Desarrollo de un electrodo de electromiografía epimisial de bajo costo: un flujo de trabajo simplificado para la fabricación y las pruebas

Resumen

Nuestro propósito era proporcionar una guía actualizada y fácil de seguir sobre la fabricación y las pruebas de electrodos de electromiografía epimisial. Con ese fin, proporcionamos instrucciones para el abastecimiento de materiales y un recorrido detallado del proceso de fabricación y prueba.

Resumen

La electromiografía (EMG) es una valiosa herramienta diagnóstica para detectar anomalías neuromusculares. Los electrodos epimisiales implantables se utilizan habitualmente para medir las señales de EMG en modelos preclínicos. Aunque existen recursos clásicos que describen los principios de la fabricación de electrodos epimisiales, existe una escasez de información ilustrativa que traslada la teoría de los electrodos a la práctica. Para remediar esto, proporcionamos una guía actualizada y fácil de seguir sobre cómo fabricar y probar un electrodo epimisial de bajo costo.

Los electrodos se fabricaron doblando e insertando dos láminas de platino-iridio en una base de silicona precortada para formar las superficies de contacto. A continuación, se soldaron alambres de acero inoxidable recubiertos a cada superficie de contacto para formar los cables de los electrodos. Por último, se utilizó una mezcla de silicona para sellar el electrodo. Se realizaron pruebas ex vivo para comparar nuestro electrodo fabricado a medida con un electrodo estándar de la industria en un baño salino, donde se encontraron altos niveles de concordancia de señal (seno [correlación intraclase - ICC= 0,993], cuadrado [ICC = 0,995], triángulo [ICC = 0,958]) y sincronía temporal (seno [r = 0,987], cuadrado [r = 0,990], triángulo [r = 0,931]) en todas las formas de onda. También se cuantificaron niveles bajos de impedancia del electrodo mediante espectroscopia de impedancia electroquímica.

También se llevó a cabo una evaluación del rendimiento in vivo en la que el músculo vasto lateral de una rata se instrumentó quirúrgicamente con el electrodo fabricado a medida y se adquirió la señalización durante la marcha cuesta arriba y cuesta abajo. Como se esperaba, la actividad máxima de EMG fue significativamente menor durante la caminata cuesta abajo (0,008 ± 0,005 mV) que cuesta arriba (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), lo que respalda la validez del dispositivo. La fiabilidad y biocompatibilidad del dispositivo también fueron respaldadas por la señalización consistente durante la marcha nivelada a los 14 días y 56 días después de la implantación (0,01 ± 0,007 mV, 0,012 ± 0,007 mV respectivamente; p > 0,05) y la ausencia de inflamación histológica. En conjunto, proporcionamos un flujo de trabajo actualizado para la fabricación y prueba de electrodos epimisiales de bajo costo.

Introducción

La electromiografía (EMG) es una herramienta poderosa para estudiar la actividad eléctrica del músculo. Los registros EMG pueden ser especialmente útiles en modelos animales preclínicos para evaluar la efectividad de las intervenciones para tratar la disfunción neuromuscular. En estos modelos, los electrodos biocompatibles implantables se utilizan comúnmente para evaluar la interfaz neurofisiológica entre las neuronas motoras y las fibras musculares. Estos electrodos implantables pueden proporcionar mediciones localizadas de la excitación muscular y pueden ser diversos en términos de su configuración, forma y material, con el diseño óptimo dictado en última instancia por la ubicación y el uso previsto.

A pesar de su idoneidad para evaluar la excitación muscular en modelos preclínicos, el uso de electrodos epimisiales puede estar limitado por el costo. Como resultado, muchos investigadores utilizan electrodos epimisiales fabricados a medida que se producen internamente. Aunque existen recursos que detallan las consideraciones fundamentales de la fabricación, las pruebas y el uso de electrodos ^1,2, existe la necesidad de una guía instructiva actualizada que detalle el abastecimiento, la fabricación y la validación de los electrodos epimisiales utilizando métodos modernos. Informados por los trabajos fundacionales de Loeb y Gans³ y otros en la teoría de electrodos, presentamos instrucciones modernas sobre el abastecimiento y la fabricación de electrodos epimisiales de bajo costo y probamos su rendimiento en una serie de experimentos ex vivo e in vivo. El objetivo es ofrecer una guía fácil de usar para que otros miembros de la comunidad científica obtengan, fabriquen y prueben electrodos epimisiales de bajo costo para uso animal, lo que permite una cuantificación más amplia de la excitación muscular en modelos preclínicos.

En este protocolo, proporcionamos una guía instructiva para el abastecimiento, la fabricación y las pruebas de electrodos epimisiales para uso animal en el laboratorio de electrofisiología moderno. Los parámetros del electrodo elegidos para la fabricación, como la forma, las dimensiones, el área de superficie de contacto, la distancia entre electrodos, la longitud del cable, etc., se seleccionaron para satisfacer nuestras necesidades experimentales y eran comparables a un electrodo epimisial estándar de la industria disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Alentamos a otros grupos a modificar estos parámetros para adaptarlos a sus necesidades, además de seleccionar un electrodo estándar de la industria confiable que coincida con su caso de uso.

