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Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente

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DOI:

10.3791/66769

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6 de septiembre de 2024

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Resumen

La microglía, como macrófagos residentes del cerebro, son esenciales para mantener la homeostasis cerebral. Dan forma a los circuitos neuronales durante el desarrollo, examinan su entorno en busca de desechos o células muertas, y responden a infecciones y lesiones en el cerebro, entre muchas otras funciones. Sin embargo, su importante papel en el neurodesarrollo y la plasticidad sináptica y fisiopatología no se ha definido completamente, lo que pone de manifiesto la necesidad de seguir investigando. Para obtener una comprensión más completa del papel de la microglía en estos procesos, necesitamos aislar la microglía y caracterizarla genética, metabólica y funcionalmente. Sin embargo, el aislamiento de la microglía de ratones adultos, especialmente de estructuras cerebrales pequeñas, es un desafío, ya que representan un pequeño porcentaje del total de células cerebrales y el rendimiento de la microglía aislada suele ser demasiado bajo. En este caso, el aislamiento magnético de la microglía mediante microesferas CD11b+ nos permite separar las células microgliales del hipotálamo de un cerebro de ratón adulto recién perfundido. El método actual nos permite lograr una pureza y un rendimiento relativamente altos en un corto período de tiempo, manteniendo la viabilidad de la célula.

Introducción

La microglía corresponde al 5-20% del total de células neurales y son las únicas células gliales que se originan a partir de progenitores eritromieloides en el saco vitelino y comienzan a colonizar el cerebro en desarrollo alrededor del día embrionario E9.5 1,2. Son células longevas con la capacidad de auto-renovarse lentamente, independientemente de las células derivadas de la médula ósea3. Como algunas de las células más dinámicas, son capaces de adquirir diversos fenotipos en respuesta a señales contextuales y ambientales 2,4. Entre las señales capaces de modular su actividad, el daño del sistema nervioso central (SNC), la actividad neuronal, así como los nutrientes, son los más potentes. Cada vez son más las investigaciones que demuestran el papel fundamental de la microglía en las lesiones, las enfermedades neurodegenerativas y la obesidad 2,5,6. Sin embargo, el papel preciso de la microglía tanto en los procesos fisiológicos como en la fisiopatología requiere más estudio. Por lo tanto, su caracterización transcripcional, metabólica y funcional en diferentes condiciones es de gran importancia y requiere su aislamiento, ya que los estudios in situ son apropiados para la localización de ADN, ARN y proteínas y comparaciones cualitativas, así como para la caracterización morfológica de la microglía.

Existen diversas técnicas descritas para el aislamiento de microglía, entre las que se encuentran el método de gradiente de Percoll7, la clasificación celular por citometría de flujo (FACS)8 y la clasificación por células activadas magnéticamente (MACS). La selección del método apropiado depende de los objetivos del estudio y del nivel de pureza requerido para las aplicaciones posteriores. El aislamiento de la microglía pura del cerebro del ratón adulto, especialmente de pequeñas estructuras cerebrales como el hipotálamo, es un desafío debido al número limitado de células microgliales. La disociación suave y automatizada del hipotálamo mediante la tecnología Miltenyi permite la purificación de un rendimiento de microglía relativamente alto en poco tiempo con la capacidad de procesar hasta ocho muestras al mismo tiempo con un suave disociador Octo de MACS.

A la homogeneización de los tejidos le sigue la purificación de la microglía mediante la tecnología basada en columna MACS y las perlas supermagnéticas de tamaño nanométrico CD11b+. Por lo tanto, todas las muestras se procesan exactamente de la misma manera, produciendo células CD11b+ intactas. Cabe destacar que CD11b no está presente exclusivamente en la microglía, sino que también se expresa en otras células de linaje mieloide, incluidos los macrófagos y los monocitos9. Para limitar esto, la perfusión cerebral con solución salina helada antes de la extracción del hipotálamo (ver paso 2.6 del protocolo) asegura la eliminación de la mayoría de las células mieloides, dejando solo una fracción potencialmente pequeña de macrófagos residentes o adheridos a los vasos sanguíneos. Los macrófagos y monocitos residentes de un SNC en estado estacionario saludable constituyen un porcentaje menor del total de células inmunitarias cerebrales (~10% y <2% respectivamente)10,11. Por lo tanto, cuando las células cerebrales se clasifican con perlas CD11b+, tanto la microglía como los macrófagos se pueden aislar, aunque la gran mayoría son microglía.

