Artículo de método

Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

DOI:

10.3791/66676

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16 de agosto de 2024

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1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo para la producción de alto rendimiento de canales vasculares con tamaños flexibles y patrones deseados en una placa estándar de seis pocillos utilizando tecnología de bioimpresión 3D, conocida como vasos en una placa (VOP). Esta plataforma tiene el potencial de avanzar en el desarrollo de terapias para los trastornos asociados con el endotelio comprometido.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La permeabilidad vascular es un factor clave en el desarrollo de terapias para los trastornos asociados con el endotelio comprometido, como la disfunción endotelial en las arterias coronarias y el deterioro de la función de la barrera hematoencefálica. Las técnicas de fabricación existentes no replican adecuadamente la variación geométrica de las redes vasculares en el cuerpo humano, lo que influye sustancialmente en la progresión de la enfermedad; Además, estas técnicas a menudo implican procedimientos de fabricación de varios pasos que dificultan la producción de alto rendimiento necesaria para las pruebas farmacológicas. Este artículo presenta un protocolo de bioimpresión para crear múltiples tejidos vasculares con los patrones y tamaños deseados directamente en placas estándar de seis pocillos, superando los desafíos existentes de resolución y productividad en la tecnología de bioimpresión. Se estableció un enfoque de fabricación simplificado para construir seis canales huecos y perfusibles dentro de un hidrogel, que posteriormente se recubrieron con células endoteliales de la vena umbilical humana para formar un endotelio funcional y maduro. La naturaleza controlada por ordenador de la bioimpresión 3D garantiza una alta reproducibilidad y requiere menos pasos de fabricación manual que los métodos tradicionales. Esto pone de manifiesto el potencial de VOP como plataforma eficiente y de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular y avanzar en el descubrimiento de fármacos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La red vascular en todo el cuerpo humano funciona como una barrera de transporte crucial al regular dinámicamente el intercambio de moléculas y células entre la sangre y los tejidos circundantes. Esta regulación es esencial para prevenir el edema tisular y permitir el intercambio selectivo de nutrientes y células, apoyando así el metabolismo y la homeostasis de los tejidos1. La alteración de la permeabilidad endotelial, un factor en muchas condiciones de salud, afecta tanto a la gravedad de la enfermedad como a la eficacia del tratamiento2. El endotelio vascular actúa como una barrera selectiva, facilitando la transferencia entre vasos, tejidos y órganos. Esta regulación involucra varios mecanismos, como el filtrado básico de solutos y moléculas pequeñas, la disrupción intencional de la barrera vascular y la influencia de moléculas como prostaglandinas y factores de crecimiento en los niveles de permeabilidad3.

Los factores clave en esta regulación incluyen las uniones de células endoteliales, la migración de leucocitos y la funcionalidad de la barrera hematoencefálica4. Dada su complejidad, el proceso varía en diferentes entornos, involucrando varios tipos de vasos sanguíneos y utilizando distintas vías anatómicas. Comprender los fundamentos biológicos de la permeabilidad vascular es crucial para diseñar enfoques terapéuticos para tratar las afecciones asociadas con la permeabilidad vascular anormal. Mantener la permeabilidad vascular es crucial para la salud del sistema vascular y los tejidos circundantes; En consecuencia, el deterioro de esta función conduce a la disfunción endotelial, un estado en el que el endotelio pierde su funcionalidad normal.

La disfunción endotelial es precursora de varias enfermedades humanas prevalentes, como la hipertensión, la enfermedad de las arterias coronarias, la diabetes y el cáncer 5,6,7. Esta afección puede presentarse de varias maneras, incluyendo una disminución de la vasodilatación, un aumento de la permeabilidad de los vasos y una tendencia hacia un estado proinflamatorio. Este estado patológico es la etapa más temprana de varios problemas cardiovasculares críticos, como la enfermedad de las arterias coronarias, el accidente cerebrovascular y la enfermedad arterial periférica8, que continúan siendo las principales causas de mortalidad en los Estados Unidos1. La disfunción endotelial afecta a la salud cardiovascular, así como a la barrera hematoencefálica (BHE) y desempeña un papel importante en la progresión de diversos trastornos neurológicos. La disfunción puede aumentar la permeabilidad de la BBB, permitiendo así que las toxinas, los patógenos y las células inmunitarias se infiltren en el sistema nervioso central y contribuyan a trastornos neurológicos como el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple y las infeccionescerebrales.

La disfunción endotelial en la diabetes se caracteriza por el compromiso de la capacidad del endotelio para regular el tono vascular y producir mediadores vasodilatadores, como el óxido nítrico, lo que conduce a una vasodilatación alterada10. Esta condición se ve exacerbada por vías inducidas por la hiperglucemia, como la activación de la proteína quinasa C y el estrés oxidativo, contribuyendo significativamente a la progresión de la enfermedad vascular diabética11. Además, se ha descubierto que un entorno inflamatorio mejora la adhesión de las células tumorales a las células endoteliales microvasculares del cerebro, mientras que se ha informado que un endotelio permeable es un factor importante en la metástasis del cáncer12,13. Se ha descubierto que la geometría de los vasos sanguíneos influye directamente en la metástasis del cáncer cerebral. Las células tumorales se adhieren preferentemente a las áreas de mayor curvatura de los vasos sanguíneos7. Este hallazgo subraya la importancia de la geometría vascular en la metástasis del cáncer. Más importante aún, en condiciones como la fibrosis y el cáncer, la alteración de la función de la barrera endotelial no solo desempeña un papel en el desarrollo de la enfermedad, sino que también dificulta la efectividad del tratamiento al dificultar la administración adecuada de medicamentos14. La investigación sobre la permeabilidad vascular es crucial para avanzar en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares y ofrecer información sobre el manejo de otras enfermedades que implican una función vascular comprometida.