En un esfuerzo por dar a los lectores una idea relativamente rápida del rendimiento del electrodo, también proporcionamos un ejemplo de un protocolo de prueba ex vivo con la opción de medir la impedancia del electrodo. Además, damos un ejemplo de evaluación del rendimiento de los electrodos in vivo. El experimento ex vivo comparó el electrodo fabricado a medida con un estándar de la industria en un baño salino para imitar condiciones fisiológicas estables. La impedancia también se evaluó ex vivo mediante espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El experimento in vivo consistió en la implantación quirúrgica del electrodo fabricado a medida en el músculo vasto lateral (VL) de una rata Long Evans hembra de 16 semanas de edad (HsdBlu: LE, Envigo) para medir la señal EMG en condiciones conocidas por provocar una señal alta o baja (cuesta arriba, cuesta abajo, caminando cuesta abajo). Para evaluar la fiabilidad del electrodo fabricado a medida, la señalización EMG se adquirió durante la caminata nivelada después de la recuperación quirúrgica completa y antes del sacrificio (14 días y 56 días después de la implantación, respectivamente). Se llevó a cabo una tinción de hematoxilina-eosina (H&E) en el músculo instrumentado para evaluar la biocompatibilidad del electrodo fabricado a medida.

Protocolo

El procedimiento in vivo se llevó a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (#PRO00010765 de aprobación de IACUC) y de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Abastecimiento y fabricación de electrodos

NOTA: La Figura 1 proporciona un resumen de alto nivel de todos los pasos clave de fabricación con un enlace QR que proporciona instrucciones visuales adicionales.

1. Obtenga materiales de electrodos biocompatibles directamente del fabricante a granel para su fabricación. Consulte la Tabla de materiales, que contiene todos los componentes del electrodo y detalles sobre el abastecimiento.
   NOTA: Asegúrese de que la base de silicona, el sellador de silicona y las láminas de contacto de platino-iridio sean biocompatibles para evitar una respuesta inmunitaria adversa y permitir la implantación crónica. Para respaldar las ventajas económicas de la fabricación interna, presentamos un análisis detallado de costos del electrodo epimisial fabricado a medida en comparación con el estándar de la industria (Tabla de materiales).
2. Prepare la plantilla de corte y plegado (archivo complementario 1, archivo complementario 2). Utilice el software de impresión 3D seleccionado para diseñar plantillas de corte y plegado para la producción en serie de electrodos epimisiales idénticos.
   1. Diseñe la plantilla de corte para garantizar perforaciones de tamaño y espaciado uniformes de la base de silicona para un área de superficie de contacto y una distancia entre electrodos iguales en todos los electrodos.
   2. Cree la plantilla plegable para plegar las superficies de contacto de platino-iridio y simplificar la colocación de las láminas en la base de silicona.
      NOTA: Se proporcionan archivos Gcode; Modifique las dimensiones y especificaciones de la plantilla de corte y plegado para adaptarla a las necesidades experimentales.
3. Perfora la base de silicona. Coloque la base de silicona en la plantilla de corte y péguela con cinta adhesiva. Perfore la silicona con las guías de la plantilla de corte con un cuchillo X-acto para colocar las láminas de contacto.
4. Inserte las láminas en la base de silicona para formar las superficies de contacto. Doble las láminas de contacto de platino-iridio precortadas biocompatibles (1,25 mm x 5 mm) en forma de U con la plantilla plegable. A continuación, guíe los brazos de las láminas dobladas hacia las ranuras perforadas de la base de silicona para construir las superficies de contacto del electrodo. De esta manera, inserte las 12 láminas en la base de silicona; Deje una sola columna abierta entre los electrodos para garantizar un espaciado adecuado.
   NOTA: Esta configuración permitirá la fabricación de 6 electrodos epimisiales bipolares; La edición de la plantilla de corte puede ampliar la capacidad si es necesario.
5. Retire la base de silicona de la plantilla de corte. Coloque un trozo de cinta quirúrgica sobre las superficies de contacto para mantener las láminas en su lugar. A continuación, retire la base de silicona de la plantilla de corte, déle la vuelta para que los brazos de la lámina en forma de U queden expuestos y doble un brazo de la lámina en forma de U al ras de la base de silicona.
6. Conecte los cables de los electrodos. Prepare un alambre de acero inoxidable recubierto de perfluoroalcoxi (PFA) cortándolo a la longitud deseada. A continuación, desnude un extremo del alambre de acero inoxidable ~ 1 cm con un encendedor disponible en el mercado. Coloque el extremo desnudado del alambre de acero inoxidable en el interior del brazo desplegado de la lámina. Suelde el alambre de acero inoxidable al brazo de la lámina con una soldadora Micro TIG (ancho de pulso = 0, energía de soldadura = 25).
7. Inspeccione la interfaz de plomo-lámina. Pruebe la conexión de alambre aplicando tensión al alambre de acero inoxidable. Si la conexión se mantiene, doble el brazo de la lámina hacia abajo al ras de la base de silicona y retire la cinta que bordea la lámina de silicona.
   NOTA: Aplique una tensión que sea representativa de la tensión aplicada en el caso de uso especificado.
8. Selle el electrodo. Para lograr una consistencia más fina, mezcle 1 g de silicona líquida biocompatible con 0,75 mL de tolueno. Extraiga la mezcla con una jeringa de punta roma de 18 G y aplíquela en el lado soldado de cada electrodo para sellar la parte posterior de los electrodos.
   PRECAUCIÓN: El tolueno es inflamable, puede ser mortal si se ingiere o entra en las vías respiratorias y causa irritación de la piel. Trabaje debajo de la campana extractora y manténgalo alejado de llamas abiertas.
9. Separe el lote en electrodos individuales. Deje que el tolueno de silicona se asiente durante 72 h antes de manipular el electrodo. A continuación, utilice unas tijeras para cortar la base de silicona en electrodos individuales con un tamaño de 10 x 5 mm.
   NOTA: El tamaño del electrodo dependerá de las dimensiones de la plantilla de corte y del caso de uso específico. Autoclave y/o electrodos limpios en un baño ultrasónico.