El rendimiento final de la microglía y el mantenimiento de su viabilidad nos permiten realizar ensayos ex vivo, así como in vitro, con la ventaja de analizar regiones cerebrales específicas de interés. La evidencia más reciente ha demostrado que la población de microglía es altamente heterogénea, representando la expresión génica específica de la región y las características morfológicas y funcionales 2,12,13. Por lo tanto, el protocolo actual tiene como objetivo aislar y analizar la microglía adulta de una manera específica para cada región. De hecho, podemos caracterizar los perfiles genéticos, transcripcionales y traslacionales de la microglía hipotalámica adulta utilizando métodos como la RT-qPCR y la secuenciación de ARN, así como realizar análisis funcionales in vitro.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos se llevaron a cabo en estricto cumplimiento de las recomendaciones de la Unión Europea (2013/63/UE) y fueron aprobados por el comité ético local de la Universidad de Burdeos (CEEA50) y el Ministerio de Educación Superior, Investigación e Innovación de Francia (resumen no técnico del proyecto aprobado NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

El siguiente protocolo se realiza en ratones C57BL/6 adultos con una edad media de 2-4 meses. Sin embargo, podría realizarse en todas las edades y condiciones de los ratones, teniendo en cuenta que el paisaje de las células inmunitarias del SNC puede estar alterado y el porcentaje de macrófagos y monocitos residentes puede aumentar (por ejemplo, en el envejecimiento y la neurodegeneración).

1. Preparación de soluciones

NOTA: Los siguientes volúmenes y soluciones se refieren estrictamente al aislamiento de células Cd11b+.

  1. Determine el volumen total de D-PBS/0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) requerido en función del número de muestras. Prepare la solución utilizando el D-PBS disponible en el mercado con calcio y magnesio y polvo de BSA (consulte la tabla de materiales).
  2. Prepare los tubos de disociación etiquetados (tubos C) y llénelos con 1.900 μL de tampón Z, proporcionado en el kit de disociación de tejido cerebral adulto (consulte la Tabla de materiales). Descongele las enzimas y manténgalas en hielo, junto con todos los tampones necesarios en los siguientes pasos.
  3. Prepare y coloque el volumen adecuado de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales) necesaria para la perfusión (paso 2.6) en hielo. Calcular 10 mL para cada animal más un 10% de exceso.
  4. Para el análisis de RT-qPCR, prepare un tampón de qPCR por muestra: 2,5 μL de tioglicerol + 250 μL de tampón de lisis, utilizando un kit disponible en el mercado para purificar el ARN (consulte la Tabla de materiales).
  5. Para la cuantificación de proteínas, prepare el tampón de lisis diluyendo el cóctel de inhibidores de la fosfatasa y el cóctel de inhibidores de la proteasa 1:100 en un tampón de extracción de mamíferos (consulte la Tabla de materiales).
  6. Para la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el ensayo de fagocitosis, prepare 1x HBSS a partir de los 10x HBSS disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales). A continuación, prepare el búfer FACS añadiendo un 0,2% de BSA a 1x HBSS.

