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Una radiosíntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 para uso clínico rutinario

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DOI:

10.3791/66708

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24 de mayo de 2024

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1Radiopharmaceutical Production and Development Centre (RAPID), Medical Technology and Physics Department, Sir Charles Gairdner Hospital, 2National Imaging Facility, Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia, 3Department of Nuclear Medicine, Sir Charles Gairdner Hospital, 4Medical School, University of Western Australia

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe la producción automatizada de hasta 1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 en el sintetizador iPHASE MultiSyn para la obtención de imágenes PET de la proteína de activación de fibroblastos.

Resumen

[68Ga]Ga-FAPI-46 es un nuevo trazador prometedor para la obtención de imágenes de la proteína de activación de fibroblastos (FAP) mediante tomografía por emisión de positrones (PET). Los inhibidores marcados de la FAP (FAPI) han demostrado su absorción en varios tipos de cáncer, incluidos el cáncer de mama, pulmón, próstata, páncreas y colorrectal. FAPI-PET también posee una ventaja práctica sobre FDG-PET, ya que no se requiere ayuno ni reposo. [68Ga]Ga-FAPI-46 exhibe propiedades farmacocinéticas mejoradas, retención tumoral mejorada e imágenes de mayor contraste que las [68Ga]Ga-FAPI-02 y [68Ga]Ga-FAPI-04 presentadas anteriormente. Aunque inicialmente se describió un protocolo de síntesis manual para [68Ga]Ga-FAPI-46, en los últimos años se han reportado métodos automatizados que utilizan diferentes sintetizadores comerciales.

En este trabajo, describimos el desarrollo de la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando el sintetizador iPHASE MultiSyn para aplicaciones clínicas. Inicialmente, se investigó la optimización del tiempo de reacción y la comparación del rendimiento de cuatro cartuchos diferentes de extracción en fase sólida (SPE) para la purificación del producto final. A continuación, se llevó a cabo el desarrollo y la validación de la producción de 0,6-1,7 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando estos parámetros optimizados. El producto se sintetizó en 89.8 ± rendimiento corregido de decaimiento del 4.8% (n = 6) durante 25 min. El producto final cumplió con todas las especificaciones de control de calidad recomendadas y fue estable hasta 3 h después de la síntesis.

Introducción

La proteína de activación de fibroblastos (FAP) se ha convertido en un objetivo destacado para las imágenes y la terapia del cáncer1,2. La FAP es un marcador específico de fibroblastos asociados al cáncer (CAF), un tipo de célula estromal que constituye gran parte del microambiente de los cánceres sólidos. Los CAF juegan un papel clave en el crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis3. Se encuentran en la mayoría de los tumores sólidos, incluidos los cánceres de mama, próstata y páncreas1. Al dirigirse a la FAP con inhibidores de moléculas pequeñas marcados con radionúclidos diagnósticos o terapéuticos, se pueden lograr imágenes selectivas no invasivas y terapia de estos cánceres4,5,6. Las moléculas inhibidoras de FAP (FAPI) como FAPI-02, FAPI-04, FAPI-46 y FAPI-74 marcadas con 68Ga y 18F representan una clase de agentes dirigidos a FAP basados en quinolina que fueron desarrollados por equipos del Hospital Universitario de Heidelberg y el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Alemania7,8,9,10,11, basándose en trabajos anteriores que identifican el muy prometedor andamio N-(4-quinolinoil)-glicil-(2-cianopirrolidina) para la inhibición de FAP12,13. Más recientemente, se han desarrollado inhibidores de FAP de péptido cíclico como FAP-228614 y 3BP-394015 tanto para imágenes como para terapia.

[68Ga]Ga-FAPI-04 ha demostrado su aceptación en 28 tipos diferentes de cáncer, incluyendo cáncer de mama, pulmón, próstata, páncreas y colorrectal16. Además de la ventaja práctica de no requerir ayuno y reposo9, FAPI-PET ha demostrado una ventaja diagnóstica sobre (o un papel complementario con) FDG-PET, como en el cáncer gastrointestinal, de mama, de ovario y de hígado, en las metástasis cerebrales del cáncer de pulmón17, y en los casos en que los hallazgos de FDG no son concluyentes18. Artículo 68El FAPI marcado con Ga también ha mostrado algunas aplicaciones no oncológicas interesantes en enfermedades inflamatorias relacionadas con el sistema inmunitario, como la fibrosis y la artritis reumatoide19,20. El [68Ga]Ga-FAPI-46 presentado más recientemente, una variante de [68Ga]Ga-FAPI-04, que tiene un enlace modificado al ácido dodecane tetraacético (DOTA), exhibe propiedades farmacocinéticas mejoradas y una retención tumoral mejorada, lo que da como resultado imágenes de mayor contraste que las obtenidas con [68Ga]Ga-FAPI-02 o [68Ga]Ga-FAPI-046,10. El uso de inhibidores de FAP marcados para el diagnóstico y el tratamiento está bajo patente internacional21 y el uso de [68Ga]Ga-FAPI-46 está actualmente bajo licencia22.

Las preparaciones reportadas de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando ciclotrón producido por 68Ga o 68Ga eluido de un generador de 68Ge/68Ga incluyen el uso de protocolos manuales y sintetizadores automatizados. Se ha descrito un protocolo de etiquetado manual para [68Ga]Ga-FAPI-46, basado en los métodos reportados anteriormente para [68Ga]Ga-FAPI-02 y [68Ga]Ga-FAPI-0423,24. Aunque el etiquetado manual no requiere equipos especializados, este enfoque puede conducir a un aumento de la dosis de radiación del operador y a una posible variabilidad dentro de la producción25; De ahí la necesidad de automatizar la producción para aplicaciones clínicas rutinarias. Además, el uso de un sintetizador automatizado cumple mejor con las regulaciones internacionales GMP. La preparación de [68Ga]Ga-FAPI-46 se desarrolló en una variedad de sintetizadores comerciales, utilizando 68Ga de diferentes generadores26,27,28,29,30,31,32,33 o ciclotrón 68Ga34. Los detalles de estos métodos automatizados se resumen en la Tabla Suplementaria S1 (Archivo Suplementario 1). En los últimos años también se han publicado métodos de síntesis automatizados para otros inhibidores de FAP marcados con 68Ga- y 177Lu35,36.

