL/min, seguido de 8 min a una tasa de 3,5 mL/min.
  5. Extraer cuidadosamente el cerebro con tijeras quirúrgicas y pinzas15,16. Después de la disección, fije el cerebro durante la noche en el mismo fijador (es decir, una solución tampón de formalina neutra al 10% o paraformaldehído-PBS al 4%) a 4 °C.
  6. Al día siguiente, reemplace el fijador por PBS.

5. Procesamiento del tejido cerebral

NOTA: Incluso si la fijación de perfusión es completa, el azul de Evans y el FITC-dextrano pueden dispersarse en el tampón. Por lo tanto, los procedimientos que conducen al paso 6.8 deben completarse dentro de una semana después de la fijación por perfusión. Además, evite exponer la muestra a la luz.

  1. Prepare una placa de 24 pocillos con 500 μL de glicerol al 20% en tampón de fosfato (PB; pH 7,4) en cada pocillo.
  2. Con una cortadora de cerebros, corte el cerebro coronalmente en 12 rodajas, cada una de 1 mm de grosor.
  3. Transfiera cada rebanada al pocillo correspondiente de la placa de 24 pocillos y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
  4. Sustituya la solución por glicerol-PB al 50% y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
  5. Finalmente, reemplace la solución con glicerol al 100%. Para una observación microscópica inmediata, deje reposar las rodajas durante al menos 2 h a temperatura ambiente o guárdelas a 4 °C. Las rebanadas ahora serán translúcidas y estarán listas para la observación microscópica.

6. Medición de fluorescencia de la extravasación del colorante

NOTA: La eficiencia del etiquetado de fluorescencia varía de un ratón a otro. Por lo tanto, es necesario normalizar la intensidad de la fluorescencia. Los valores de fluorescencia se expresan en relación con los del núcleo reticular gigantecelular (GRN) porque esta región se ve mínimamente afectada por el tratamiento con BSW.

  1. Añade 500 μL de glicerol al fondo de un plato con fondo de cristal de 35 mm.
  2. Transfiera la rodaja a la solución de glicerol y cubra su superficie con un cubreobjetos.
  3. Retire el exceso de glicerol del borde del cubreobjetos.
  4. Mida la intensidad de fluorescencia del corte bajo un microscopio de fluorescencia.
  5. Después de la medición microscópica, devuelva la rebanada al pocillo.
  6. Repita la medida para las 12 rebanadas.
  7. Agregue 500 μL de PB a cada pocillo y almacene la placa de 24 pocillos a 4 °C durante la noche; al día siguiente, las rodajas estarán saturadas con un 50% de glicerol-PB.
  8. Sustituya la solución por glicerol-PB al 30% y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
  9. Realice los procedimientos del paso 7 en unas pocas semanas.

7. Crioseccionamiento e inmunohistoquímica

  1. Prepare una placa de 24 pocillos agregando 1000 μL de una mezcla de volúmenes iguales de medio de congelación de tejidos y 30% de glicerol-PB al pocillo 1. A continuación, añadir 1000 μL de medio de congelación de tejidos al pocillo 2.
  2. Transfiera la loncha al pocillo 1 y agite el plato a 4 °C durante 1 h.
  3. Transfiera la loncha al pocillo 2 y agite el plato a 4 °C durante 1 h.
  4. Congele rápidamente la rebanada con isopentano usando hielo seco, teniendo cuidado de no doblar la rebanada. Almacene las rodajas a -80 °C hasta la criosección.
  5. Crioseccione el corte hasta un grosor de 6 μm. Después del secado en el portaobjetos del microscopio, almacene las secciones a -80 °C.
  6. Para la recuperación del antígeno17, sumerja las secciones en citrato de sodio 10 mM (pH 6,0), caliente a 100 °C una vez y luego manténgalo a 98 °C durante 1 h.
  7. Lave las secciones abundantemente en agua destilada. Las secciones ya están listas para la tinción inmunohistoquímica.

Resultados

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La Figura 1A muestra el curso temporal de la inyección de colorante en relación con el inicio de BSW, con una sobrepresión máxima de 25 kPa. En el protocolo 'Post', la solución azul de Evans se administró por vía intravascular 2 h antes de la perfusión con FITC-dextrano, que se llevó a cabo 6 h, 1 día, 3 días y 7 días después de la exposición a BSW. En el protocolo 'Pre', la solución azul de Evans se inyectó inmediatamente antes de la exposición a BSW. En el protocolo 'Post', se espera que la concentración de azul de Evans alcance su máximo aproximadamente 2 h antes de la fijación de la perfusión, mientras que en el protocolo 'Pre', se espera que alcance su máximo alrededor del momento de la exposición a BSW (Figura 1B). La concentración de FITC-dextrano en los vasos sanguíneos cerebrales se mantuvo constante durante 2 min durante la perfusión.