2. Extirpación del cerebro

  1. Sedar al animal con una dosis de 20 mg/kg de xilacina; A continuación, sacrificar al ratón con una sobredosis de 400 mg/kg de pentobarbital y colocarlo en decúbito supino en una bandeja de disección.
    NOTA: Otras combinaciones de anestésicos para eutanasiar al animal también pueden funcionar.
  2. Llene una jeringa de 10 ml con 10 ml de PBS 1x helado y conéctela a una aguja de mariposa de 21 g.
  3. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (verificar pellizcando las patas para asegurar la falta de respuesta), la respiración se detuvo, y el corazón está en fibrilación, cubrir la piel con pinzas y abrir la cavidad torácica con unas tijeras, a la altura de las últimas costillas y el esternón.
  4. Usa las tijeras para hacer un corte profundo a lo largo de los lados de la caja torácica hacia la parte superior de la caja torácica para exponer el corazón.
  5. Inserte la aguja de 21 G en la parte distal del ventrículo izquierdo (asegúrese de que aproximadamente 1/3 de la aguja esté dentro del ventrículo). Inmediatamente haga una incisión a través de la aurícula derecha con las tijeras.
  6. Infunda 10 ml de PBS 1x helado para limpiar el cerebro de cualquier célula inmunitaria circulante.
    NOTA: Revise visualmente el cerebro para asegurarse de que esté limpio y bien perfundido.
  7. Corta la cabeza del ratón, extrae con cuidado el cerebro y colócalo en una placa de Petri llena de hielo y cubierta con papel de aluminio.
    NOTA: La placa de Petri y el papel de aluminio ayudan a ver las piezas del cerebro. Es beneficioso mantener un ambiente fresco durante el corte de las piezas del cerebro para limitar las actividades metabólicas.
  8. Aísla el hipotálamo con pinzas y córtalo en trozos pequeños con cuchillas de afeitar.
    1. Para identificar y diseccionar el hipotálamo, coloque el cerebro boca abajo de modo que la corteza sea ventral y el hipotálamo sea visible dorsalmente en la superficie superior. Separe el hipotálamo, que se encuentra en la parte inferior del cerebro a ambos lados del tercer ventrículo, usando pinzas curvas. El peso medio del hipotálamo de ratones C57BL/6 adultos es de 15 mg.
      NOTA: Las piezas del cerebro deben ser lo más pequeñas posible (<0,5 mm). El corte en trozos pequeños es un paso crítico ya que permite una mejor disociación y un mayor rendimiento de células.
  9. Recoger los trozos del hipotálamo en tubos de disociación (C-Tubes) previamente rellenados con 1.900 μL de tampón Z (paso 1.2).
    NOTA: Para tener un buen rendimiento de células microgliales que sea suficiente para realizar ensayos, agrupe un mínimo de dos (para la cuantificación de proteínas) o tres (para qPCR y RNAseq) hipotálamis por tubo.

3. Disociación tisular

NOTA: Todos los pasos deben realizarse con hielo. No haga vórtice de la suspensión celular en ningún paso; mezclar cuidadosamente con una pipeta de 1.000 μL.

  1. Prepare la mezcla de enzimas 2 de acuerdo con la Tabla 1 (calculando el volumen total de todos los tubos + 10% en exceso). En cada tubo C, agregue 50 μL de la enzima contenida en la mezcla 1 (ver Tabla 1) y 30 μL de la mezcla de enzimas 2. Todas las enzimas se proporcionan en el kit de disociación del tejido cerebral adulto (ver la Tabla de Materiales).
  2. Cierre los tubos C y colóquelos boca abajo en el disociador con los soportes calefactores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecute el programa 37C_ABDK_02.
  3. Prepare tubos de presión de 15 ml (consulte la tabla de materiales) con filtros de 70 μm encima de ellos. Humedece el colador con 2 mL de D-PBS.
  4. Cuando finalice el programa de disociación/digestión, vacíe el tubo C en el filtro y rasque con una punta de 200 μL para reducir la pérdida celular al aumentar la filtración celular y reducir la adherencia del homogeneizado de tejido en el filtro.
  5. Lave el tubo con 2 x 5 mL de D-PBS, vacíe los lavados en el colador y rasque con una punta de 200 μL entre los lavados.
  6. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender cuidadosamente el pellet de celda con el volumen adecuado de D-PBS frío de acuerdo con la Tabla 1.
  7. Mezclar inmediatamente cuidadosamente con 450 μL de reactivo de gradiente de densidad (Solución de eliminación de residuos, ver la Tabla de Materiales) y cubrir muy suavemente con 2 mL de D-PBS frío (ver Tabla 1).
    NOTA: Para obtener las diferentes capas de gradiente de densidad, el D-PBS debe superponerse suavemente gota a gota, con la menor "perturbación" posible, 1 mL a la vez con una pipeta de 1 mL.
  8. Centrifugar a 3.000 × g durante 10 min a 4 °C con aceleración lenta y freno lento (si 9 es equivalente a lleno, use 5).
  9. Se forman tres fases. Aspire las dos fases superiores por completo y deséchelas. Asegúrese de no aspirar la tercera fase inferior.
  10. Llene con 1800 μL de D-PBS frío e invierta suavemente el tubo 3 veces.
  11. Centrifugar a 1.000 × g durante 10 min a 4 °C con aceleración máxima y freno a fondo y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet celular pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo con 2 mL de D-PBS/BSA.