En el Centro RAPID del Hospital Sir Charles Gairdner, hemos desarrollado y validado la preparación de [68Ga]Ga-FAPI-46 en el sintetizador iPHASE MultiSyn (en lo sucesivo, el sintetizador MS). Este sintetizador se utiliza de forma rutinaria en nuestro laboratorio, así como en otras instalaciones de producción en Australia para la preparación de radiofármacos marcados con 68Ga, 177Lu y 89Zr37,38,39. El sintetizador MS funciona descargando una lista de pasos de secuencia de Excel en su memoria interna. Esta lista de pasos de secuencia es fácil de usar y modificable. Además, el sintetizador permite intervenciones a mitad de la producción, como repetir pasos, volver a los pasos anteriores, omitir pasos y pausar la producción cuando sea necesario. Está equipado con detectores de radiación colocados en lugares estratégicos, lo que permite al usuario monitorear el proceso de producción en tiempo real. El sintetizador MS es compatible con todos los generadores comerciales de 68Ga y permite la elución de uno o dos generadores. El procedimiento descrito en este trabajo utiliza 68Ga de uno o dos generadores de 68Ge/68Ga e implica tanto la prepurificación de 68Ga como la postpurificación del producto final. Como parte de este estudio, también se evaluó el tiempo de reacción óptimo y la comparación del rendimiento de tres tipos diferentes de cartuchos de extracción en fase sólida (SPE) de pospurificación con el proporcionado en el casete del proveedor.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el manejo de materiales radiactivos. Todo el personal que realice este trabajo debe estar adecuadamente capacitado en el manejo de radioisótopos no sellados y contar con la aprobación del oficial de seguridad radiológica de su institución. El sintetizador automático debe ubicarse en una celda caliente dedicada y protegida. Los experimentos manuales deben realizarse en una celda caliente protegida o detrás de blindajes contra radiación. Los experimentos preliminares para la optimización del tiempo de reacción y la prueba de diversos cartuchos de extracción en fase sólida (SPE) se describen en la Sección Suplementaria 1 (Archivo Suplementario 1).

1. Preparación del sintetizador de espectrometría de masas

  1. Encienda el aire comprimido de la celda caliente, el suministro de gas nitrógeno, la ventilación, la luz y la alimentación eléctrica del portátil y del controlador lógico programable (PLC). Verifique el nivel del frasco de desechos del módulo. Reemplácelo con un frasco vacío cuando esté lleno hasta las ¾ partes.
  2. Encienda la computadora e inicie sesión en el software del sintetizador. Ingrese el nombre de usuario y la contraseña.
  3. En el software del sintetizador, pulse Descargar receta, seleccione el archivo de secuencia en Excel para la producción de [68Ga]Ga-FAPI-46 y pulse Abrir. Pulse Aceptar después de que la secuencia se haya descargado correctamente.
  4. Pulse Iniciar; introduzca el número de lote, el número de lote del kit de reactivos y cualquier comentario en la ventana emergente; luego pulse Aceptar.
    NOTA: A partir de ese momento, la interfaz de usuario mostrará un mensaje de paso que describe la acción del paso y/o solicita la intervención del operador.
  5. Retire el kit de hardware anterior según lo indicado por el mensaje de paso en la interfaz de usuario. Pulse SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  6. Retire la jeringa de elución del generador (jeringa de HCl 1) del sintetizador, según lo indicado por el mensaje de paso en la interfaz de usuario, extrayendo el reposapulgares de la jeringa de la ranura del accionador de jeringa y desenroscando la jeringa de la línea de entrada del generador. Pulse SIGUIENTE en la interfaz de usuario.

2. Preparación de los reactivos

NOTA: Los reactivos necesarios para la producción automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 (ver Tabla 1) se prepararon en un entorno de sala limpia inmediatamente antes de la producción.

  1. Obtenga el kit de reactivos y el conjunto de artículos auxiliares, un tubo centrífugo de 50 mL que contenga un mínimo de 5 mL de agua con concentración de metales a nivel de trazas; la bolsa de HCl 0,1 M, el vial con 7 mg de ácido ascórbico (vial A); el vial de ascorbato de sodio (5 mg) (vial B); 2 jeringas de polipropileno (PP)/polietileno (PE) de 5 mL, libres de látex, PVC y aceite de silicona (tres si se utiliza la elución con doble generador) y el vial de vidrio con 50 µg de FAPI-46 (vial C; véase Supplemental Figure S1A,B-Supplemental File 1).
  2. Vierta aproximadamente 2 mL de agua en la tapa del tubo de 50 mL. Aspire 1 mL de agua en una jeringa de 5 mL (etiquétela como jeringa A). Tape con una aguja. Pipete 400 µL de agua y añádalos al vial de ácido ascórbico de 7 mg (vial A); agite suavemente para disolver.
  3. Abra el vial de tampón de acetato de sodio 0,25 M proporcionado (del kit de reactivos) y el vial de vidrio con 50 µg de FAPI-46. Pipete 0,9 mL de tampón y añádalo al vial de vidrio con 50 µg de FAPI-46 (vial B); mezcle suavemente.
  4. Aspire el contenido del vial A y del vial B en la jeringa A. Mezcle suavemente.
  5. Etiquete la jeringa de 5 mL proporcionada en el conjunto de artículos auxiliares como jeringa B. Aspire 5 mL de HCl 0,1 M de la bolsa de HCl 0,1 M con la jeringa B; tápela con el pasador dispensador proporcionado.
    NOTA: Para la producción mediante elución con doble generador, se requieren dos jeringas de 5 mL de HCl 0,1 M.
  6. Etiquete la jeringa de 3 mL proporcionada en el conjunto de artículos auxiliares como jeringa C. Abra el vial de solución de cloruro de sodio ácido 5 M (del kit de reactivos), pipete 1 mL, transfiéralo a la jeringa C y tápela con el pasador dispensador proporcionado.
  7. Aspire 1 mL de solución salina al 0,9 % en una jeringa de 5 mL (jeringa D) y añádalo al vial C; mantenga la jeringa D vacía.