Dado el papel crucial de la permeabilidad vascular en la salud y la enfermedad, una considerable cantidad de investigación se ha centrado en examinar la naturaleza selectiva de la barrera endotelial para el desarrollo terapéutico mediante el uso de modelos animales, junto con plataformas tradicionales de pruebas in vitro en 2D y 3D. Sin embargo, los modelos animales tienen limitaciones debido a las diferencias específicas de cada especie y a cuestiones éticas, así como a los altos costos15,16. Por ejemplo, Pfizer, en 2004, declaró que durante los 10 años anteriores, había gastado más de 2.000 millones de dólares en desarrollos de fármacos que mostraban efectos prometedores en modelos animales, pero que finalmente fracasaronen las etapas avanzadas de pruebas en humanos. Además, los modelos 2D tradicionales no imitan con precisión la arquitectura tridimensional (3D) y la compleja estructura geométrica de los canales vasculares.

Con los avances en las tecnologías de biofabricación, se han realizado grandes esfuerzos para fabricar canales vasculares mientras se recapitula la arquitectura 3D. Los canales vasculares a microescala se pueden fabricar de manera efectiva dentro de chips microfluídicos mediante el uso de litografía blanda, lo que ofrece una ventaja del análisis en tiempo real18,19. Se pueden utilizar métodos alternativos, como la fundición en hidrogel o el envoltorio de láminas de celdas alrededor de un molde o mandril, para crear estructuras tubulares independientes con el diámetro deseado20,21. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones; Por ejemplo, los chips microfluídicos están restringidos a configuraciones de microcanales, y la fundición de hidrogel alrededor de un molde no replica eficazmente múltiples geometrías.

Con la aparición de la tecnología de bioimpresión3D 22, se ha hecho posible replicar geometrías complejas mediante el depósito preciso de diversos materiales de hidrogel basados en matriz extracelular (ECM)23,24. Algunos métodos de bioimpresión, como los que utilizan boquillas dispuestas concéntricamente, por ejemplo, coaxial y triaxial25,26, no pueden crear tubos bifurcados; Sin embargo, las estructuras complejas se pueden lograr con métodos de patrones de sacrificio27. No se ha demostrado que ninguno de estos métodos de bioimpresión permita un modelado in vitro de alto rendimiento, un requisito crucial para la investigación farmacológica en el descubrimiento de fármacos. En este trabajo, presentamos un método para fabricar eficientemente canales vasculares endotelizados con un control eficiente sobre las dimensiones.

Establecimos un enfoque sencillo utilizando placas de seis pocillos disponibles en el mercado, combinadas con un método de patrón de sacrificio en el que una bioimpresora fabrica canales vasculares de los tamaños y patrones deseados dentro de un hidrogel ECM. Se sembraron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para endotelizar estos canales y evaluar la funcionalidad del endotelio a través de un ensayo de permeabilidad. Este diseño permite la perfusión sin bomba mediante la creación de depósitos de medios a ambos lados del canal y utiliza el flujo impulsado por la gravedad con la ayuda de un balancín 2D de uso común para imitar la cultura dinámica. Este enfoque elimina la necesidad de bombas peristálticas y facilita la escalabilidad de esta plataforma para aplicaciones de alto rendimiento. La naturaleza controlada por ordenador de la tecnología de bioimpresión 3D también agiliza el proceso de fabricación, disminuyendo así la probabilidad de errores durante la fabricación. El modelo VOP se muestra prometedor como una herramienta valiosa para las pruebas farmacológicas en el descubrimiento de fármacos.

Protocolo

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1. Generación de código G para la bioimpresora

  1. Para generar y visualizar la ruta de impresión, visite una herramienta de simulación de código G en línea (por ejemplo, NCviewer).
  2. Haga clic en el icono Nuevo archivo en la interfaz para crear un nuevo archivo de código G.
  3. Genere una ruta de impresión escribiendo manualmente los comandos de código G para el canal de sacrificio y la cámara de silicio. Utilice las dimensiones de una placa estándar de seis pocillos como referencia para crear la geometría.
    NOTA: El código G utilizado aquí se basa en el código de control numérico por computadora (CNC). Las funciones de cada comando se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionó el formato de placa de seis pocillos debido a su compatibilidad con los lectores de microplacas comerciales y las configuraciones de microscopía y su capacidad para acomodar volúmenes adecuados de medio para apoyar la maduración del endotelio, minimizando así la necesidad de cambios frecuentes de medio. Este protocolo de fabricación también se puede adaptar para su uso con otras placas de pocillos estándar.
  4. Una vez completado el código G, haga clic en el icono Guardar archivo en la interfaz para descargar el archivo con una extensión .nc.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier otro algoritmo de generación de código G disponible para generar las rutas de impresión. La geometría del canal vascular se puede manipular en este código G.