4. Aislamiento magnético de células CD11b+

  1. Centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C y aspirar completamente el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet celular en 90 μL de tampón D-PBS/BSA.
  2. Añadir 10 μL de la mezcla de microperlas CD11b y mezclar bien con la pipeta.
  3. Incubar durante 15 min a 2-8 °C en la nevera, no con hielo; lavar las células añadiendo 1 mL de D-PBS/BSA y centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C; Aspire el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender cuidadosamente en 500 μL de D-PBS/BSA.
  4. Inicie el programa POSSEL2 en el separador siguiendo las instrucciones en pantalla. Coloque las pequeñas columnas (ver la Tabla de Materiales) en el campo magnético.
    NOTA: Se pueden elegir columnas pequeñas o grandes para la clasificación de celdas magnéticas, de acuerdo con el número promedio de celdas esperadas. Las columnas pequeñas tienen una capacidad de hasta 1 × 107 celdas etiquetadas y las columnas grandes de hasta 1 × 108. Al aislar células de estructuras pequeñas, como el hipotálamo, se aconsejan pequeñas columnas. Los volúmenes de los reactivos son diferentes cuando se utilizan columnas grandes (consulte las instrucciones del fabricante).
  5. Humedecer las columnas (ver la Tabla de Materiales) con 500 μL de D-PBS/BSA. Si se necesita la fracción negativa de las células (CD11b-) para un análisis posterior, coloque una placa de recolección debajo de las columnas y luego aplique suspensión celular en las columnas.
  6. Realice tres pasos de lavado añadiendo 500 μL de D-PBS/BSA a la vez en la columna, esperando cada vez a que el tampón pase a través de la columna.
    NOTA: es importante evitar que la parte superior de la columna se seque, por lo que se aconseja no esperar a que haya pasado todo el tampón.
  7. Transfiera el efluente total de la fracción CD11b- de los pocillos de la placa colectora a tubos de 15 mililitros.
  8. Retire la columna del separador, colóquela en un tubo de 5 ml y pipetee 1 ml de D-PBS/BSA en la columna.
  9. Enjuague inmediatamente la fracción de celda marcada magnéticamente aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna.
  10. Eventualmente, cuente las células CD11b+ con un hemacitómetro o cualquier otro método; Espere ~ 15,000 células por hipotálamo.
  11. Centrifugar la suspensión celular a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.

5. Análisis

  1. Para el análisis de RT-qPCR, vuelva a suspender los gránulos celulares con tampón qPCR (para la preparación, consulte el paso 1.3) y almacene los tubos a -80 °C hasta la extracción del ARNm. Aísle el ARN total, luego procéselo y analícelo siguiendo las pautas del MIQE14. Por último, sintetizar el ADNc y realizar una qPCR utilizando un dispositivo RT-PCR. Consulte la Tabla de Materiales para ver todos los kits disponibles comercialmente utilizados.
  2. Para la cuantificación de proteínas, lave los gránulos celulares con D-PBS (sin BSA) al menos 2 veces para eliminar BSA. A continuación, vuelva a suspender los gránulos celulares de dos hipotálamis con 20 μL de tampón de lisis. Proceda con la cuantificación de proteínas con un kit de ensayo de proteínas (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Seguimos las instrucciones del fabricante15 para cuantificar las proteínas y realizar el ensayo de actividad de serina/treonina quinasas.
  3. Para la detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células microgliales, vuelva a suspender el pellet en 1x HBSS. Tratar las células siguiendo el protocolo del fabricante del kit para el ensayo de citometría de flujo (ver la Tabla de Materiales). A continuación, vuelva a suspender las células tratadas en 200 μL de tampón FACS (para la preparación, consulte el paso 1.5) y realice FACS para detectar las células estresadas oxidativamente.
  4. Para el ensayo de fagocitosis, incube las células clasificadas en D-PBS/BSA con perlas de látex fluorescentes (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos. Adapte el número de cuentas para que tenga 4 cuentas por celda en promedio. A continuación, centrifugar a 300 × g durante 7 min a 4 °C, volver a suspender en 200 μL de tampón FACS y leer la emisión de fluorescencia por FACS (λex 575 nm; λem 610 nm).