Figura 1. Pasos para la fabricación de electrodos. (A) Base de silicona perforada. (B) Forme láminas en forma de U con la plantilla plegable. (C) Inserte láminas en forma de U en la base de silicona perforada. (D) La base de silicona contiene 12 láminas para formar 6 electrodos bipolares. (E) Aplique cinta quirúrgica a la base para asegurar las láminas durante la extracción de la plantilla de corte. (F) Retire la base de silicona de la plantilla de corte. (G) Denude el alambre de acero inoxidable recubierto de PFA y suelde al brazo de lámina vertical con un soldador Micro TIG. (H) Alinee los alambres denudados, aplique sellador de silicona-tolueno y deje que se asiente. (I) Divida la base de silicona en electrodos individuales y límpiela en un baño ultrasónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Ensayos ex vivo

1. Conecte los electrodos a un dispositivo de registro. Fije cada cable conductor de electrodo a un canal en una placa de interfaz de electrodo (EIB). Repita este paso (usando el mismo EIB) para un electrodo estándar de la industria seleccionado para comparar. Conecte el EIB a una plataforma de adquisición de datos a través de un sistema de cable magnético anclado.
   NOTA: El electrodo estándar de la industria puede ser cualquier electrodo que se considere confiable y que se adapte a las necesidades experimentales.
2. Poner a tierra el BEI. Desnudo un extremo de un acero inoxidable recubierto de PFA y suelde por puntos a una fuente de conexión a tierra (por ejemplo, un tornillo de acero inoxidable). Fije el cable conductor de tierra a la misma placa de interfaz de electrodo en la posición designada como "tierra".
3. Prepara el baño de solución salina. Llene un vaso de precipitados (250 ml) con 180 ml de solución salina fisiológica (solución salina estéril al 0,9%)⁴. Sumerja los electrodos epimisiales fabricados a medida y estándar de la industria en el baño salino y asegúrelos en una posición estable. A continuación, sumerja la fuente de conexión a tierra en el baño de solución salina y asegure su posición. Por último, sumerja y coloque dos electrodos de aguja estimulante en el baño salino y conecte los electrodos estimulantes al generador de señales.
4. Utilice un generador de señales para evaluar la concordancia de la señal y la sincronía temporal. Utilice un generador de señales para entregar formas de onda repetidas a un voltaje y frecuencia seleccionados (0,1 V y 5 Hz) en el baño salino a través de los electrodos estimulantes (Figura 2). Entregue varias formas de onda (sinusoidal, cuadrada y triangular) para comparar las señales registradas entre el electrodo epimisial fabricado a medida en relación con el estándar de la industria.
5. Evalúe el rendimiento de manera informal y visual en tiempo real para evaluar el grado en que varían las señales entre electrodos. Realice correlaciones intraclase (ICC) y correlaciones de Pearson para evaluar la concordancia de la señal y la sincronía temporal, respectivamente.
   NOTA: Para los fines de nuestro análisis, se adquirieron 8.000 muestras a 4.000 Hz y se filtraron en tiempo real con un filtro Butterworth de paso alto y bajo (paso alto = 75 Hz; paso bajo = 2 kHz).
6. Mida la impedancia del electrodo. Para medir la impedancia del electrodo, recopile EIS en los electrodos fabricados a medida (por ejemplo, 10 electrodos) en frecuencias de 10 Hz-31 kHz⁵ con un potenciostato utilizando el procedimiento descrito a continuación por Richie et al.⁶. Consulte Sarolic et al. para obtener información adicional sobre la medición de la impedancia del electrodo en electrodos bipolares⁷.
7. Siguiendo el procedimiento de Richie et al., sumerja el electrodo epimisial 1 mm en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Utilice un cloruro de plata-plata (Ag|AgCl) y una varilla de acero inoxidable como contraelectrodo para completar el circuito.
8. Suspender el Ag|Electrodo de referencia AgCl y la varilla de acero inoxidable en el 1x PBS mediante una pinza de precipitado. Conecte el electrodo de referencia a la referencia del sistema de impedancia que se está utilizando y conéctelo a la entrada del contraelectrodo del sistema de impedancia que se está utilizando.
9. Utilice un potenciostato para ejecutar un escaneo de impedancia de 1 kHz. Ajustado a una frecuencia de escaneo de 1 kHz a 0,01 V_rms en una sola forma de onda sinusoidal. Durante los primeros 5 segundos de la exploración, ajuste el potenciostato a 0 V para estabilizar la señal grabada. Utilice el software asociado al potenciostato para registrar las mediciones.