3. Preparación del casete de síntesis e instalación del casete

  1. Obtenga una cinta estéril dedicada para [68Ga]Ga.
  2. Arme la cinta siguiendo los pasos que se indican a continuación:
    1. Retire el sobre de la cinta, verifique si presenta algún daño y apriete cada conexión Luer. Gire y alinee cada llave de paso en la cinta para asegurarse de que no estén atascadas y que encajen correctamente en el módulo. Retire todas las tapas de los espigones.
    2. Condicione el cartucho SPE de pre-purificación de intercambio catiónico fuerte como sigue:
      1. Retire el cartucho colocado en la válvula 7 del manifold 3 (M3) de la cinta.
      2. Coloque una botella de desecho de vidrio abierta y dedicada sobre la bancada.
      3. Conecte la jeringa que contiene 2 mL de HCl 3 M (incluida en el kit de reactivos) al cartucho SPE y eluya lentamente el cartucho SPE gota a gota dentro de la botella de desecho de vidrio. Retire la jeringa, aspire 5 mL de aire y pase 5 mL de aire a través del SPE.
        ADVERTENCIA: El paso 3.2.2.3 requiere el manejo de un ácido fuerte (ácido clorhídrico 3 M). Use equipo de protección adecuado (guantes, gafas de seguridad, bata de laboratorio).
      4. Conecte la jeringa que contiene 5 mL de agua (del kit de reactivos) al SPE y eluya lentamente el cartucho SPE gota a gota en la botella de desecho de vidrio. Retire la jeringa, aspire 5 mL de aire y pase 5 mL de aire a través del SPE.
      5. Coloque nuevamente el SPE en el manifold, en la posición de la válvula 7 del M3.
    3. Pulse SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
    4. Arme e instale la nueva cinta según se muestra en la interfaz de usuario (consulte Figura 1A,B si utiliza elución dual), sin añadir reactivos, y siguiendo las conexiones descritas en la Figura 1C
      1. Conecte la jeringa de 10 mL (del conjunto de accesorios) a la válvula 6 del M2.
      2. Instale los cuatro manifolds y fije la cinta utilizando los cierres magnéticos del sintetizador.
      3. Coloque el reactor en el horno.
      4. Conecte los tubos a los puertos G1, W2, W1, R y G2.
      5. Conecte el tubo del lado derecho de la válvula 3 del M1 al cartucho de intercambio catiónico en la válvula 7 del M3.
      6. Instale un cartucho SPE de postpurificación en la válvula 4 del M2.
        NOTA: En la Figura suplementaria S1C (Archivo suplementario 1) se muestra una fotografía de la configuración final para la síntesis.
  3. Pulse SIGUIENTE en la interfaz de usuario para iniciar las siguientes pruebas en el orden indicado a continuación:
    1. Prueba de presión de la conexión de gas inerte al M4.
    2. Prueba de presión de la conexión entre el M3 y el M4.
    3. Prueba de presión del reactor.
    4. Prueba de presión de la conexión de desecho al M3.
    5. Prueba de presión del cartucho SPE de postpurificación entre el M3 y el M2.
    6. Prueba de presión de la conexión de la jeringa en la válvula 6 del M2.
    7. Prueba de presión de la conexión de desecho al M2.
    8. Prueba de presión de la conexión de gas inerte al M1.
    9. Prueba de presión del cartucho SPE de pre-purificación entre el M1 y el M3.
    10. Purgado de los espigones en las válvulas 10, 11 y 12 con gas inerte.
    11. Purgado del M3 y el M4 con gas inerte.
    12. Purgado de ambos cartuchos SPE de pre-purificación y postpurificación con gas inerte.

4. Instalación de reactivos, línea(s) del generador(es) y vial del producto final (ver Figura 1A,C y Figura 1B,C si se utiliza la elución de doble generador)