Resultados

La evaluación del rendimiento final se basa en el nivel de pureza y la cantidad de células aisladas y podría determinarse mediante RT-qPCR, recuento de células y cuantificación de proteínas. La pureza de las células magnéticas aisladas del hipotálamo se confirmó mediante el análisis de expresión génica de CD11b, C1qa, Gad1 y GFAP con RT-qPCR (Figura 1). CD11b y C1qa se expresan predominantemente por la microglía en un estado estacionario, CNS16 y Gad1 y GFAP sirven como marcador neuronal y astrocítico respectivamente. El ADNc total de un hipotálamo osciló entre 55 y 98 ng. Cabe destacar que solo la fracción positiva exhibió expresión de CD11b y C1qa, lo que indica la ausencia de cualquier pérdida potencial de células microgliales en la fracción negativa. Los cebadores se proporcionan en la Tabla 2.

Además, los niveles menores de los marcadores neuronales y astrocíticos aseguran que la gran mayoría de las células aisladas sean microglía, ya que los macrófagos y monocitos residentes constituyen solo el 10 % del paisaje total de células inmunitarias de un cerebro sano10,11. Estos resultados demuestran la eficacia de la selección magnética y allanan el camino para la aplicación de la RT-qPCR para evaluar los niveles de expresión de todos los genes de interés en células microgliales hipotalámicas recién clasificadas. Del mismo modo, se puede realizar un análisis de RNAseq en microglías clasificadas por hipotálamo para tener una visión completa de su transcriptoma.

La cantidad de células aisladas se determinó mediante recuento celular y resultó ser de ~15.000 células por hipotálamo (mencionado en el paso 4.10 del protocolo). Además, se cuantificó la concentración de proteínas en la microglía clasificada, revelando una concentración media de 0,5 μg/μL en células CD11b+ aisladas de dos hipotálamos agrupados (Figura 2). Este conocimiento permite realizar diferentes ensayos en función de un umbral mínimo de proteínas. Además, al agrupar más hipotálamo, se puede lograr una concentración más alta, ampliando el alcance de los análisis potenciales. Las proteínas extraídas de la microglía hipotalámica facilitan diversas técnicas, incluidos los inmunoensayos AlphaLISA y los ensayos de actividad de quinasas.

Además, el protocolo descrito permite a los investigadores realizar varios análisis ex vivo , lo que permite explorar la actividad microglial y su papel en el hipotálamo tanto en contextos fisiológicos como patológicos. La cuantificación de la producción de ROS representa un aspecto crucial de la respuesta inmune microglial17. Por lo tanto, después de la separación, la microglía se puede tratar con reactivos disponibles comercialmente que permiten la detección de ROS en células vivas al exhibir una señal fluorescente aumentada tras la oxidación. La microglía aislada magnéticamente de tres hipotálalos agrupados es suficiente para detectar ROS por FACS, como se muestra en la Figura 3A, aunque nuestros resultados muestran una variabilidad bastante alta de la producción celular de ROS entre las condiciones que analizamos. Cabe destacar que, con el kit comercial mencionado anteriormente (ver la Tabla de Materiales), también pudimos evaluar la viabilidad de las células Cd11b+ clasificadas, gracias a una tinción de células muertas impermeabilizadas que presenta un aumento de la fluorescencia al unirse al ADN. En concreto, nuestros datos muestran que el 99% de las células están vivas (Figura 3B). Se utilizaron estrategias de compuerta para distinguir entre células vivas y muertas, así como células estresadas oxidativamente y no estresadas, en función de sus propiedades de fluorescencia.