2. Preparación de tintas de sacrificio y de cámara de silicona

NOTA: Las fuentes de todos los materiales utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

  1. Combine dos tipos de polímeros de silicona, SE1700 y polidimetilsiloxano (PDMS), en una proporción de 10:2. Agregue el agente de curado de cada polímero en una proporción de 10:1, polímero a agente de curado.
  2. Utilice un mezclador planetario para mezclar y desgasificar completamente la mezcla de polímeros a 2.000 rpm.
  3. Con una espátula, transfiera el polímero de silicona mezclado a una jeringa desechable de 10 ml. Centrifugar la jeringa cargada a 400 × g durante 3 min a 5 °C para garantizar una consistencia uniforme y evitar burbujas durante la impresión.
    NOTA: La tinta de la cámara debe usarse dentro de las 2 horas posteriores a la adición de los agentes de curado para garantizar una calidad de impresión óptima. Guarde la jeringa a 5 °C mientras la prepara para la impresión. Este proceso ayuda a ralentizar el curado de la tinta, que de otro modo podría alterar los parámetros de impresión.
  4. Pesar Pluronic F-127 (PF127) para preparar una solución madre al 40% (p/v) de PF127 en agua destilada.
  5. Mezclar la solución PF127 en una batidora planetaria durante 3 min a 400 × g para lograr la homogeneidad. Mantenga la mezcla homogeneizada a 4 °C para la disolución completa de PF127.
  6. Prepare una solución madre de trombina de 1.000 unidades/mL en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    NOTA: Almacene la solución madre de trombina en alícuotas de 100 μL para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Las alícuotas deben almacenarse a -20 °C durante no más de 6 meses.
  7. Antes de imprimir, prepare la tinta de sacrificio mezclando trombina en una dilución 1:10 con PF127 hasta una concentración de trabajo final de 36% (p/v) para PF127 y 100 unidades/mL para trombina. Para preparar 1 ml de tinta de sacrificio, mezcle 100 μl de solución madre de trombina con 900 μl de solución madre PF127.
    NOTA: Al preparar la tinta de sacrificio para imprimir una sola plancha, un volumen total de 1 mL es más que suficiente.

3. Proceso de fabricación

  1. Antes de comenzar el proceso de fabricación, trate una placa de seis pocillos con plasma de oxígeno (O2) a una potencia de 100 vatios durante 1 minuto.
  2. Siga el procedimiento descrito en la sección 2 para preparar tanto las tintas de sacrificio como las de silicona, asegurándose de que las tintas estén libres de burbujas y se mezclen homogéneamente para una impresión uniforme. Cargue con cuidado las tintas en el cabezal de impresión de la bioimpresora. Ajuste la temperatura del cabezal de la bioimpresora a 37 °C para la tinta de sacrificio y a 5 °C para la tinta de silicona.
  3. Coloque una boquilla cónica de rosca doble de doble tornillo de 22 G en la jeringa de silicona. Para la tinta de sacrificio, elija el tamaño de la boquilla de acuerdo con el diámetro de canal deseado.
    NOTA: Aquí, demostramos tres tamaños de boquillas: 18 G, 20 G y 22 G. Los parámetros de impresión óptimos, incluida la presión de impresión y la velocidad del cabezal de impresión, se describen en la Tabla 1.
  4. Cargue el código G deseado y pulse la función servo ready en la interfaz de software de la bioimpresora durante 3 s. Coloque la placa en la plataforma en el punto de inicio del código G y haga clic en iniciar para iniciar el proceso de impresión.
    NOTA: Normalmente, la fabricación de una placa que contiene seis cámaras requiere aproximadamente 1 h y 10 min. El paso 3.4, que implica la carga y ejecución del código G, está sujeto a variaciones en función de la bioimpresora específica utilizada. Asegúrese de que se mantengan las condiciones estériles mientras se utiliza la bioimpresora para evitar la contaminación.
  5. Coloque una tapa sobre la placa y transfiera la placa a una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C durante 72 h para curar las cámaras de silicona.
    NOTA: Aunque el curado del silicona puede ocurrir a un ritmo más lento dentro de la incubadora, la placa no debe colocarse dentro de un horno seco.

4. Preparación de hidrogel e inclusión de canales

  1. Prepare un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de 1x PBS. Coloque 0,01 g de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP) en el tubo cónico para hacer una solución de LAP al 0,05% (p/v). Vórdelo hasta que el polvo se disuelva por completo.
    NOTA: Envuelva el tubo cónico en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Almacene la solución madre de LAP a 4 °C.
  2. Añadir 3 g de metacrilato de gelatina (GelMA) y 0,2 g de fibrinógeno a 20 mL de solución de LAP para conseguir una concentración final de 15% de GelMA y 1% de fibrinógeno (denominado GelFib). Coloque la mezcla en un baño de agua a 37 °C y mezcle periódicamente en vórtice hasta que la solución se disuelva por completo.
  3. Después de la fabricación, como se describe en la Sección 3, agregue 300 μL de GelFib precalentado en cada cámara de hidrogel para incrustar el patrón de sacrificio. Reticulación rápida del GelMA con luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 405 nm con una intensidad de 85 mW/cm2 durante 120 s. Repita este procedimiento para todos los demás pozos.
    NOTA: El fibrinógeno se entrecruza rápidamente al entrar en contacto con el patrón de sacrificio que contiene trombina. Recomendamos agregar hidrogel y realizar la reticulación UV individualmente para cada pocillo para evitar la gelificación no deseada de GelMA a temperatura ambiente. Además, se deben mantener condiciones estériles para evitar la contaminación durante el proceso de curado UV.
  4. Agregue 1 mL de DPBS a cada lado del canal vascular en cada pocillo y mantenga la placa a 4 °C durante 15 min para licuar el PF127.
  5. Después de 15 minutos, succione el DPBS y repita el paso 4.5 3 veces para completar el lavado de PF127.
  6. Antes de introducir las células en los canales, perfunda DMEM F12 que contiene un 1% de Matrigel durante 30 minutos a través de los canales para mejorar la adhesión celular.