  1. Obtenga los viales de etanol (100 %), solución salina y agua para inyección del kit de reactivos; retire las tapas y limpie cada septo con una toallita con alcohol.
  2. Instale los viales en el kit en las posiciones de la válvula M4 10, válvula M4 11 y válvula M4 12 cuando el sintetizador lo indique; haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  3. Retire la aguja de la jeringa A y tire del émbolo hasta los 5 mL.
  4. Desconecte la línea del puerto medio del reactor y transfiera el contenido de la jeringa A al vial del reactor a través del puerto medio del reactor.
  5. Vuelva a conectar la línea al puerto medio del reactor; haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  6. Instale la(s) línea(s) de salida del generador en la cinta en la posición de la válvula M1 2 (y la válvula M1 1 si se realiza la elución de doble generador); haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  7. Retire la aguja dispensadora de la jeringa C e instálela en la posición de la válvula M1 3; haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  8. Retire la aguja dispensadora de la jeringa B, conecte el acople luer de la jeringa B al adaptador de la línea de entrada del generador, y empuje la jeringa B para que el reposapulgares del émbolo se deslice dentro de la ranura del accionador de la jeringa; haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.
  9. Prepare el vial del producto final en una cabina de seguridad biológica de Clase II o equivalente, siguiendo los pasos indicados a continuación:
    1. Coloque un vial estéril de 25 mL etiquetado en una olla de tungsteno (o recipiente adecuadamente blindado).
    2. Limpie el septo del vial con una toallita con alcohol, coloque una tapa sobre la olla e inserte una aguja de ventilación filtrada.
    3. Conecte la salida de un filtro de ventilación estéril de 0,22 µm de polivinilideno fluoruro (PVDF) de baja unión a proteínas a una aguja hipodérmica estéril de 20 G. Etiquete el filtro con el número de lote del producto.
    4. Inserte la aguja en el vial final de producto de 25 mL con ventilación.
    5. Retire el contenido del vial C (Tabla 1) en la jeringa D vacía (véase el paso 2.7) y agregue 4 mL de aire.
    6. Conecte la jeringa D a la entrada del filtro de ventilación de 0,22 µm. Empuje el contenido de la jeringa a través del filtro de 0,22 µm y la aguja hacia el vial del producto final.
    7. Lave el filtro 2 veces con 5 mL de aire. Retire la jeringa del filtro de ventilación de 0,22 µm.
      NOTA: Los lavados deben realizarse lentamente para evitar romper la membrana del filtro.
  10. Transfiera la olla que contiene el vial del producto final a la celda caliente, conecte el tubo final desde la posición de la válvula M2 5 al filtro del vial del producto y haga clic en SIGUIENTE en la interfaz de usuario.

5. Pasos preliminares del sintetizador antes de la radiomarcación

  1. Esperar a que el sintetizador realice los siguientes pasos preliminares: presurizar el vial de etanol (M4, válvula 10); presurizar el vial de solución salina (M4, válvula 11); presurizar el vial de agua (M4, válvula 12); presurizar la jeringa de cloruro de sodio acidificado (M1, válvula 3); acondicionar el cartucho de SPE postpurificación con etanol; acondicionar el SPE postpurificación con agua; re-presurizar el vial de agua (M4, válvula 12).
  2. Pulsar SIGUIENTE en la interfaz de usuario para iniciar la producción cuando el sintetizador indique Listo para eluir el generador de 68Ga.

6. Radiomarcado automatizado para producir [68Ga]Ga-FAPI-46

NOTA: La síntesis automatizada se inicia realizando el paso 5.2. Figura 1D describe la reacción de radiomarcado para producir [68Ga]Ga-FAPI-46. Se muestra una captura de pantalla representativa de la interfaz del sintetizador y un perfil típico de radiactividad en la Figura 1A,B y la Figura 2, respectivamente. Para la producción mediante elución dual del generador, el sintetizador indicará al usuario que retire la jeringa B vacía tras la elución del primer generador e instale otra jeringa que contenga 5 mL de HCl 0,1 M en el accionador de jeringas para la elución del segundo generador.

  1. Al final de la síntesis (FOS), busque el mensaje synthesis complete mostrado por el sintetizador. Retire el filtro de ventilación esterilizante de 0,22 µm y la aguja de ventilación filtrada del vial del producto final y recupere la olla de tungsteno de la celda caliente.

Tabla 1: Preparación de reactivos para la producción de [68Ga]Ga-FAPI-46. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Diagrama de radiomarcado con configuración del manifold y proceso de reacción; incluye pasos de cromatografía.
Figura 1: Esquema de la interfaz de usuario del sintetizador; configuración del casete y de los reactivos para la radiosíntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46. (A) Configuración para producción con un solo generador. (B) Configuración para producción con dos generadores. (C) Posiciones de los reactivos para la producción automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando el sintetizador radioquímico MS. (D) Esquema de radiomarcado de [68Ga]Ga-FAPI-46. Abreviaturas: FAPI = inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos; Mn = manifold n; Wn = salida de desecho n; Vn = válvula n; R = reactor al vacío; Gn = entrada de gas n. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico del proceso de radiomarcado: elución de [68Ga]Ga3+, retención en SPE, análisis de radiactividad frente a tiempo.
Figura 2: Perfil típico de radiactividad del sintetizador para la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46. Acrónimos: FAPI = inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos; SPE = extracción en fase sólida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Dispensación de [68Ga]Ga-FAPI-46 para control de calidad y envío

  1. Transfiera el vial del producto a un sistema de dispensación adecuadamente blindado e invierta el vial para homogeneizar el producto.
  2. Utilizando técnicas asépticas y técnicas de protección contra la radiación, retire una muestra de 1 mL del vial del producto y:
    1. Aliquote 150 µL en un tubo de 1,5 mL de baja unión a proteínas (Tubo 1) para pruebas de control de calidad previas a la liberación y análisis de disolvente residual.
    2. Aliquote 50 µL en un tubo de 1,5 mL de baja unión a proteínas (Tubo 2) para la prueba de endotoxinas.
    3. Aliquote 300 µL en un vial de vidrio estéril vacío de 10 mL para la prueba de esterilidad (envíe a un contratista externo después de que la muestra haya decaído a un nivel aceptable [10 vidas medias]).
    4. Aliquote 500 µL en un vial de vidrio estéril vacío de 10 mL para retención.
    5. Aliquote el producto restante en un vial (~10 mL) para las dosis del paciente.

8. Control de calidad de [68Ga]Ga-FAPI-46

NOTA: Las pruebas de control de calidad descritas a continuación se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en la Farmacopea Europea40.