El etiquetado azul de Evans mostró que la degradación de la BHE comenzó dentro de las 6 horas y continuó hasta 7 días después de la exposición a BSW (Figura 2A). En particular, la ruptura de la BBB no se produjo inmediatamente después de la exposición a BSW, ya que no hubo extravasación del colorante azul de Evans a las 3 h en el protocolo 'Pre' (Figura 2B). Sorprendentemente, el etiquetado a largo plazo con azul de Evans indicó su naturaleza acumulativa en el protocolo 'Pre' (Figura 2B)7.

El uso de dos colorantes distintos, cada uno introducido a intervalos de 2 h o más, permitió examinar los cambios temporales en la integridad de la BHE comparando su distribución. La Figura 3 muestra imágenes de fluorescencia de las rodajas que exhibieron una diferencia significativa en la distribución del azul de Evans y el FITC-dextrano.

Se observaron numerosos puntos calientes de fluorescencia de varios tamaños. Aunque algunos puntos calientes eran lo suficientemente brillantes como para clasificarse entre el 0,1% superior de los píxeles, muchos eran solo ligeramente más brillantes que los tejidos circundantes. La discrepancia entre los tintes sugiere que los cambios ocurrieron dentro de este intervalo. Los puntos calientes que mostraban solo fluorescencia azul de Evans indicaban una ruptura continua de la BBB en el momento de la inyección del azul de Evans, que luego se reparó mediante la inyección de FITC-dextrano. Por el contrario, los puntos calientes que mostraron solo fluorescencia de FITC-dextrano sugirieron que se produjo una interrupción de la BBB entre las dos inyecciones de colorante. Por último, los puntos calientes que exhibían fluorescencia de ambos colorantes indicaron una ruptura continua de la BBB durante todo el período de inyección.

En la Fig. 4A se presenta el número de puntos críticos positivos para el azul de Evans (incluidos los puntos críticos de doble positivo azul de Evans y azul de Evans/FITC-dextran), FITC-dextrano (incluidos los puntos calientes doble positivos de azul de Evans/FITC-dextran) o ambos colorantes (solo puntos calientes de doble positivo azul de Evans/FITC-dextran). En el protocolo 'Pre' a las 3 h, se observaron numerosos puntos calientes solo para FITC-dextran. A las 6 h y 1 día en el protocolo 'Post', se detectaron los puntos calientes Evans solo azul y FITC-dextran. Sin embargo, a los 3 días y a los 7 días en el protocolo 'Post', los puntos calientes fueron predominantemente positivos para ambos tintes. Estos hallazgos sugieren que la degradación de la BHE ocurrió a las 3 h, se remodeló al cabo de 1 día y persistió hasta 7 días después de la exposición a la BSW (Figura 4B). Es importante destacar que el grado de ruptura de la BBB tendió a disminuir en 7 días, como se mencionó anteriormente.

Tras la finalización de los experimentos de extravasación del colorante, se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica de los cortes7. Las exploraciones inmunohistoquímicas se compararon consistentemente con las de las extravasaciones del colorante, confirmando que el efecto de arrastre de las sustancias fluorescentes era prácticamente insignificante7. Como se muestra en la Figura 5, los grupos de astrocitos reactivos estaban estrechamente asociados con los sitios de descomposición de la BBB. Observaciones posteriores revelaron que la microglía activada y ameboide estaba presente junto a astrocitos reactivos 3 días después de la exposición a BSW.