Figura 2: Prueba ex vivo: baño de solución salina que contiene el electrodo fabricado a medida, electrodos estándar de la industria, dos electrodos estimulantes y una fuente de tierra. La concordancia de la señal y la sincronía temporal se evaluaron mediante la entrega de ondas sinusoidales, cuadradas y triangulares al baño salino desde el generador de señales y el registro de las formas de onda detectadas por los respectivos electrodos utilizando una plataforma de adquisición de datos. NOTA: La espectroscopia de impedancia electroquímica no se muestra en la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Ensayos in vivo

NOTA: El procedimiento de prueba in vivo describe nuestro caso de uso experimental. Se recomienda que los electrodos epimisiales fabricados a medida se prueben in vivo de una manera que coincida con las condiciones experimentales previstas por el usuario.

1. Revisar la información quirúrgica; Consulte información para cirujanos que están aprendiendo el proceso de implantación de electrodos de registro neural crónico utilizando los siguientes recursos ^8,9.
   NOTA: Dado que nuestro manuscrito se centra en la fabricación y las pruebas de electrodos, aquí solo proporcionamos una breve descripción de las técnicas quirúrgicas utilizadas en nuestro laboratorio para las pruebas de electrodos in vivo .
2. Seleccione una rata para instrumentarla (por ejemplo, una rata Long Evans hembra a las 16 semanas de edad). Haga que la rata se someta a un período de 1 semana de aclimatación en el laboratorio antes de la aclimatación en la cinta de correr. Después de la aclimatación en el laboratorio, exponga gradualmente a la rata a una cinta de correr para roedores a velocidades crecientes de hasta 16 m/min.
3. Prepare el BEI conectando primero un electrodo epimisial fabricado a medida al BEI fijando cada cable de electrodo a un canal en el BEI. Para conectar a tierra el EIB, desnude un extremo de un alambre de acero inoxidable recubierto de PFA y suelde por puntos a una conexión a tierra seleccionada (por ejemplo, tornillo de acero inoxidable). A continuación, fije el cable conductor de tierra al mismo EIB en la posición designada como "tierra".
   NOTA: Para proteger el electrodo durante la instrumentación, envuélvalo con una cubierta protectora (por ejemplo, parafilm).
4. Desinfecte todas las herramientas quirúrgicas, así como el área quirúrgica antes de comenzar. Utilice suministros quirúrgicos sellados y asépticos y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos que no estén en envases estériles. Cree un campo quirúrgico estéril con un paño quirúrgico.
5. Anestesiar al animal mediante una cámara de inducción con 3-5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno y mantener a través de un cono nasal con 2% de isoflurano y 500 mL de oxígeno mientras se prepara a la rata. Después de alcanzar el plano quirúrgico de la anestesia, se evaluó mediante un pellizco en los dedos de los pies, se aplique ungüento para los ojos, se controle la frecuencia respiratoria (70-110 respiraciones/min) y se evalúe la temperatura central con una sonda rectal.
6. A continuación, afeite el sitio quirúrgico con tijeras para animales y elimine los desechos del sitio quirúrgico. Una vez afeitada la zona quirúrgica, desinfecte el sitio quirúrgico con clorhexidina, alcohol isopropílico y povidona yodada frotando desde el centro hasta el exterior de la zona quirúrgica. Administrar analgésicos según corresponda y estar aprobado y proporcionar calor para mantener la temperatura corporal central (37,5-38,5 °C). Después de la preparación, coloque a la rata en un marco estereotáctico y establezca el campo estéril.
7. Para una adecuada preparación quirúrgica del cirujano, lávese bien las manos con jabón y/o un desinfectante (clorhexidina). Use el EPP adecuado: mascarilla, guantes estériles y una bata/blusa desechable. Use guantes estériles nuevos si se viola la técnica aséptica por cualquier motivo.
8. Para instrumentar la VL derecha, use un bisturí para hacer una incisión de 3-5 cm en la porción anterolateral de la extremidad posterior derecha y use una disección roma para identificar el músculo VL.
9. Realice una incisión de 1 cm en el plano sagital a lo largo de la sutura coronal y exponga el cráneo. Con un par de pinzas delgadas, haz un túnel subdérmico desde la extremidad posterior derecha hasta la base del cráneo. Use las pinzas para agarrar el electrodo y dirigirlo al VL.
10. Use un taladro para huesos para crear un agujero en la calvaria (asegúrese de que las especificaciones del taladro coincidan con las del tornillo de tierra). Asegure el tornillo de tierra y fije el EIB al cráneo con cemento dental.
    NOTA: Se pueden aplicar pequeñas cantidades de peróxido de hidrógeno para aumentar la porosidad del cráneo y mejorar la adherencia del cemento dental.
11. Una vez identificado el músculo VL, implante el electrodo epimisial fabricado a medida implantado en línea con las fibras musculares utilizando un monofilamento no absorbible 4-0. Cierre la incisión con pinzas para heridas o suturando.
12. Después del cierre, retire al animal de la anestesia y colóquelo individualmente en una jaula limpia y seca. Permita que la rata se recupere en una almohadilla térmica y controle la temperatura y la frecuencia respiratoria de la rata cada 15 minutos hasta que el animal esté ambulatorio. Tratar el dolor postquirúrgico mediante la administración de un analgésico aprobado en los días posteriores a la instrumentación.
    NOTA: la rata debe ser alojada individualmente hasta que se recupere por completo.
13. Después de un período de 14 días, realice una prueba de electrodos in vivo para evaluar la validez del electrodo epimisial fabricado a medida para capturar las alteraciones fisiológicas en la actividad muscular. Coloque a la rata instrumentada en una cinta de correr para roedores y expóngala aleatoriamente a condiciones de caminata cuesta arriba y cuesta abajo que provoquen un aumento o disminución en la señalización de VL EMG (16° de inclinación, 16° de descenso a 16 metros/minuto). Recopile datos longitudinales (por ejemplo, 14 días y 56 días después de la instrumentación) para garantizar la fiabilidad a lo largo del tiempo.
    NOTA: Se han seleccionado evaluaciones de 14 y 56 días ya que un período de 14 días permite una recuperación quirúrgica completa y el de 56 días supera nuestro cronograma experimental. Alentamos a otros a probar el rendimiento y la confiabilidad de los electrodos utilizando un marco de tiempo que replique su línea de tiempo experimental antes de su uso. La velocidad (16 m/min) y las condiciones de marcha (16° de inclinación, 16° de descenso) se seleccionaron para que coincidieran con las condiciones establecidas de aumento y disminución de la excitación de VL en este modelo¹⁰.
14. Modificar los parámetros de adquisición para adaptarlos a las necesidades experimentales. Capture la señalización EMG durante la marcha a una velocidad de 2.000 Hz utilizando la plataforma de adquisición de datos y sincronícela con un sistema de captura de movimiento.
    NOTA: Si utiliza un dispositivo de adquisición diferente, recoja EMG y captura de movimiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante y para satisfacer las necesidades experimentales.
15. Extraiga 25 s de datos de marcha de cada condición de marcha y expórtelos a un script de Python personalizado para su posterior procesamiento y análisis de señales. Ajuste de línea de base (cero), rectifique y suavize mediante un algoritmo de cuadrático medio con un ancho de intervalo de 50 ms. Aplique un algoritmo de detección de picos para seleccionar picos RMS-EMG y utilizarlos para análisis de datos posteriores.
    NOTA: Hemos descrito brevemente los métodos para preprocesar y analizar los datos de EMG, ya que este paso varía mucho debido a los lenguajes de programación y al software y hardware de adquisición de EMG. Recomendamos a los autores que consulten los siguientes recursos para obtener información adicional^: 3,11,12,13.