Otra característica principal de la actividad microglial es la fagocitosis, un proceso dinámico y estrechamente regulado que desempeña un papel clave en la vigilancia inmunitaria, la reparación de tejidos y la homeostasis general del sistema nervioso central18. Sorprendentemente, las células Cd11b+ clasificadas con perlas acopladas magnéticamente pueden cultivarse durante 24 h y luego incubarse con microperlas de látex fluorescente en diferentes puntos temporales para evaluar, ya sea por FACS o por microscopía de fluorescencia, alteraciones en la actividad fagocítica en diferentes condiciones. La microglía recién clasificada también puede exponerse a perlas fluorescentes o a cualquier tipo de partículas acopladas a pHrodo (por ejemplo, sinaptosomas) directamente dentro del tubo, y la fagocitosis puede evaluarse mediante el análisis FACS.

En concreto, incubamos directamente en el tubo que contenía la suspensión celular clasificada, microglía aislada de dos hipotálamos agrupados o un cerebro entero con perlas de látex fluorescente. La microglía que fagocitó al menos una perla fluorescente se puede distinguir de las células no fagocíticas mediante citometría de flujo, ya que la microglía fagocítica exhibirá una fluorescencia mejorada. Los controles negativos, no incubados con perlas, se utilizaron para la compuerta. En nuestras dos condiciones experimentales (ratones alimentados con comida vs dieta alta en grasas (HFD)) observamos un porcentaje muy bajo de microglía fagocítica (Figura 4A). Sin embargo, este resultado se muestra aquí para demostrar la eficacia de este método, que, sorprendentemente, también permite diferenciar entre células que fagocitaron 1 perla, 2 perlas, 3 perlas, etc. (Figura 4B). Por último, todos los enfoques ómicos podrían aplicarse a la microglía hipotalámica aislada. Sugerimos agrupar tres hipotálalos para tener suficientes células para realizar estos ensayos.

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Figura 1: Evaluación de la pureza de las células CD11b+ mediante RT-qPCR. Cuantificación en células clasificadas de la expresión de ARNm de la integrina CD11b, subcomponente C1q del complemento, subcomponente C1q subunidad A, C1q, ácido glutámico descarboxilasa Gad1 y proteína ácida fibrilar glial GFAP normalizada en los niveles de ARNm de los genes Eef1a1 y Sdha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Cuantificación de proteínas de células hipotalámicas después de la clasificación celular. Cuantificación de la concentración de proteínas en células CD11b+ y CD11b- . Tanto las células CD11b+ como las CD11b- se lisaron en 20 μL de tampón de lisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Detección de ROS en células vivas microgliales. Cuantificación de (A) células sometidas a estrés oxidativo y (B) células vivas en una población de células Cd11b+ clasificadas, con gráficos de contorno FACS relativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Cuantificación de la actividad fagocítica microglial. (A) Cuantificación de células fagocíticas en células Cd11b+ clasificadas a partir de dos hipotálamos o un cerebro, con diagrama de contorno FACS relativo. (B) Porcentaje de células fagocíticas según el número de perlas fagocitadas con diagrama de contorno FACS relativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mezcla de enzimas 2
Enzima ABúfer YEnzima P
10 μL20 μL50 μL
D-PBSSolución de remoción de escombrosSuperposición D-PBS
Estructura de 15-100 mg1000 μL450 μL2 mL

Tabla 1: Preparación de la mezcla de disociación (los volúmenes se refieren a una sola muestra) y de las capas de gradiente.

GenesProteínaAdelanteMarcha atrás
ItgamIntegrina alfa M (CD11b)CTCATCACTGCTGGCCTATACAAGCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
SdhaComplejo Succinato Deshidrogenasa Flavoproteína Subunidad ACCCTCTCATATGTGGACATCAACAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qaComponente 1 del complemento, subcomponente q, polipéptido alfaCGAGGTGTGGATCGAAAAGGGAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
GAD1glutamato descarboxilasa 1GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAGCTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfapproteína ácida fibrilar glialAGGTCCGCTTCCTGGAACAGGGCTCCTTGGCTCGAA

Tabla 2: Secuencias de cebadores RT-qPCR.