  1. Evalúe el aspecto mediante inspección visual.
  2. Evalúe el pH con papel indicador.
  3. Determine la semivida del radionucleido realizando tres mediciones de actividad de una muestra de 50 µL, utilizando una cámara de ionización.
  4. Evalúe la identidad radionucleídica y la pureza radionucleídica mediante un espectrómetro gamma de yodo de sodio (NaI(Tl)) basado en un analizador multicanal (MCA).
  5. Evalúe la identidad radioquímica mediante radio-HPLC analítico, verificando que los tiempos de retención de la muestra de [68Ga]Ga-FAPI-46 y de un estándar de referencia no radiactivo [natGa]Ga-FAPI-46 sean similares (teniendo en cuenta un pequeño volumen de retardo entre los detectores de radiactividad y UV).
  6. Cuantifique el porcentaje de pureza radioquímica mediante radio-HPLC analítico utilizando la ecuación (1).
    Cálculo de la pureza radioquímica; ecuación; AUC de picos radiactivos en el cromatograma del detector de radiactividad. 
  7. Cuantifique el porcentaje de pureza radioquímica mediante radio-TLC analítico utilizando la ecuación (2).
    Fórmula de pureza radioquímica; método cromatográfico; AUC del pico de [68Ga]Ga-FAPI-46; frente del disolvente. 
    NOTA: Los pasos 8.8, 8.9 y 8.10 pueden realizarse antes o después de la liberación, según los requisitos regulatorios locales. Los pasos 8.11 y 8.12 pueden realizarse después de la liberación. Cualquier ensayo posterior a la liberación debe realizarse lo antes posible tras la desintegración radiactiva de la muestra.
  8. Cuantifique el contenido residual de disolvente (etanol) de la formulación mediante cromatografía de gases.
  9. Evalúe los niveles de endotoxinas bacterianas utilizando un sistema de ensayo de endotoxinas basado en cartuchos (método cromogénico cinético con lisado de amebocitos de Limulus [LAL]).
  10. Evalúe la integridad del filtro de 0,22 µm realizando una prueba de burbujas.
  11. Evalúe la pureza radionucleídica (ruptura del germanio-68) mediante un espectrómetro gamma o un contador gamma. Retenga la solución a examinar durante al menos 48 h para permitir que el galio-68 decaiga hasta un nivel que permita la detección de impurezas.
  12. Evalúe la esterilidad del producto.

9. Pruebas de estabilidad

  1. Para el análisis de estabilidad, retire 50 µL de [68Ga]Ga-FAPI-46 del vial del producto final inmediatamente después de la finalización de la síntesis (EOS) y luego nuevamente a intervalos de 1 h hasta 3 h posteriores a la EOS.
  2. Cuantifique el porcentaje de pureza radioquímica mediante HPLC con detección de radiactividad en cada punto de tiempo.
  3. Cuantifique el porcentaje de pureza radioquímica mediante TLC con detección de radiactividad en cada punto de tiempo.

Resultados

Se informa de la eficiencia de radiomarcado evaluada entre 5 y 20 min de reacción a 95 °C en la Tabla 2. Los cartuchos de purificación posterior por SPE HLB 30 mg, Strata X 60 mg y Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg mostraron recuperaciones muy similares (94,3 ± 0,5 % corregido por decaimiento [DC]) (Tabla 3). En nuestros experimentos, la recuperación del cartucho HLB 225 mg fue mucho menor (63,8 ± 3,5 % DC).

Tabla 2: Resumen de la conversión radioquímica de la reacción cruda medida mediante cromatografía en capa fina (TLC) tras 5, 10, 15 y 20 minutos de tiempo de reacción (n = 3). Abreviaturas: TLC = cromatografía en capa fina; Exp. = experimento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resumen del porcentaje de recuperación y de los análisis de pureza radioquímica mediante cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) de [68Ga]Ga-FAPI-46 al final de la síntesis (EOS), utilizando cuatro cartuchos diferentes de extracción en fase sólida (n = 3). Abreviaturas: SPE = extracción en fase sólida; FAPI = inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos; EOS = final de la síntesis; RSD = desviación estándar relativa; TLC = cromatografía en capa fina; HPLC = cromatografía líquida de alta eficacia. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

El protocolo automatizado para la producción de [68Ga]Ga-FAPI-46 se desarrolló utilizando un tiempo de reacción de 10 minutos y un cartucho de extracción en fase sólida (SPE) Strata X de 60 mg. Se realizaron dos series de tres lotes de validación utilizando eluciones de un solo generador y de doble generador, obteniéndose actividades finales promedio del producto de 0,60 GBq y 1,6 GBq, respectivamente (Tabla 4). En ambas series, el [68El producto Ga]Ga-FAPI-46 superó todas las pruebas de control de calidad (Tabla 4). La estabilidad del [68El producto [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 se evaluó determinando la pureza radioquímica del producto mediante análisis por TLC y HPLC (Figura 3 y Figura 4) para las seis producciones durante hasta 3 h posteriores a la síntesis y fue mayor al 98,0 ± 1,8 % (n = 3) y 99,1 ± 0,9 % (n = 3), respectivamente. En general, la síntesis de [68Ga]Ga-FAPI-46 se validó con un rendimiento corregido por decaimiento del 89,8 ± 4,8% (n = 6). La producción automatizada se está utilizando actualmente para la producción de [68Ga]Ga-FAPI-46 para apoyar ensayos clínicos.