4. Pruebas de biocompatibilidad

1. Una vez finalizadas las recolecciones longitudinales de EMG (o en un momento seleccionado), se sacrificará a la rata utilizando métodos apropiados y aprobados (p. ej., asfixia con CO₂ seguida de toracotomía bilateral).
2. Después de la eutanasia, extraiga los músculos VL bilaterales creando una incisión en las extremidades posteriores anterolateral derecha e izquierda. Congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.
   NOTA: Tenga cuidado de mantener el electrodo en posición en el músculo instrumentado (por ejemplo, el VL derecho) durante la extracción. Alternativamente, marque la región del subelectrodo o extraiga solo el músculo de la región del subelectrodo. Esto no se aplica al músculo contralateral/de control.
3. Utilice un criostato para cortar secciones transversales de músculo en serie (7 μm) de la región directamente debajo de la interfaz electrodo-fascial. Corte secciones del vientre muscular de la VL contralateral para que sirvan como control. Ver Kumar et al. para más detalles sobre la criosección¹⁴.
4. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E); véase Wang et al. para más detalles sobre la tinción de H&E en secciones transversales del músculo esquelético¹⁵.
5. Examine las secciones teñidas (instrumentadas y de control) con un microscopio óptico con un aumento de 20x. Analizar los cambios histológicos ciegos al origen de las muestras. Evaluar la salud de los tejidos evaluada utilizando las siguientes características patológicas: infiltración de células inmunitarias, acumulación mionuclear interna, fibrogénesis y fragmentación del sarcolema.