5. Cultura HUVEC

  1. Precaliente el medio de crecimiento de células endoteliales (ECGM) en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
  2. Mientras tanto, recupere un vial de HUVEC criopreservados del tanque de nitrógeno, afloje suavemente la tapa del vial y luego vuelva a apretarla para liberar nitrógeno de las roscas. Descongele inmediatamente las células sumergiendo el vial en un baño de agua a 37 °C durante 2 min, asegurándose de que quede una pequeña cantidad de hielo dentro del vial. Enjuague el vial con etanol al 70% para evitar la contaminación.
    NOTA: Use gafas de seguridad cuando recupere celdas del tanque de nitrógeno. La tapa del vial debe mantenerse por encima del nivel del agua durante este proceso.
  3. Prepare un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de ECGM precalentado. Con una micropipeta, transfiera con cuidado las células descongeladas del vial al tubo cónico. Para asegurarse de que no queden células, agregue 1 ml de medio fresco precalentado al criovial, enjuague el interior y transfiera las células restantes al tubo cónico.
  4. Centrifugar el tubo cónico a 200 × g durante 3 min para obtener un pellet de celda. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 mL de medio fresco, transfiera las células a un matraz T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de CO2 humidificada a 37 °C.
    NOTA: Este paso es importante para eliminar el dimetilsulfóxido presente en el medio de congelación en el criovial mediante centrifugación.
  5. Refresque el medio cada dos días hasta que las células alcancen el 80-90% de confluencia.

6. Endotelización de canales

  1. Precaliente ECGM, DPBS, solución neutralizante de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (TE) de tripsina en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
  2. Con una confluencia del 90%, enjuague las células en un matraz T75 con 10 mL de DPBS, agregue 1 mL de TE al 0,25% al matraz e incube durante 3 min.
  3. Golpee suavemente los lados del matraz y agregue 5 mL de solución neutralizante de tripsina para neutralizar el TE. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL. Utilice 5 ml de ECGM fresco para recoger las células restantes y añadirlas al tubo cónico.
  4. Centrifugar el tubo cónico a 250 × g durante 3 min para recoger el pellet de la célula.
  5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de ECGM fresco. Cuente las células con un hemocitómetro y repita el paso 6.4 para obtener una pastilla de células. Resuspenda 3 millones de células en 90 μL de ECGM fresco.
  6. Antes de introducir la suspensión celular en el canal, aspire brevemente el canal para despejar el lumen.
    NOTA: Evite la succión prolongada del canal para evitar dañar su integridad.
  7. Cargue suavemente el canal con una suspensión de celdas a una densidad de siembra de 0,5 millones de celdas por pocillo. Utilice una micropipeta para añadir ~15 μL de esta suspensión para llenar el canal.
    NOTA: La densidad de siembra puede variar dependiendo del tamaño del canal. Esta densidad está optimizada para un canal impreso con una boquilla de 20 G y un diámetro interno de aproximadamente 900 μm.
  8. Coloque la placa plana dentro de la incubadora durante 2 h. Posteriormente, invierta la placa a 180°, manteniéndola en posición plana durante las siguientes 2 h.
  9. Después de 4 h, lavar el canal con DPBS para eliminar las células no adherentes y muertas. Agregue 2 mL de ECGM fresco a cada pocillo (1 mL a cada lado del canal). Inicie el cultivo dinámico en un balancín con un ángulo de inclinación de 10° y 5 rpm colocando la placa en el balancín con los canales paralelos a la dirección de balanceo. Refresque el medio de crecimiento cada dos días.
    NOTA: El cultivo dinámico mejora el intercambio de medios entre los reservorios y los canales y ayuda a que las células proliferen durante la noche.

7. Evaluación de la maduración del endotelio

  1. Precaliente ECGM y DPBS en un baño de agua a 37 °C durante 30 min y reactivo Cell Counting Kit-8 (CCK8) a temperatura ambiente.
  2. Prepare una solución de trabajo de CCK8 mezclando 100 μL de reactivo CCK8 con 1 mL de ECGM fresco para cada pocillo. Mientras trabaja para una placa/canal de 6, prepare 600 μL de reactivo CCK8 combinándolo con 6 mL de ECGM fresco.
  3. Retire el medio de crecimiento por succión y enjuague los canales con DPBS. Agregue 1 mL de solución de trabajo CCK8 a cada pocillo y deje que la placa permanezca plana dentro de la incubadora durante 30 minutos. Después, inicie el cultivo dinámico en un balancín como se describe en el paso 6.9 y continúe este proceso durante las próximas 3 h.
  4. Después de 3 h, retire el contenido de cada pocillo inclinando la placa hacia un lado y transfiéralos a una nueva placa de seis pocillos. Enjuague los canales con DPBS y agregue medio fresco.
    NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio hasta la medición de la absorbancia. Mantenga un volumen de reactivo constante en todos los pocillos para garantizar lecturas uniformes. Durante el pipeteo, evite cuidadosamente introducir burbujas de aire, que pueden alterar la precisión de las lecturas de densidad óptica.
  5. Después de agitar suavemente la placa durante 15 s para garantizar una mezcla uniforme de los colores, utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nm.
  6. Repita este procedimiento en intervalos de tiempo predefinidos. Calcule la densidad óptica media para cada punto de tiempo y trace una curva de crecimiento en un software de gráficos. Esta curva indica la maduración relativa del endotelio a lo largo del tiempo.