Clasificación celular por citometría de flujo (FACS)Clasificación por células activadas magnéticamente (MACS)
Anticuerpos bioquímicos marcados con fluorescenciaPerlas magnéticas conjugadas con anticuerpos
Diferenciación más allá de los marcadores de superficie celularDiferenciación solo según marcadores de superficie celular
Rendimiento inicial sustancialRendimiento inicial modesto
Más lento que MACS para el manejo simultáneo de muchas muestrasMás rápido que FACS para el manejo simultáneo de muchas muestras
Menos suave que MACSMás suave que FACS

Tabla 3: Representación de las características y limitaciones de FACS y MACS

Discusión

El protocolo actual presenta el aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente. Los resultados presentados anteriormente confirman la pureza y viabilidad de las células aisladas, así como la eficacia de este método para caracterizar funcionalmente la microglía ex vivo, por ejemplo, a través de la actividad fagocítica y la cuantificación de la producción de ROS. Los métodos clásicos para el aislamiento de una población celular específica también podrían utilizarse para las células microgliales. El fraccionamiento en gradiente de densidad es un método bien conocido para la separación de diferentes celdas y sus partículas según su tamaño y/o densidad. Esta técnica podría aplicarse para el aislamiento y cultivo de microglía primaria. Sin embargo, la purificación de la microglía adulta requiere una clasificación adicional de las células cerebrales aisladas mediante una clasificación de células activadas por fluorescencia o inmunomagnéticas.

En concreto, el FACS se basa en anticuerpos bioquímicos marcados con fluorescencia para marcar las células y distinguirlas en función de un gran número de variables que van más allá de los marcadores de superficie, como su tamaño y estado metabólico. Sin embargo, el proceso de purificación celular podría ser más lento y no tan suave, aumentando el número de células muertas, además de requerir un rendimiento inicial sustancial. Por lo tanto, el pequeño número de microglía hipotalámica ya es un factor limitante. MACS utiliza perlas magnéticas conjugadas con ciertos anticuerpos contra epítopos celulares específicos y podría funcionar con un rendimiento inicial modesto, facilitando los estudios específicos de la región sobre la dinámica microglial. Debido al fuerte campo magnético de las microperlas, se requiere un etiquetado mínimo; por lo tanto, es más suave que FACS, lo que garantiza el mantenimiento de la integridad de la celda. Además, MACS es más rápido que FACS cuando es necesario el manejo simultáneo de numerosas muestras. Esto proporciona la ventaja distintiva de mantener una alta viabilidad celular que también podría provenir de un pequeño rendimiento inicial (Tabla 3).

Los principales desafíos en el aislamiento de la microglía del hipotálamo, que pueden abordarse de manera efectiva a través de la tecnología MACS, incluyen lograr un rendimiento final suficiente y garantizar la preservación de la integridad celular. La cantidad de celdas requerida depende de la naturaleza del análisis posterior al aislamiento elegido. Por ejemplo, el estudio del papel funcional de la microglía in vitro requiere un número sustancial de células. Esto subraya la importancia de un grupo inicial de la misma región del cerebro de distintos ratones con condiciones idénticas antes de proceder al proceso de aislamiento. Por el contrario, técnicas como la secuenciación de una sola célula de alta precisión no requieren una gran población de células y, a su vez, no es necesario agrupar varios ratones.

Para maximizar el rendimiento celular, es crucial seguir pasos específicos en el protocolo. La disociación efectiva se inicia cortando el hipotálamo en pedazos pequeños y luego asegurándose de que se mantengan en el tampón en el fondo del tubo durante el proceso. Luego, una combinación de disociación mecánica con degradación enzimática de la matriz extracelular asegura un rendimiento celular significativamente alto. Sin embargo, debemos ser extremadamente cautelosos con la interpretación de los resultados, ya que la disociación enzimática realizada a 37 °C podría inducir cambios transcripcionales y traduccionales19. Para prevenir alteraciones técnicamente mediadas, se podrían utilizar los controles adecuados con inhibidores transcripcionales y traduccionales19. También es posible proceder a la disociación enzimática a una temperatura más baja, como en una cámara frigorífica (la eficacia puede reducirse), aunque la disociación puede depender más del efecto mecánico que de la enzimática. Después de la disociación, la suspensión celular se lava previamente y se transfiere a los filtros, y se realizan dos lavados más a fondo de los tubos para evitar la pérdida de células. Otro paso crítico es la eliminación de residuos y mielina mediante la centrifugación en gradiente de densidad y la formación de diferentes capas. Por lo tanto, para lograr un rendimiento final considerable es necesario un manejo meticuloso tanto del tejido hipotalámico como de la suspensión celular, manteniéndolos siempre en hielo para ralentizar el metabolismo y mantener su fenotipo in vivo .