5. Análisis estadísticos sugeridos

1. Para evaluar el rendimiento del electrodo epimyisal fabricado a medida en comparación con el estándar de la industria, importe los datos ex vivo a un paquete estadístico seleccionado. Aplique las siguientes pruebas estadísticas a los datos ex vivo recopilados de los electrodos fabricados a medida y estándar de la industria (por ejemplo, 8,000 muestras representativas de las formas de onda sinusoidal, triangular y cuadrada). Establezca el nivel de alfa a priori en p ≤ 0.05.
   1. Para probar el nivel de concordancia de la señal entre los electrodos, utilice correlaciones intraclase (ICC) y gráficos de Bland-Altman. Calcule las estimaciones de la ICC y sus intervalos de confianza del 95% sobre la base de un modelo de efectos aleatorios de una sola calificación (k = 2), de acuerdo absoluto y de 2 vías.
   2. Para probar el grado en que el registro de las formas de onda covarió a lo largo del tiempo, también conocido como sincronía temporal, realice la correlación de Pearson en los valores recopilados con los electrodos fabricados a medida y estándar de la industria.
   3. Compare la impedancia media del electrodo para ambas superficies de contacto (medida a 1 kHz) de electrodos seleccionados fabricados a medida (por ejemplo, 10 electrodos) con la impedancia del electrodo estándar de la industria.
      NOTA: Los valores de impedancia del electrodo variarán según el caso de uso y los materiales utilizados durante la fabricación del electrodo.
2. Para evaluar la calidad de los registros in vivo , importe los datos recopilados durante la caminata en cinta a un paquete estadístico seleccionado.
   1. Para evaluar la validez del electrodo fabricado a medida durante las pruebas in vivo (en las que se perturbó la marcha de la rata al caminar cuesta arriba y cuesta abajo para inducir alteraciones fisiológicas en la actividad muscular), se realizó la prueba t de Welch para comparar los valores máximos medios para las condiciones de marcha cuesta arriba y cuesta abajo.
      NOTA: Se recomienda a los lectores que realicen pruebas y análisis adicionales (por ejemplo, evaluaciones de la relación señal-ruido (SNR); consulte Delysys Fundamental Concepts in EMG Signal Acquisition) que no se presentan aquí por brevedad¹⁶.
   2. Para evaluar la fiabilidad de la señalización del electrodo a lo largo del tiempo, evalúe los datos longitudinales recopilados en condiciones consistentes (caminata a nivel a 16 m/min a intervalos de 14 y 56 días después de la implantación) mediante pruebas t pareadas.

Resultados

Rendimiento ex vivo
Los ICC revelaron altos niveles de concordancia entre los electrodos fabricados a medida y los estándar de la industria en todas las formas de onda (seno [ICC = 0,993], cuadrado [ICC = 0,995], triángulo [ICC = 0,958]; p < 0,001). Los diagramas de Bland-Altman también revelaron un alto grado de concordancia de señal entre los electrodos. Los diagramas de Altman insípidos y las correlaciones de Pearson se resumen en la Figura 3 con fuertes correlaciones positivas entre los electrodos fabricados a medida y los estándar de la industria. Las correlaciones de Pearson revelaron altos niveles de sincronía temporal entre el electrodo fabricado a medida y el estándar de la industria en todas las formas de onda (seno [r = 0,987], cuadrado [r = 0,990], triángulo [r = 0,931]).

Figura 3: Resultados de las pruebas ex vivo . Datos brutos de electrodos personalizados y estándar de la industria para una onda sinusoidal repetida (A), (D) onda cuadrada y (G) onda triangular a 0,1 V y 5 Hz. (B,E,H) Correlación entre las mediciones de voltaje para los electrodos personalizados y MicroProbe para 8,000 muestras de las formas de onda respectivas. (C, F, I) Gráfico de Altman insípido que evalúa la diferencia porcentual entre el electrodo personalizado y el electrodo MicroProbe en los valores promedio de las formas de onda respectivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 4 se muestra un espectro de impedancia representativo para un electrodo epimisial fabricado a medida. Aunque las mediciones de impedancia se recogieron de 10 Hz a 31 kHz, los resultados se informan a 1 kHz, que es una frecuencia relevante para la adquisición de EMG. El estándar de la industria (electrodo de referencia) tenía una impedancia de 2 kΩ. A modo de comparación, la impedancia media de 10 electrodos epimisiales fabricados a medida fue de 3,61 ± 7,95 kΩ y de 1,63 ± 1,59 kΩ a 1 kHz para las superficies de contacto 1 y 2, respectivamente.

Figura 4: Impedancia. Gráfico de magnitud de Bode que representa el valor de impedancia en ohmios (Ω) a ~ 1 kHz para un electrodo epimisial representativo fabricado a medida. Los canales 1 y 2 pertenecen a las superficies de contacto 1 y 2 respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Rendimiento in vivo (Video Suplementario S1)
El electrodo fabricado a medida capturó eficazmente las fluctuaciones fisiológicas en la actividad de VL EMG inducidas durante diversas condiciones de caminata en cinta rodante. Cabe destacar que la actividad media de la EMG máxima fue significativamente menor durante la marcha cuesta abajo (0,008 ± 0,005 mV) que durante la cuesta arriba (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), de acuerdo con los hallazgos previos¹⁰. Además, una prueba t pareada reveló que los valores de amplitud máxima de EMG a los 14 días (0,01 ± 0,007 mV) no mostraron una diferencia significativa con respecto a los de 56 días (0,012 ± 0,007 mV, p > 0,05), lo que respalda la fiabilidad a largo plazo del dispositivo (Figura 5). Los valores de magnitud de EMG significativamente diferentes en las mismas condiciones de registro pueden ser indicativos de daño o falla del electrodo.