8. Ensayo de permeabilidad

  1. Retire el medio de un pozo de interés.
    NOTA: Para el ensayo de permeabilidad, se recomienda procesar cada pocillo por separado para evitar que otros canales se sequen, lo que podría alterar su permeabilidad vascular.
  2. Prepare 6 mL de solución de 0,1 mg/mL de dextrano conjugado con FITC disolviendo 70 kDa de dextrano FITC en DPBS.
    NOTA: Prepare una solución madre de 20 mg/mL de dextrano FITC disolviendo 100 mg de dextrano FITC en 5 mL de DPBS. Después de vorexizar suavemente la solución, alícuota 500 μL en tubos de 1,5 mL para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Estas alícuotas pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Antes de realizar el ensayo, diluya la solución madre hasta una concentración de trabajo de 0,1 mg/ml.
  3. Coloque la placa firmemente en la platina del microscopio y ajuste el aumento del objetivo en el modo de contraste de fase para garantizar una visibilidad clara de la pared del canal en la región de interés, junto con el gel ubicado cerca, dentro del campo de visión.
    NOTA: Para una evaluación efectiva de la permeabilidad, intente maximizar el área del gel que rodea la región de interés en el campo de visión; Este aspecto es clave para un seguimiento preciso del transporte de dextrano.
  4. Después de enfocar el área deseada, cambie del contraste de fase al modo de fluorescencia. En la pestaña de adquisición de imágenes , agregue FITC en el canal de campo amplio y adquiera una imagen antes de agregar la solución de dextrano, para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo. Luego, agregue 1 mL de solución de trabajo de dextrano FITC a un lado del canal y deje que la solución fluya hacia el otro lado del pozo, impulsada por la diferencia de presión hidrostática.
  5. Adquiera imágenes a intervalos de tiempo predeterminados, con más frecuencia para los canales con alta permeabilidad y con menos frecuencia para aquellos con menor permeabilidad.

9. Medición de la intensidad de fluorescencia en ImageJ

  1. En el software de análisis de imágenes ImageJ, mida la intensidad en el punto de tiempo inicial (It1), la intensidad promedio observada en el punto de tiempo posterior (It2) y la intensidad debida al ruido de fondo (Ib), como se describe a continuación. Utilice la ecuación (1) para calcular el coeficiente de permeabilidad (Pd). T1 y T2 se refieren a los puntos de tiempo inicial y posterior de la adquisición de imágenes.
    figure-protocol-1(1)
    1. Inicie ImageJ y abra la imagen adquirida en el punto de tiempo inicial.
    2. Establezca la escala en ImageJ. Vaya a Analizar | Establecer escala. Introduzca la escala y la unidad de medida conocidas.
    3. Seleccione la herramienta rectángulo y dibuje un rectángulo sobre el área del gel donde se requiere la medición de la intensidad de fluorescencia.
    4. Vaya a Analizar | Establezca Mediciones y asegúrese de que el valor medio de gris esté marcado.
      NOTA: Esta opción mide la intensidad media dentro del área seleccionada. Se pueden seleccionar otros parámetros según sea necesario para el análisis dado.
    5. Con el área aún seleccionada, vaya a Analizar | Mida o simplemente presione M. Espere a que se abra una ventana de resultados que muestra la intensidad de fluorescencia media y cualquier otro parámetro seleccionado.
    6. Realice tres mediciones y calcule el valor medio de la intensidad de fluorescencia en una hoja de cálculo.
    7. Repita este procedimiento para las imágenes capturadas en el punto de tiempo posterior t2, así como las tomadas antes de la adición de la solución de dextrano para el cálculo de la intensidad de fluorescencia en el punto de tiempo posterior, para determinar la fluorescencia de fondo.

Resultados

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La plataforma VOP, con flexibilidad de tamaño y patrón, se fabricó con un sistema de bioimpresión de múltiples cabezales. Los canales, tanto huecos como con capacidad de perfusión, se sembraron con HUVEC para facilitar la endotelización y posteriormente se evaluaron con un ensayo de permeabilidad (Figura 1A). Para demostrar la capacidad de fabricación multiescala de este método, imprimimos tres configuraciones distintas: recta, bifurcada y enrevesada (Figura 1B). A través de un enfoque de fabricación sencillo, se pueden producir seis canales vasculares huecos y perfusibles incrustados dentro de una matriz de hidrogel dentro de una placa estándar de seis pocillos. A continuación, estos canales pueden ser endotelializados con HUVECs (Figura 2A). Las células se adhieren y proliferan rápidamente para cubrir la superficie luminal del canal vascular (Figura 2B). Las células adheridas a las superficies luminales inferior y superior exhiben una distribución uniforme dentro del lumen (Figura suplementaria S1).

La placa se colocó en una incubadora humidificada durante 3 días para permitir que la tinta de silicona se curara y al mismo tiempo garantizar que el patrón de sacrificio permaneciera libre de desecación (Figura 3A). Para evaluar el flujo a través de estos canales, se introdujeron microperlas verdes, demostrando que los canales son efectivamente perfusibles (Video Suplementario S1). El diámetro de los canales varió de 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm modificando el tamaño de la boquilla de 22 G a 18 G durante la impresión del patrón de sacrificio. Además, se manipuló la configuración geométrica de los canales mediante la modificación del código G de la bioimpresora (Archivo Suplementario 1) para permitir la impresión de patrones enrevesados y bifurcados (Figura 3B).

La duración de la reticulación con UV se optimizó a 120 s, lo que favorece la proliferación celular efectiva (Figura suplementaria S2). Esta duración de la reticulación dio como resultado un entorno fisiológicamente más relevante que promueve la proliferación de células endoteliales, probablemente debido a las propiedades mecánicas equilibradas y la porosidad del hidrogel, lo que facilita una mejor unión celular y la posterior proliferación. Los HUVEC proliferaron eficazmente en la superficie luminal y mostraron una morfología similar a la de un adoquín el día 5 después de la siembra. La maduración del endotelio se evaluó con el ensayo CCK8 realizado en los días 1, 3 y 5 (Figura 4A,B). La maduración del endotelio se verificó mediante inmunotinción para CD31 5 días después de la siembra celular, lo que demostró la localización de CD31 en las uniones estrechas (Figura 4D).