Tabla 4: Resumen de los resultados del control de calidad para las corridas de validación de [68Ga]Ga-FAPI-46 (n = 6): a baja actividad a partir de una única elución de generador (n = 3) y a alta actividad a partir de una elución doble de generador (n = 3). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Gráfico de radiactividad frente a distancia para compuestos de \[^{68}\text{Ga}\]; resultados de separación cromatográfica.
Figura 3: Cromatograma de TLC de [68Ga]Ga-FAPI-46: (aplicación de 5 µL) al final de la síntesis (EOS) utilizando papel iTLC-SG y una fase móvil de acetato de amonio 1 M/metanol (1:1 v/v). La radiactividad se midió mediante un escáner de radio-TLC equipado con un detector de radio PS Plastic, integrando cada incremento de 1 mm a una velocidad de 1 mm/s. Abreviaturas: TLC = cromatografía en capa fina; FAPI = inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos; EOS = final de la síntesis; iTLC-SG = cromatografía en capa fina instantánea en gel de sílice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de cromatografía; detección UV y radiodetección de Ga-FAPI-46; intensidad del pico frente al tiempo.
Figura 4: Análisis por HPLC del producto final [68Ga]Ga-FAPI-46. Columna RP-18 encapsulada, fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 %, fase móvil B: acetonitrilo puro. Gradiente: 0-0,5 min 2 % B, 0,5-10,0 min 2 %-35 % B, 10,0-12,0 min 35 % B, y 12,0-15,0 min 35 % B. La longitud de onda UV fue de 280 nm y el caudal de 2 mL/min. (A) Cromatograma UV del producto [68Ga]Ga-FAPI-46, que incluye la señal UV del ascorbato sódico a 1,0 min y los dos picos pequeños a 4,5 y 4,8 min, correspondientes a [natGa]Ga-FAPI-46 y al precursor FAPI-46, respectivamente. Los cromatogramas UV de la muestra patrón de [natGa]Ga-FAPI-46 a 10 mg/L y del precursor FAPI-46 a 10 mg/L se muestran en la Figura S2 suplementaria (Archivo suplementario 1). (B) Radiochromatograma de [68Ga]Ga-FAPI-46 (Rt [68Ga]Ga-FAPI-46 = 4,6 min - Rt [68Ga]Ga3+ libre = 1,1 min). Abreviaturas: HPLC = cromatografía líquida de alta eficacia; FAPI = inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos; Na+Asc- = ascorbato sódico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Este documento incluye: Tabla suplementaria S1 - Síntesis automatizadas y detalles de control de calidad reportados para [68Ga]Ga-FAPI-46, Sección suplementaria 1 - Experimentos preliminares: Optimización del tiempo de reacción y selección del cartucho de SPE postpurificación para la producción automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 en el sintetizador radioquímico MS, Figura suplementaria S1 - Imágenes de los reactivos y configuración final para la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 en el sintetizador MS, Figura suplementaria S2 - Cromatogramas UV de [natGa]Ga-FAPI-46 y del precursor FAPI-46, y Figura suplementaria S3 - Cromatograma radioactivo de [68Ga]Ga-FAPI-46 para la radiomarcación con alta actividad (2,8 GBq) sin ácido ascórbico en el reactor. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este trabajo describe la producción confiable y de alto rendimiento de [68Ga]Ga-FAPI-46 en el sintetizador MS para aplicaciones clínicas. El estudio preliminar de este protocolo probó, en la misma serie de experimentos, diferentes tiempos de reacción para la síntesis de [68Ga]Ga-FAPI-46, así como cuatro cartuchos de SPE diferentes para la purificación del producto final. Con el fin de (i) reducir la dosis de radiación para el operador y (ii) recrear las condiciones en las que se iba a desarrollar la producción rutinaria de [68Ga]Ga-FAPI-46, estos experimentos preliminares también se llevaron a cabo utilizando el sintetizador MS siempre que fue posible. Se creó una secuencia [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando parámetros similares utilizados para la producción de [68Ga]Ga-PSMA-11 y [68Ga]Ga-DOTA-TATE. La secuencia se basa en una programación simple y paso a paso en una hoja de cálculo de Excel y se puede editar fácilmente. Los kits y reactivos se ensamblaron solo para la primera parte de la síntesis [68Ga]Ga-FAPI-46 (elución y purificación de 68Ga; reacción de etiquetado), omitiendo los pasos finales (purificación de SPE y filtración estéril final) ya que estos experimentos preliminares se realizaron manualmente en el material crudo. Como resultado, no fue necesario instalar el cartucho de SPE posterior a la purificación (Strata X 60 mg), así como los viales de etanol, agua y solución salina en el colector 4 y el vial del producto final.

La literatura publicada sobre la producción de [68Ga]Ga-FAPI-46 describe la purificación del producto final utilizando diferentes cartuchos de SPE: OASIS HLB 30 mg sorbente23,29, OASIS HLB Plus 225 mg28, CM26,34, C18 Plus Sep-Pak30,32 y Sep-Pak Light C1831. Este trabajo compara tres de los diferentes cartuchos de SPE utilizados en la literatura (HLB 30 mg; C18 SepPak Plus Short y HLB 225 mg) con el Strata X 60 mg que se proporciona con nuestros casetes existentes para la purificación de [68Ga]Ga-PSMA-11 y [68Ga]Ga-DOTA-TATE. Hasta donde sabemos, el cartucho Strata X 60 mg SPE aún no había sido evaluado para la purificación de [68Ga]Ga-FAPI-46. Los Strata X 60 mg mostraron similares (HLB 30 mg; C18 SepPak Plus Short) o mejor rendimiento (HLB 225 mg) que otros SPE utilizados en la literatura para la purificación de [68Ga]Ga-FAPI-46, con respecto a la eficiencia de captura y elución (Tabla 3). La elución del HLB 225 mg con un mililitro extra de etanol no dio lugar a una mejoría significativa (resultados no mostrados). Se seleccionó el cartucho Strata X 60 mg para la validación de la síntesis totalmente automatizada descrita en este protocolo.