Figura 5: Fiabilidad de los electrodos in vivo . Diagrama de Tukey de la amplitud máxima de EMG (mV) del vasto lateral durante la marcha nivelada en cinta rodante (16 m/min) a los 14 días (T14) y a los 56 días (T56) después de la instrumentación. Abreviaturas: EMG = electromiografía; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Biocompatibilidad
La H&E no reveló evidencia de inflamación en el músculo control (Figura 6, panel izquierdo) en relación con el músculo instrumentado (Figura 6, panel derecho). Esto no incluyó evidencia clara de infiltración de células inmunitarias, acumulación mionuclear interna, fibrogénesis y/o fragmentación del sarcolema entre secciones transversales extraídas del músculo control o instrumentado.

Figura 6: Biocompatibilidad. Comparación histológica de los músculos vasto lateral control (izquierda) e instrumentados (derecha) teñidos con hematoxilina y eosina (40x). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Catch_tray.gcode. Plantilla de impresión 3D de la bandeja de captura, diseñada como parte de la plantilla plegable para atrapar las láminas plegadas de la plantilla plegable. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Cutting_jig.gcode. Plantilla de impresión 3D de la plantilla de corte, que contiene ranuras espaciadas uniformemente como guía para perforar consistentemente la base de silicona. La plantilla de corte está configurada para la colocación de veinte láminas para formar diez electrodos epimisiales bipolares. Sin embargo, actualmente utilizamos la plantilla de corte para producir un lote de seis electrodos bipolares, ya que sugerimos dejar un espacio entre los electrodos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Folding_jig.gcode. Plantilla de impresión 3D de la plantilla plegable, que permite un plegado más fácil de las láminas de platino-iridio para formar la forma de U deseada. El plegado de las láminas también se puede realizar manualmente si es necesario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S1: Pruebas in vivo . Señalización EMG de la VL durante la marcha en declive (-16°) en una cinta de correr motorizada a 16 m/min utilizando el electrodo EMG epimisial fabricado a medida. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Nuestro objetivo era agilizar el proceso de fabricación de EMG, permitiendo una adopción e implementación más amplias de los diseños de electrodos epimisiales, promoviendo así la accesibilidad y avanzando en la investigación neuromuscular. Con este fin, presentamos una guía fácil de usar para obtener, fabricar y probar electrodos epimisiales de bajo costo internamente. Con la esperanza de apoyar a otros grupos de investigación, también proporcionamos plantillas de impresión 3D complementarias para facilitar la producción de electrodos epimisiales internos para sus esfuerzos de investigación.

Los investigadores que estén considerando la adopción de estas técnicas de fabricación deben tener en cuenta lo siguiente: 1) los parámetros del electrodo especificados en este flujo de trabajo (forma, dimensiones, área de superficie de contacto, distancia entre electrodos, longitud del cable, etc.) se seleccionaron para adaptarse a nuestro modelo experimental y deberán modificarse para diferentes casos de uso, 2) la soldadura de los cables conductores a las láminas de contacto es un paso crucial que requiere práctica para una ejecución exitosa; Ajustar el ancho de pulso y la energía de soldadura durante la soldadura puede mejorar el éxito, 3) es esencial aplicar tensión a los cables conductores y evaluar el rendimiento de la interfaz después de la soldadura para probar la conexión de la superficie de cable a contacto, 4) el paso final de fabricación implica recubrir y sellar el electrodo con silicona, un proceso simple pero crucial para un rendimiento óptimo del electrodo. El recubrimiento de silicona debe ser delgado y relativamente liso para evitar la irritación del tejido dérmico durante la implantación, pero un recubrimiento excesivamente delgado puede afectar el rendimiento del electrodo. Se aconseja a los investigadores que modifiquen la proporción de silicona-tolueno de acuerdo con sus especificaciones para lograr una capa robusta pero delgada y suave de sellador de silicona.

Al evaluar el rendimiento de los electrodos, los demás deben tener en cuenta lo siguiente: 1) hemos proporcionado un ejemplo de una evaluación in vivo , pero alentamos al lector a utilizar un procedimiento de prueba in vivo que imite el caso de uso previsto de su electrodo epimisial fabricado a medida, 2) nuestro protocolo de prueba in vivo tampoco permitió espacialmente la implantación simultánea de los electrodos fabricados a medida y estándar de la industria. Como tal, la concordancia de la señal entre los electrodos no se pudo medir in vivo y, por lo tanto, no se evaluó, 3) además, nuestra configuración de prueba in vivo no permitió evaluar la impedancia del electrodo después de la implantación, 4) es importante considerar que nuestros datos se probaron ex vivo a niveles relativamente bajos de voltaje (<1 V) debido a nuestras necesidades experimentales. Por lo tanto, los investigadores que consideren la incorporación de estos electrodos pueden desear probar su utilidad a voltajes más altos. Estas son consideraciones que otros pueden tener en cuenta al probar sus propios electrodos epimisiales.