Para evaluar la función barrera del endotelio, perfundimos una solución de dextrano de 70 kDa a través de los canales en el día 5 de maduración. Para la comparación, se seleccionó un canal de control sin endotelio (desnudo). El canal endotelizado exhibió cambios mínimos en la fluorescencia dentro de la región del gel perivascular a lo largo del tiempo, lo que sugiere que el endotelio mantuvo efectivamente su función de barrera. Sin embargo, los canales desnudos mostraron un aumento de la fluorescencia en la región del gel perivascular, lo que indica una mayor permeabilidad debido a la ausencia de endotelio (Figura 4C y Figura 4E).

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Figura 1: Preparación de los canales vasculares impresos y sus configuraciones. (A) Esquema de fabricación, endotelización y ensayo de permeabilidad de los canales vasculares impresos. (B) Esquema de las tres configuraciones demostradas en este método: recta, bifurcada y enrevesada. Abreviatura: VOPs = recipientes en un plato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Cronología de fabricación para imprimir el patrón de sacrificio y la cámara de silicio, así como la endotelización del canal vascular. (A) La ilustración representa un solo pocillo de la placa del pocillo y AA' se refiere a la vista a lo largo del plano de la sección transversal. (B) Imágenes representativas de los pasos involucrados en el proceso de fabricación. Barras de escala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abreviaturas: GelFib = 15% de gelatina de metacrilato y 1% de fibrinógeno en solución de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio al 0,05% p/v; HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Vasijas en una placa. (A) Imagen bruta de las vasijas en una placa después de la impresión del patrón de sacrificio y la cámara de silicona. (B) Demostración de fabricación multiescala de canales vasculares con una variedad de configuraciones y tamaños, perfundidos con microperlas verdes. Barras de escala = 200 μm (canales rectos), 1.000 μm (canales contorneados y bifurcados). Abreviaturas: ID = diámetro interno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Canales vasculares y su maduración y permeabilidad endotelial. (A) Imágenes microscópicas de fluorescencia de canales vasculares en los días 1, 3 y 5 después de la siembra con HUVECs marcadas con proteínas fluorescentes verdes, que muestran la proliferación y la morfología de adoquines de HUVECs en el día 5. (B) La maduración endotelial se evaluó con el ensayo CCK-8 a los días 1, 3 y 5 después de la siembra de células. (C) Ensayo de permeabilidad de canales vasculares endotelizados (endotelio +) y desnudos (endotelio -). (D) Imágenes representativas de la tinción de CD31 ilustran la localización de CD31 en uniones estrechas en el día 5. E) Cuantificación de la permeabilidad a la difusión. Barras de escala = 200 μm (A, C, D). Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana; GFP = proteína verde fluorescente; GFP HUVECs = HUVECs marcados con GFP; CCK-8 = kit de conteo de células 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tinta de impresiónParámetros de impresión
Calibre de boquillaTemperatura (°C)Presión de aire (kPa)Velocidad del cabezal (mm/min)
Tinta de sacrificio183740-48200
20
22
Tinta de silicona225100

Tabla 1: Parámetros de impresión para las tintas de sacrificio y silicona.

Archivo complementario 1: Script de código G que contiene los comandos para imprimir en 3D el patrón de sacrificio y la cámara de silicio dentro de una placa de seis pocillos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S1: Imágenes representativas de la superficie luminal inferior y superior después de la siembra celular que muestran la unión de GFP-HUVEC en los planos focales inferior y superior. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: UU' = plano focal superior; LL' = plano focal inferior. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Proliferación de GFP-HUVEC bajo diferentes duraciones de reticulación con UV (405 nm). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: HUVECs = Células endoteliales de la vena umbilical humana; GFP = proteína verde fluorescente; GFP HUVECs = HUVECs marcados con GFP. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S1: Perfusión con microesferas verdes que muestran la perfusión efectiva a través de los canales rectos, contorneados y bifurcados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria S1: Funciones de los comandos de código G y código M. NOTA: En el código G, X, Y y Z indican las coordenadas del movimiento a lo largo de los ejes X, Y y Z, respectivamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aprovechando la precisión, la automatización y la naturaleza controlada por computadora de la tecnología de bioimpresión 3D, establecimos un método simplificado para fabricar canales vasculares en placas estándar de seis pocillos, que se eligieron por su compatibilidad con lectores de microplacas comerciales y configuraciones de imágenes de microscopio. El diseño de la placa puede acomodar canales de varios tamaños y un volumen suficiente de medios para el crecimiento de canales más grandes, al tiempo que disminuye la frecuencia necesaria de cambios de medios. Las adaptaciones futuras de este diseño podrían adaptarse a otras placas de pozos estándar disponibles en el mercado, aumentando así el rendimiento experimental y disminuyendo el uso de materiales.

Las plataformas microfluídicas a menudo utilizan un polímero de silicona llamado PDMS debido a su no toxicidad, permeabilidad al gas y alta transparencia28. Sin embargo, la baja fidelidad de forma de PDMS limita su uso en la bioimpresión basada en microextrusión para la fabricación de chips con alta fidelidad de forma. SE170029, otro polímero de silicona, ofrece una mayor precisión en la construcción de cámaras para la fabricación de tejidos, pero su alta viscosidad requiere boquillas más grandes y una presión neumática sustancial. Formulamos una mezcla de SE1700 y PDMS que se puede usar con boquillas más pequeñas, lo que permite la fabricación en áreas confinadas con alta precisión y fidelidad de forma. Otros tipos de polímeros, como la policaprolactona (PCL) o el acetato de vinilo de polietileno (PEVA), también pueden emplearse para la impresión en cámara debido a su alta fidelidad de forma30.