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Figura 1: Diseño experimental. (A) Curso temporal del experimento. La solución azul de Evans se inyectó por vía intravenosa después de la exposición a BSW (protocolo 'Post') o inmediatamente antes (protocolo 'Pre'), mientras que el FITC-dextrano se perfundió por vía transcardíaca durante 2 minutos antes de la fijación. (B) Concentraciones esperadas de azul de Evans y FITC-dextrano en los vasos sanguíneos en los protocolos 'Post' y 'Pre', respectivamente. BSW: ondas de choque inducidas por explosiones; FITC: isotiocianato de fluoresceína. Esta figura es una adaptación de Nishii et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Comparación de la intensidad de fluorescencia en cortes de cerebro. Se evaluó la intensidad de fluorescencia del 0,1% de los píxeles más brillantes del cerebro en los 12 segmentos y se comparó entre las condiciones 'Post' (A) y 'Pre' (B). Se indica la variabilidad y significación de las diferencias. xxx denota p < 0,001; xxxx denota p < 0,0001 (valores p de la prueba F). *p < 0,05; p < 0,0001 (análisis de varianza con la prueba post hoc de comparaciones múltiples de Dunnett). Esta figura es una adaptación de Nishii et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Desglose de BBB observado en varios puntos de tiempo utilizando doble etiquetado con azul de Evans y FITC-dextran. Se muestran las imágenes Evans azul (magenta), FITC-dextrano (verde) y combinadas. Los protocolos de inyección de tinte se presentan en el lado izquierdo. Algunos puntos calientes mostraron fluorescencia predominante de azul de Evans (flecha) o FITC-dextrano (puntas de flecha). Los asteriscos indican el plexo coroideo y los vasos relacionados. BBB: barrera hematoencefálica; FITC: isotiocianato de fluoresceína; CVO: órganos circunventriculares del tercer ventrículo. Barra de escala: 1 mm. Esta figura es una adaptación de Nishii et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Cuantificación de los puntos calientes de fluorescencia. (A) Números de los puntos calientes positivos para azul Evans (magenta), FITC-dextrano (verde) y ambos tintes (gris). Se recogieron a partir de las imágenes obtenidas a las 3 h en el protocolo 'Pre' como de las imágenes obtenidas a las 6 h, 1 día, 3 días y 7 días en el protocolo 'Post'. De 3 h a 1 día, una porción significativa de los puntos calientes de fluorescencia mostraron un desajuste entre colorantes, mientras que, de 3 días a 7 días, apenas se observó dicho desajuste. (B) Esquema que resume el curso temporal del desglose de BBB. El eje vertical representa conceptualmente la intensidad de la fuga de tinte debido a la descomposición de BBB. El patrón en zigzag de 3 h a 1 día indica que la ubicación y la intensidad de la fuga de tinte son inestables durante este período. FITC: isotiocianato de fluoresceína; BBB: barrera hematoencefálica; BSW: ondas de choque inducidas por explosiones. Esta figura es una adaptación de Nishii et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Expresión de GFAP e Iba1 como marcadores de astrocitos y microglía, respectivamente. Cada columna de la figura contiene imágenes de fluorescencia de la extravasación del colorante con azul de Evans o FITC-dextrano, junto con imágenes inmunohistoquímicas GFAP o Iba1. La barra de color indica las intensidades de fluorescencia normalizadas del azul de Evans y el FITC-dextrano utilizando las de GRN. Los protocolos de inyección de tinte se presentan en el lado izquierdo. El corte de 1 día en el protocolo 'Pre' muestra fluorescencia tanto del azul de Evans como del FITC-dextrano, mientras que el corte de 3 días en el protocolo 'Pre' muestra solo fluorescencia del azul de Evans (flechas). Las regiones indicadas por las flechas en las imágenes de extravasación del colorante se alinean con las imágenes inmunohistoquímicas. Las puntas de flecha indican grupos de astrocitos reactivos. El anticuerpo policlonal GFAP marcó astrocitos dentro y alrededor de la sustancia blanca, así como en el tejido nervioso adyacente a la piamadre. Como resultado, los astrocitos dentro y cerca del dcw se etiquetan en esta figura. Las imágenes ampliadas correspondientes al marco o la flecha de la columna Iba1 se representan en los recuadros. Barras de escala: 1 mm y 200 μm para la extravasación del colorante y las imágenes inmunohistoquímicas, respectivamente. GFAP: proteína ácida fibrilar glial; Iba1, molécula adaptadora 1 de unión al calcio ionizado; FITC: isotiocianato de fluoresceína; BSW: ondas de choque inducidas por explosiones; DCW: Sustancia blanca cerebral profunda. Esta figura es una adaptación de Nishii et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Se utilizó una novedosa técnica de doble marcaje que utilizó azul de Evans y FITC-dextrano para visualizar con precisión la distribución espacio-temporal precisa de la descomposición de la BBB en un solo cerebro. En el modelo BSW de baja intensidad, se observaron variaciones notables en la extensión, ubicación y grado de extravasación del tinte en los cerebros examinados (Figura 2 y Figura 3). Las discordancias entre tintes revelaron que la descomposición de la BBB comenzó aproximadamente 3 h después de la exposición a BSW, con una remodelación sustancial que ocurrió el día 1 y continuó hasta el día 7 (Figura 4). En los casos graves, se reclutaron microglías activas en los sitios de descomposición de la BBB, y los grupos de astrocitos reactivos se vincularon estrechamente a estas áreas (Figura 5). Al realizar inmunohistoquímica en los mismos cortes utilizados para el análisis de extravasación del colorante, se estableció una correlación precisa entre las reacciones gliales y la extravasación del colorante. Para obtener datos y análisis más detallados, consulte Nishii et al.7.