La síntesis automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 descrita en el protocolo anterior se puede describir en cuatro pasos principales. El primer paso es la elución de uno o dos generadores de 68Ge/68Ga con HCl de 0,1 M y el posterior atrapamiento de [68Ga]GaCl3 en el cartucho de intercambio iónico. A esto le sigue la elución de [68Ga]Ga3+ del cartucho de intercambio iónico en el recipiente de reacción (precargado con la solución precursora que contiene 50 μg de precursor FAPI-46, 1,4 ml de agua que contiene una concentración de nivel traza de metal y 7 mg de ácido ascórbico) utilizando una solución acidificada de cloruro de sodio 5 M. El pH de la reacción de etiquetado es 3.5-4. El siguiente paso es la reacción de radiomarcaje durante la cual el reactor se calienta a 95 ° C durante 10 min para permitir la complejación del [68Ga] Ga3+ por la fracción DOTA del precursor FAPI-46. Después de enfriar la mezcla de reacción a 40 °C, el cuarto y último paso es la purificación de [68Ga]Ga-FAPI-46 que consiste en (i) atrapar y purificar la mezcla de reacción en el cartucho de SPE Strata X 60 mg posterior a la purificación, (ii) enjuagar el cartucho Strata X 60 mg SPE con agua inyectable, (iii) elución del producto final con etanol, (iv) dilución con solución salina para inyección y (v) transferencia al vial del producto final a través de un filtro ventilado esterilizante de 0,22 μm. La reacción se puede monitorear en tiempo real mediante inspección visual y lecturas de sensores (por ejemplo, temperatura, presión, vacío, lectura de radiación y temporizadores de cuenta regresiva). En la Figura 1A, B se muestra una captura de pantalla representativa de la interfaz de usuario. El perfil de radiactividad que se muestra en la Figura 2 es particularmente útil para monitorear el progreso de la síntesis al mostrar la transferencia de radiactividad a través de los pasos críticos descritos anteriormente.

Se realizaron seis ciclos de validación que superaron todas las especificaciones de control de calidad, utilizando uno o dos generadores de 68Ge/68Ga (2,41 GBq). Se completaron tres ejecuciones utilizando 68Ga de una sola elución de generador, lo que produjo 0,59-0,63 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Se completaron tres ejecuciones utilizando 68Ga eluidos de dos generadores, produciendo 1,54-1,71 GBq de [68Ga]Ga-FAPI-46. Cada carrera se completó en ~ 25 min. El método de generador único se diseñó anticipando la necesidad de que se produzcan actividades superiores en el futuro. En consecuencia, se agregaron 7 mg de estabilizador de ácido ascórbico a la mezcla de reacción para evitar la radiólisis durante el paso de radiomarcado, como lo describieron anteriormente Mu et al. para la producción de [68Ga]Ga-DOTA-TATE41. Da Pieve et al.29 y Alfteimi et al.30 también han informado de la adición de 0,3 mg de estabilizador de ácido ascórbico a la mezcla de reacción para la producción automatizada de [68Ga]Ga-FAPI-46 (Tabla complementaria S1-Archivo complementario 1). De hecho, observamos una radiólisis significativa para una síntesis de alta actividad (~ 2,8 GBq en el reactor) cuando se omitió el estabilizador de ácido ascórbico de la mezcla de reacción (Figura complementaria S3-Archivo complementario 1). Además, para evitar la radiólisis del producto final, se agregaron manualmente 5 mg de ascorbato de sodio en 1 ml de solución salina al 0,9% para inyección al vial del producto final a través del filtro esterilizador, lo que resultó en un volumen de producto final de 11 ml. Cada lote se probó hasta 3 h después de la producción y tanto las producciones de baja actividad (elución de un solo generador) como de alta actividad (elución de doble generador) demostraron una excelente estabilidad radioquímica (>95% por HPLC y TLC). Es importante destacar que la aplicación de este protocolo implica la manipulación de materiales radiactivos no sellados y sólo debe ser realizada por personal debidamente capacitado. El protocolo debe realizarse detrás de un blindaje contra la radiación, preferiblemente dentro de una celda caliente ventilada. El propósito esperado de la síntesis de [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando este protocolo es la administración a pacientes para diagnóstico por imágenes. Como tal, se deben seguir estrictas técnicas asépticas en todo momento. Las pruebas de control de calidad de [68Ga]Ga-FAPI-46 como se describe en el protocolo anterior son fundamentales para garantizar la calidad del producto final.

Se prevé que cualquier sitio de fabricación de [68Ga]Ga-PSMA-11 o [68Ga]Ga-DOTA-TATE en el sintetizador MS debe estar completamente equipado para preparar [68Ga]Ga-FAPI-46 utilizando el protocolo descrito aquí, con solo modificaciones menores requeridas para el uso de generadores o reactivos alternativos. Debido a la creciente demanda de [68Ga]Ga-FAPI-46 en las clínicas, el trabajo presentado aquí fue diseñado para satisfacer diversas necesidades y capacidades del sitio, desde la producción de 1-2 dosis para pacientes de [68Ga]Ga-FAPI-46 por síntesis en el método de generador único y hasta 4-5 pacientes por síntesis para el método de generador dual, dependiendo de la disponibilidad de cámaras PET.

Divulgaciones

Los autores no tienen asociaciones comerciales o fuentes de financiación que puedan dar lugar a un conflicto de intereses real o percibido en relación con este trabajo para divulgar.