La transparencia óptica de GelMA también es crucial31. A diferencia de otros hidrogeles basados en ECM, como el colágeno, que se vuelve opaco después de la reticulación, GelMA conserva la transparencia, lo que permite el análisis celular en tiempo real dentro de los canales, incluso a medida que aumenta el tamaño del canal. Este aspecto proporciona una gran ventaja sobre los métodos que requieren secciones delgadas para la observación cuando se aumenta el tamaño del constructo32. La biodegradabilidad de GelMA facilita el reemplazo del andamio de ECM con tejido funcional nuevo a medida que se desintegra, proporcionando así el espacio necesario para el crecimiento de tejido funcional recién formado33,34. Además, su baja citotoxicidad comprobada lo hace altamente adecuado para aplicaciones de ingeniería de tejidos35,36. Las excelentes características mecánicas de GelMA lo convierten en un buen candidato para aplicaciones en ingeniería de tejidos vasculares37. Su eficacia para facilitar la endotelización de los conductos vasculares con HUVECs ha sido bien documentada38.

Las células utilizadas para la endotelización en este estudio, las HUVEC, exhiben una alta tasa de éxito de aislamiento y son un modelo excepcional para examinar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares y metabólicas39. Sin embargo, este enfoque se puede adaptar para acomodar diferentes tipos de células endoteliales, incluidas las derivadas de las arterias o directamente de los pacientes. Esta adaptabilidad permite la creación de modelos de tejido vascular específicos para cada paciente, lo que facilita la evaluación de las respuestas individuales a fármacos específicos.

Este protocolo tiene algunos pasos críticos que los lectores deben tener en cuenta. En primer lugar, el tratamiento con plasma es fundamental para modificar las características de la superficie de la placa, específicamente para mejorar la hidrofilicidad, porque la mayoría de las placas de pocillos comerciales son hidrofóbicas. El tratamiento con plasma introduce grupos funcionales polares en la superficie, mejorando así la capacidad de unión con la cámara de silicio y el hidrogel. En segundo lugar, el control de la temperatura es crucial porque la tinta de sacrificio se licúa a temperaturas más bajas, y la tinta de silicona requiere temperaturas más bajas para evitar el curado prematuro, lo que puede impedir la extrusión de la tinta a través de la boquilla. En tercer lugar, la eliminación completa de todas las trazas de PF127 es crucial porque cualquier residuo de PF127 puede afectar negativamente a los procesos celulares, por ejemplo, interfiriendo con la adhesión celular40. En cuarto lugar, durante el cultivo celular, si las células crecen hasta una confluencia superior al 90%, pueden experimentar estrés debido a la competencia por el espacio y los nutrientes. Este estrés puede dar lugar a un comportamiento celular alterado, una disminución de la viabilidad celular y modificaciones en el microambiente celular. Para mantener la salud celular y la proliferación adecuada, se recomienda mantener los cultivos por debajo del 90% de confluencia. En quinto lugar, es importante mantener la placa plana dentro de la incubadora antes y después de la inversión para lograr una adhesión celular uniforme dentro del canal y, en última instancia, una endotelización uniforme. Por último, mantener constante el tiempo de exposición, la intensidad del láser de excitación y el enfoque del microscopio es crucial durante la adquisición de imágenes, ya que las variaciones en estos parámetros podrían cambiar la intensidad de la señal de emisión, lo que podría afectar a la precisión de los resultados.

Nuestro enfoque permite la creación de canales en múltiples configuraciones, como los patrones rectos, bifurcados y enrevesados que se muestran aquí. Esta adaptabilidad es esencial para replicar las diversas geometrías de la red vascular en el cuerpo humano y supera las capacidades de los métodos tradicionales, como la fundición de hidrogel alrededor de un molde o las técnicas de bioimpresión basadas en boquillas concéntricas utilizadas para estructuras en forma de tubo 30,41,42. Sin embargo, una limitación de este método es que no garantiza la circularidad de los canales porque el patrón de sacrificio se coloca sobre una superficie plana.

La ventaja de construir canales en múltiples tamaños es clave para superar las limitaciones de las plataformas microfluídicas, que a menudo se limitan a los microcanales. Esta restricción puede ser un inconveniente en los ensayos bioquímicos convencionales. Por ejemplo, para obtener material suficiente para los ensayos de expresión de proteínas estándar, como el Western blot, se deben combinar los resultados de varios dispositivos microfluídicos. Además, cuando se crean canales huecos, el hidrogel debe mantener la rigidez suficiente para soportar el proceso de extracción de la aguja. Nuestro enfoque utiliza un material de sacrificio termorreversible, que se vuelve líquido cuando se disminuye la temperatura, facilitando así este proceso sin dañar la integridad del gel. Además, otros materiales gelificantes termorreversibles, como la gelatina43, también se pueden utilizar como materiales de sacrificio en este método.

Este enfoque permite una fácil personalización de las estructuras de tejido en la placa, proporcionando así una herramienta prometedora para las pruebas farmacológicas en el descubrimiento de fármacos. Este método puede facilitar el cribado de fármacos mediante la evaluación de sus efectos sobre la permeabilidad vascular, un factor clave en el desarrollo de terapias para enfermedades asociadas a la disfunción vascular. Nuestro modelo se puede utilizar para estudiar la permeabilidad vascular en condiciones específicas, como la inflamación, y para desarrollar estrategias para la normalización vascular, que es relevante para el tratamiento de diversas enfermedades que involucran una permeabilidad vascular anormal44, avanzando en la comprensión de este proceso y desarrollando posibles aplicaciones clínicas45.