Debido a que el FITC-dextrano se perfundió a una concentración constante durante un período idéntico inmediatamente antes de la fijación por perfusión, es probable que la distribución y la intensidad del colorante representen con precisión el grado de descomposición de la BHE en el momento de la fijación por perfusión. Sin embargo, se ha demostrado en un informe previo que la fluorescencia del FITC-dextrano tiende a ser débil en un modelo BSW de baja intensidad7. El marcaje con azul de Evans durante más tiempo fue ventajoso, ya que pudo detectar cambios más sutiles en la degradación de la BBB (Figura 2). Sin embargo, debido a la mayor duración del etiquetado, puede ser necesario tener precaución al interpretar las imágenes fluorescentes del azul Evans. La concentración sanguínea de azul de Evans fue la más alta inmediatamente después de la inyección y disminuyó gradualmente a lo largo de unas pocas horas (Figura 1)11. Se especula que la intensidad del marcaje se correlacionaría con la gravedad y la duración de la degradación de la BBB, así como con la concentración sanguínea de azul de Evans; sin embargo, disminuiría exponencialmente una vez reparado. Todos estos factores varían de vez en cuando y de un experimento a otro. Por lo tanto, no se debe sacar una conclusión de una sola imagen de extravasación de tinte, y siempre son necesarias consideraciones estadísticas.

Dependiendo del propósito del experimento, podría ser interesante cambiar el peso molecular, así como la combinación de colorantes. En este estudio, se utilizó una combinación de Evans Blue y FITC-dextran. Después de unirse con la albúmina sérica, el azul de Evans se comportó como un trazador de 69 kDa, y el FITC-dextrano de 40 kDa utilizado en este estudio mostró un grado similar de descomposición de la BBB que el azul de Evans. La distribución espacio-temporal de la ruptura de la BHE se investigó sistemáticamente utilizando una combinación de colorantes que emiten diferentes fluorescencias7. En un estudio anterior que utilizó una combinación de azul de Evans y fluoresceína de sodio (376 Da), la fluoresceína de sodio, debido a su menor peso molecular, pudo marcar un rango más amplio de degradación de la BHE después de la exposición a BSW3. En otros estudios, se utilizaron combinaciones de azul de Evans y FITC-dextrano de mayor peso molecular para comparar el grado de degradación de la BHE 18,19. Todos los informes anteriores administraron azul Evans y FITC-dextrano casi simultáneamente. El aspecto único del protocolo presentado aquí es que los dos tintes se introdujeron en diferentes puntos de tiempo, lo que permite examinar la progresión temporal de la descomposición de la BBB.

La naturaleza acumulativa del azul de Evans puede resultar beneficiosa en diferentes modelos de desglose de BBB. Debido a que registra la historia de la ruptura de la BBB, se puede facilitar la comprensión del inicio y la progresión de la enfermedad. Los investigadores deben ser conscientes de las características positivas y negativas de los tintes y utilizarlos almáximo. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para varios modelos de desglose de BBB.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Mayumi Watanabe por la técnica de criosección. Este trabajo fue apoyado por una beca de Investigación Avanzada en Medicina Militar del Ministerio de Defensa de Japón.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución tampón neutra de formalina al 10%FUJIFILM Wako Chemicals062-01661
Anti GFAP, ConejoDAKO-AgilentIR524
Anti Iba1, ConejoFUJIFILM Wako Chemicals019-19741
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-ratón de pollo, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21200
Cryo MountMuto Pure Chemicals33351medio de congelación de tejidos
DomitorOrion Corporationmedetomidina
Burro anti-Conejo IgG (H + L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040
Evans BlueSigma-Aldrich E2129
Falcon Placa de cultivo celular de poliestireno transparente de 24 pocillos con fondo plano transparente sin tratar, con tapa, envuelta individualmente, estéril, 50/cajaCORNING351147
Isotiocianato de fluoresceína– dextrano promedio mol wt 40,000Sigma-Aldrich FD40SFITC-dextrano
Plato con base de vidrio 27mm (No.1 Vidrio)AGC TECHNO GLASS3910-035Plato con fondo de vidrio de 35 mm
IX83 Microscopio invertidoOLYMPUS
MAS Portaobjetos de microscopio de adhesión hidrofílicaMatsunami GlassMAS-04
Matsunami  Cubreobjetos (n.º 1)  18 x 18mmMatsunami GlassC018181
Midazolam Inyectable 10mg [SANDOZ]Sandoz
Paraformaldehído EMPROVE ESSENTIAL DACMerck Millipore1.04005.1000
Bomba PeristálticaATTOSJ-1211 II-H
ROEDOR BRAIN MATRIX
Ratón Adulto, 30 g, Corceadora		ASI INSTRUMENTSRBM-2000C
VetorphaleMeiji Animal HealthVETLI5butorfanol
de cerebros

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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