Agradecimientos

Los autores reconocen y agradecen a SOFIE Biosciences Inc. por suministrar el precursor químico FAPI-46 y el estándar [natGa]Ga-FAPI-46, a la Fundación Charlies para la Investigación por su apoyo financiero, a Stan Poniger de iPHASE Pty Ltd, y al equipo de Producción de Radiofármacos (RAPID) en el Departamento de Tecnología Médica y Física del Hospital Sir Charles Gairdner por su apoyo científico y técnico. Los autores también agradecen la asistencia del Nodo de la Instalación Nacional de Imágenes de WA, que cuenta con el apoyo de fondos de infraestructura del Gobierno del Estado de Australia Occidental en asociación con el Gobierno Federal de Australia, a través de la capacidad de la Estrategia Nacional de Infraestructura de Investigación Colaborativa (NCRIS).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.1 M Ácido clorhídrico (HCl) ultra puroCompuesto bioquímico avanzado ABX (Radberg, Alemania)HCl-103-GUtilizado para la elución de generadores(s)
Acetato de amonioSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)A1542-250GSe utiliza para fabricar iTLC fase móvil
C18 SepPak Plus corto (360 mg)AguasWAT020515Sílice post-purificación SPE
Rendimiento de cromolito RP-18 con tapa final 100-4.6 monolíticoMerck Pty Ltd (Victoria (Australia)1021290001Columna con tapa final de HPLC RP-18, utilizada para el control de calidad de HPLC
Calibrador de dosisCapintecCRC-15PETSe utiliza para calibrar y medir la actividad de 68Ga
Escaneo dual-RAM LabLogic Limited (VA, EE. UU.)Escáner SR-1ARadio-TLC para analizar el papel iTLC
Precursor FAPI-46 (GMP)Compuesto bioquímico avanzado ABX (Radberg, Alemania)3601.0000.050Precursor de péptidos
Facilidad de llenado Vial de vacío estéril (10 mL)HUAYI iosotopesSVV-10CSe utiliza para muestras de esterilidad y retención
Facilidad de llenado Vial de vacío estéril (25 mL)HUAYI iosotopesSVV-25ASe utiliza para
el radiomarcaje de péptidos Ga68 del producto final con prepurificación del generadoriPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSR-120G-(RK-3296)Conjunto dereactivos 
Radiomarcaje Ga68 con prepurificación del generadoriPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSH-120Hardware Cassette + conjunto de auxiliares 
Sistema de cromatografía de gases (GC)Agilent technologies (Vic, Australia)G2630ASe utiliza para medir el disolvente residual
Fuente estándar GS (Ba133)Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia)D-102-19Se utiliza para calibrar el espectrómetro gamma
GS Fuente estándar (Co60)Global Medical Solutions Pty Ltd (Australia)1559-84Se utiliza para calibrar el espectrómetro gamma
Sistema de cromatografía líquida (HPLC) de alta resoluciónShimadzu Scientific Instruments (NSW, Australia)Equipo de HPLCLC-20
Aguja de ventilación de aire hidrofóbicaBaldwin Medical (Victoria, Australia)1088Utilizado con vial de producto final
  IGG100 Eckert & Productos de isótopos de Ziegler  (Berlín, Alemania)IGG100-65M-NTGenerador de 68Ge/68Ga
Jeringa de 5 mL (Jeringa Injekt luer lock solo)B Braun (Melsungen, Alemania)4606710VJeringas de polipropileno (PP)/polietileno (PE), sin látex, PVC y silicona Jeringa sin aceite utilizada para reactivos
Papel iTLC-SGAgilent technologies (Vic, Australia)SGI0001Se utiliza para el análisis de iTLC
Software LabLogic (LAURA)LabLogic Limited (VA, EE. UU.)LAURA versión de software 6.1Se utiliza para el análisis de radio-TLC
Ácido L-ascórbico Trace selectFluka Sigma05878-100GSe utiliza como eliminador de radicales en la mezcla de reacción
Lichrosolv Acetonitrilo (ACN)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.00030.2500Se utiliza para hacer HPLC fase móvil
orgánica Lichrosolv WaterSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.15333.2500Se utiliza para fabricar el detector
metanol (MeOH)Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1060182500Se utiliza para fabricar
detector de > de fase móvil de Na+I-LabLogic Limited (VA, EE. UU.)" NaI / PMTutilizado para radio-HPLC
Oasis HLB (30 mg)Waters (Milford, MA, USA)WAT094225Copolímero de postpurificación SPE
Oasis HLB Plus corto (225 mg)Waters (Milford, MA, USA)186000132Copolímero de postpurificación SPE
Tiras de pHThermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd90424Se utiliza para medir el pH del producto
Detector de PS LabLogic Limited (VA, EE. UU.)Radiodetector de plástico/PMTPS utilizado para radio-TLC
  Tubo Safe Lock (1,5 mL)Eppendorf0030 120.086Utilizado para muestras de control de calidad
(+)-L-ascorbato de sodioMerck Pty Ltd (Victoria (Australia)11140-250GEstabilizador del producto final
Solución de cloruro de sodio (NaCl) (solución salina)PfizerPS1110,9%, para inyección, grado USP
Sterican 100 AgujasB Braun (Melsungen, Alemania)4667093Utilizado para producto final
Filtro de jeringa estéril (0,22 y micro; m)Millipore Sigma (Burlington, MA, EE. UU.)SLGSV255FMillex-GV
Strata SCX (en kit de casete de hardware)Kit de hardware interior Phenomenex de iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSH-120SPE de sílice de prepurificación dentro de casete de hardware
Strata X (en kit de casete de hardware)Kit de hardware interior Phenomenex de iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSH-120Sílice de postpurificación SPE en el interior del casete de hardware
Trace Select Water para el análisis de trazasHoneywell Riedel-de-Haen95305-2.5LSe utiliza para la mezcla de reacción y para preacondicionar el cartucho SPE de prepurificación
Ácido trifluoracético (TFA)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)302031-10X1mLSe utiliza para fabricar la fase móvil acuosa de HPLC
Jeringa de insulina ultrafina (0,5 mL)BD326769Se utiliza para la dispensación de muestras de control de calidad
Filtro ventilado Cathivex-GV 0.22 & m, membrana de PVDF Durapore de baja unión a proteínasMerk Millipore (Cork, Irlanda)SLGV02505Se utiliza para filtrar el producto final
de de fase móvil acuosa de HPLCSigma el Radiodetector de 1

Referencias

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