Además, hay ciertos puntos en los que debemos tener mucho cuidado para lograr la máxima pureza de la microglía y mantener el fenotipo de las células de la microglía. Inicialmente, la perfusión realizada a 4 °C es crucial para la eliminación de todas las células CD11b+ circulantes, lo que garantiza la mayor pureza potencial de la microglía. Sin embargo, en caso de ruptura de la barrera hematoencefálica, un mayor porcentaje de células inmunitarias circulantes pueden colonizar el cerebro interfiriendo con el estudio de la microglía. Para mitigar este problema, un enfoque alternativo consiste en implementar una ronda secundaria de aislamiento magnético utilizando microperlas que se conjugan con el anticuerpo CD45. CD45 es un marcador de superficie celular que exhibe una alta expresión en los macrófagos20 y el flujo posterior de esta ronda comprende solo las células microgliales. Esta estrategia de utilizar dos rondas de aislamiento magnético mejora la especificidad del proceso; Sin embargo, lleva más tiempo, lo que supone un riesgo potencial de interrumpir la integridad celular y/o el fenotipo de la microglía. Por lo tanto, un factor crucial para preservar las características funcionales y la integridad de las células consiste en aislar rápidamente el tejido cerebral y mantenerlo en hielo hasta que se inicie el proceso de disociación. En resumen, este enfoque analítico mejora la comprensión de la función y el comportamiento de la microglía, proporcionando información valiosa sobre sus respuestas dinámicas en el hipotálamo.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

La AN cuenta con el apoyo del Instituto Universitario de Francia (IUF), la Universidad de Burdeos, la Fundación Francesa para la Investigación del Cerebro (FRC), el GLN (Grupo de Nutrición Lipidádica) y la Agencia Nacional de Investigación (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA contó con el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Este proyecto ha recibido financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte Europa de la Unión Europea en el marco del MSCA Doctoral Networks 2021, Nº 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de disociación cerebral para adultosMiltenyi130-107-677El kit contiene tampón Z, tampón Y, enzimas A y P, solución de eliminación de desechos, tampón A (para disolver la enzima A).
Albúmina Bovina FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b (Microglía) MicroBeads, humano y ratón - tamaño pequeñoMiltenyi130-093-636
CellROX Kit de ensayo de citometría de flujo verdeInvitrogenC10492
Tubo de centrífuga, tapa Snap-Pop 15mL CellTreat978449
DPBS, calcio, magnesio, glucosa, piruvatoGibco14287-072
gentleMACS C TubosMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo Disociator con calentadoresMiltenyi130-096-427
Cóctel de inhibidores de fosfatasa Halt (100x)Thermofisher78420
Cóctel de inhibidores de proteasa Halt, sin EDTA (100x)Thermofisher78437
HBSS (10x), calcio, magnesio, rojo sin fenolThermofisher14065056
Perlas de látex, poliestireno modificado con carboxilato, rojo fluorescenteSigma-AldrichL3280
LightCycler  480 SYBR Verde I MaestroRoche 4707516001Este reactivo se utilizó para realizar la PCR.
MACS SmartStrainers (70 y micro; m)Miltenyi130-110-916
Micro BCA Kit de ensayo de proteínasThermofisher23235
M-PER Tampón de extracción de mamíferosThermofisher78503
MS ColumnasMiltenyi130-042-201Denominadas columnas pequeñas en el protocolo.
Separador MultiMACS Cell24 PlusMiltenyi130-098-637
PBSS, pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA SuperMixQuanta biosciences733-1177El kit se utilizó para sintetizar el ADNc.
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011El kit contiene 1-tioglicerol y tampón BL (denominado tampón de lisis en el protocolo) y se utilizó para aislar el ARN total.
Vacutainer safety-lok 21 GBecton Dickinson367282

Referencias

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