Para evaluar la permeabilidad vascular, perfundimos 70 kDa de dextrano a través del canal vascular. Típicamente, un endotelio vascular sano sirve como una barrera eficaz para las moléculas de dextrano de este peso molecular46. Sin embargo, en presencia de inflamación, se produce la ruptura de las uniones estrechas, permitiendo que estas moléculas se filtren, aumentando así la permeabilidad vascular30. Además, el dextrano marcado con fluorescencia se utiliza para evaluar la distribución de fármacos dentro de los tejidos modificados47. Aunque el flujo bidireccional y la dinámica de desbordamiento de control limitada dentro del canal son limitaciones de este modelo, prevemos que los usuarios finales podrán adaptar el sistema de acuerdo con sus requisitos mediante el uso de balancines personalizados para controlar la dinámica de flujo dentro de los canales. Esta adaptación puede incluir la implementación de un flujo unidireccional sin bomba48.

En el futuro, este método de fabricación podría ampliarse para construir tejidos complejos. Al posicionar con precisión otros tipos de células cerca de los canales vasculares, se podrían crear tejidos vascularizados y perfusibles, superando así un gran desafío en la bioimpresión de tejidos volumétricos. También creemos que este método podría adaptarse para simular otros tipos de tejidos huecos y perfusibles, como los vasos linfáticos y los intestinos, de una manera de alto rendimiento para una variedad de aplicaciones biomédicas.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiadas por el gobierno de Corea (Ministerio de Ciencia y TIC, MSIT) [No. NRF-2019R1C1C1009606; No. 2020R1A5A8018367; y No. RS-2024-00423107]. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Desarrollo de Tecnología Bio y Médica de la NRF financiadas por el MSIT [No. NRF-2022M3A9E4017151 y No. NRF-2022M3A9E4082654]. Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Innovación Tecnológica [Nº 20015148] y el Proyecto Alquimista [Nº 20012378] financiado por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE, Corea). Este trabajo también contó con el apoyo del Instituto Coreano de Planificación y Evaluación de Tecnología en Alimentos, Agricultura y Silvicultura (IPET) a través del Programa de Tecnologías de Convergencia Agrícola y Alimentaria para el Desarrollo de Recursos Humanos de Investigación, financiado por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Asuntos Rurales (MAFRA) [No. RS-2024-00397026].

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta serológica de 10 mLSPLSPL 91010
jeringa de 10 mL Shinchang Medical
15 mL tubo cónicoSPL50015
Bioimpresora 3D T& R Biofab3DX-Printer
placa de 6 pocillos SPL37206
Cabinas de seguridad biológicaCHC LABPCHC-777A2-04, 
Microscopios invertidos de campo claro Kit de recuento deLeicaDMi1
(CCK8)GlpBioGK10001
recuento de células (CCK8)GK10001GlpBio
75TSPL70075
Corning Matrigel Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (GFR), sin LDEV, 10 mLCorning354230
Agua
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, Grado de Cultivo CelularSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a KitDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Medio de crecimiento de células endoteliales MV 2 (Listo para usar)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipeta (1000,200,100,20,10)eppendorf
Alcohol etílico 99.9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrinógeno de plasma bovinoSigma AldrichF8630-1G
FITC Dextrano 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Perlas fluorescentes (1.0 μ m, verde)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-polvo (Metacrilato de gelatina) 50 g3D Materiales 20JT29
Gibco, Medio de congelación de cultivo celular de recuperación, 50 mLGibco
HUVECs (células endoteliales de la vena umbilical humana)Software Promocell
ImageJNIH
ThermoSCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubadora
Invitrogen, Kit de viabilidad viva/muerta/citotoxicidad (para células de mamíferos)Thermo FisherL3224
Polvo de fosfato de litio fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) Tokoyo Industria Química CO.85073-19-4 
Marienfeld Superior, Tapa de la cámara de recuentoMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocitómetro, cámara de recuento de célulasMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MicrocentrífugaCentrífuga eppendorf5920 R
NCViewer.com
Tanque de nitrógenoWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Láser UV OMNICUREEXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Solución de penicilina-estreptomicina (100x)GenDEPOTCA005-010
Mezclador planetarioTHINKY CORPORATION, japónARE-310
Máquina de tratamiento de plasmaFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Tampón prefabricado, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Armario de almacenamiento de reactivosZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Microscopio de imagen de célula viva en tiempo realCarl ZEISS
RefrigeradorSAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D digitalIKA4003000
Scoop-EspátulaCachePorSL-SCO7001-EA
sigma,Tripsina-EDTA solition, 0.25%Sigma aldrichT4049-100ML
Sulfato de Dodecilo de Sodio (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Tapa de punta de barril de jeringaFISNAR3051806
Contadorde conteo Compañía de control  C23-147-050
Boquilla cónica (18 g)MushashiTPND-18G-U
Boquilla cónica (22 g)MushashiTPND-22G-U
Boquilla cónica 20 gMusashiTPND-20G-U
Trombina de plasma bovinoSigma AldrichT7326-1KU
Temporizador, 4 canalesETLSL. Tim3005
Solución de Azul de Tripano 0.4%Gibco15250061
Solución Neutralizante de TripsinaPromocellC-41120
UG 24 mL Tarro de ungüento UGYamayuNº 3-53
UG 58 mL Tarro de ungüento UGYamayuNº 3-55
Baño de aguaDAIHAN ScientificWB-11
Máquina de pesasSartoriusbce2241-1skr
células kit de Matraz de cultivo celular destilada Incubadora

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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