Trabajos anteriores han destacado el potencial de los electrodos de registro multicanal y de alta densidad para decodificar con mayor precisión la actividad de las neuronas motoras 17,18,19,20. Alentamos a aquellos interesados en desarrollar y usar electrodos epimisiales multicanal a utilizar y ampliar los recursos instructivos que ofrecemos aquí. Además de servir como electrodos de registro, los electrodos epimisiales se utilizan comúnmente como electrodos estimulantes en experimentos de neuroestimulación 21,22,23 y control de prótesis^24,25. Para aquellos interesados en utilizar electrodos epimisiales para estos fines, les animamos a que se basen en nuestro trabajo y prueben la capacidad estimulante de sus propios electrodos epimisiales fabricados a medida.

En general, la cuantificación de la actividad eléctrica del músculo es fundamental para comprender los mecanismos subyacentes de numerosas patologías y la eficacia de los posibles tratamientos. Este flujo de trabajo actualizado representa una guía sencilla para producir electrodos epimisiales internos y rentables que se pueden utilizar para cuantificar de forma fiable esta importante métrica de la salud musculoesquelética. Esperamos que esta metodología pueda servir como modelo para que otros grupos fabriquen y prueben sus propios electrodos epimisiales hechos a medida.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
electrodos fuertes
			Cantidad y precio por electrodo
Superficie de contacto	Prince and Izant PT90/IR10 1,25 mm x 5 mm	Catálogo #1040055	2 por electrodo $7.50 por FOIL $15.00 por electrodo
Alambre conductor de electrodo de acero inoxidable recubierto de PFA	Alambre de acero inoxidable recubierto de PFA multifilamento de A-M Systems 50.8 y micro; m diámetro de la hebra	Catálogo #793500	Dependiendo de la longitud de cable deseada (por ejemplo, cables conductores de 9 pulgadas x2) $128 por carrete de 25 pies $5.12 por pie $0.42 por pulgada (x18) $7.68 por electrodo
Plantilla plegable;	Impreso en 3D (ver archivo .gcode)	NA	NA
Sellador NA para cuerpo de electrodo	Nusil Med-1137 Silicona líquida	Catálogo #MED-1137	1 gramo $344.66 por 2 onzas (59.15 mL) $5.83 por electrodo
Base de silicona	Implantech Alliedsil Lámina de silicona reforzada, implantable a largo plazo (8" x 6") de .007 de espesor	Catálogo #701-07	Hoja de 10 mm x 5 mm $225.00 por 8 x 6 pulgadas $0.36 por electrodo (10 mm x 5 mm)
Diluyente para mezcla de sellador	Tolueno 99.5% ACS Reactivo 500mL o Xileno ACS 99.5%	Catálogo #179418-500 ML	0.75 mL $25.53 por 500 mL $0.38 por electrodo
Plantilla para perforar base de silicona Plantilla de	corte – Impreso en 3D (ver archivo CAD)	NA	NA
Electrodo fabricado a medida: $29.25
Electrodo estándar de la industria (EP105 EMG Patch Electrode, 2 contactos, de un solo lado, 7 mm x 4 mm, MicroProbe para ciencias de la vida): $305.00
Materiales de fabricación adicionales
			Cantidad y precio por electrodo
Software de impresión 3D	Solidworks (Solidworks, 2022)
Soldador Micro-Tig	Soldador Micro-Tig (CD1000SPM, soldadura puntual de resistencia a la investigación y producción de luz de pulso único, Sunstone)	SKU  301010	$3,500
Baño ultrasónico	Baño ultrasónico (Baño ultrasónico de la serie CPX, Fisherbrand).	15-337-403	NA
Materiales de prueba fuertes >ex vivo
			Cantidad y precio por electrodo
Plataforma de adquisición de datos y software	DigitalLynx 4sX Base Cheetah versión 6.0 (Neuralynx Inc.)	Hardware	y software de adquisición NA EMG
Placa de interfaz de electrodo (EIB)	EIB, EIB16-QC, Neuralynx Inc.	31-0603-0007	NA
Generador de señales	5 MHz Generador de funciones, B& K Precisión	4005DDS220V	$387.46
Potenciostato	PGSTAT1 potenciostato (EcoChemie, Utrecht, Países Bajos)	NA
NA Tornillo de acero inoxidable	Fine Science Tools	19010-00	$98
Ex Vivo Testing Materials
			Cantidad y precio por electrodo
Cinta de correr para roedores	Cinta de correr abierta Exer 3/6, Columbus Instruments	NA
NA Cemento dental	Excel Formula® Material dental vertible, St. George Technology Inc.	#24211	$125.60
Microscopio óptico	Keyence BZ-X800, Keyence Corporation, Osaka, Japón	NA	NA
Sistema de captura de movimiento	Optitrack Cámara a color, Optitrack, NaturalPoint Inc.	NA	NA
Algoritmo de detección	picos" SciPy.signal.find_peaks - SciPy v1.8.1 Manual", 2022	NA	NA
Python software	Python Software Foundation. Referencia del lenguaje Python, versión 3.9. Disponible en http://www.python.org	NA	NA
Rat	HsdBlu: LE, Envigo	140	NA
Statistical sotware	GraphPad Prism versión 10.0.0 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts EE. UU.)	NA	NA