PyOKR: Un método semiautomatizado para cuantificar la capacidad de seguimiento de los reflejos optocinéticos

Resumen

Describimos aquí PyOKR, un método de análisis cuantitativo semiautomatizado que mide directamente los movimientos oculares resultantes de las respuestas visuales al movimiento bidimensional de la imagen. Una interfaz de usuario y un algoritmo de análisis basados en Python permiten un mayor rendimiento y mediciones cuantitativas más precisas de los parámetros de seguimiento ocular que los métodos anteriores.

Resumen

El estudio de las respuestas conductuales a los estímulos visuales es un componente clave para comprender la función del sistema visual. Una respuesta notable es el reflejo optocinético (OKR), un comportamiento innato altamente conservado necesario para la estabilización de la imagen en la retina. El OKR proporciona una lectura robusta de la capacidad de seguimiento de imágenes y ha sido ampliamente estudiado para comprender los circuitos y la función del sistema visual en animales de diferentes orígenes genéticos. El OKR consta de dos fases: una fase de seguimiento lento en la que el ojo sigue un estímulo hasta el borde del plano visual y una fase rápida compensatoria que restablece la posición del ojo en la órbita. Los métodos anteriores de seguimiento de la cuantificación de la ganancia, aunque fiables, requieren mucha mano de obra y pueden ser subjetivos o derivados arbitrariamente. Para obtener una cuantificación más rápida y reproducible de la capacidad de seguimiento ocular, hemos desarrollado un novedoso programa de análisis semiautomatizado, PyOKR, que permite cuantificar el movimiento bidimensional de seguimiento ocular en respuesta a cualquier estímulo direccional, además de ser adaptable a cualquier tipo de equipo de video-oculografía. Este método proporciona filtrado automatizado, selección de fases de seguimiento lentas, modelado de vectores oculares verticales y horizontales, cuantificación de las ganancias de movimiento ocular en relación con la velocidad del estímulo y organización de los datos resultantes en una hoja de cálculo utilizable para comparaciones estadísticas y gráficas. Este canal de análisis cuantitativo y optimizado, fácilmente accesible a través de la importación de PyPI, proporciona una medición rápida y directa de las respuestas de OKR, lo que facilita el estudio de las respuestas visuales del comportamiento.

Introducción

La estabilización de imagen se basa en respuestas oculomotoras precisas para compensar el flujo óptico global que se produce durante el movimiento propio. Esta estabilización es impulsada principalmente por dos respuestas motoras: el reflejo optocinético (OKR) y el reflejo vestíbulo-ocular (VOR)^1,2,3. El movimiento global lento a través de la retina induce el OKR, que provoca una rotación ocular reflexiva en la dirección correspondiente para estabilizar la imagen ^1,2. Este movimiento, conocido como fase lenta, es interrumpido por movimientos sacádicos compensatorios, conocidos como fase rápida, en los que el ojo se restablece rápidamente en la dirección opuesta para permitir una nueva fase lenta. Aquí, definimos estos movimientos sacádicos de fase rápida como movimientos de seguimiento ocular (ETM). Mientras que el VOR se basa en el sistema vestibular para provocar movimientos oculares para compensar los movimientos de la cabeza³, el OKR se inicia en la retina mediante la activación de ON y la posterior señalización al Sistema Óptico Accesorio (AOS) en el mesencéfalo ^4,5. Debido a su dependencia directa de los circuitos retinianos, el OKR se ha utilizado con frecuencia para determinar la capacidad de seguimiento visual tanto en investigación como en entornos clínicos ^6,7.

El OKR se ha estudiado ampliamente como una herramienta para evaluar la capacidad visual básica ^2,6,8, el desarrollo de DSGC ^9,10,11,12, las respuestas oculomotoras¹³ y las diferencias fisiológicas entre los antecedentes genéticos⁷. El OKR se evalúa en animales con la cabeza fija a los que se les presenta un estímulo móvil¹⁴. Las respuestas oculomotoras generalmente se capturan utilizando una variedad de herramientas de video, y los movimientos de seguimiento ocular se capturan como formas de onda OKR en las direcciones horizontal y vertical⁹. Para cuantificar la capacidad de seguimiento, se han descrito dos métricas principales: la ganancia de seguimiento (la velocidad del ojo en relación con la velocidad del estímulo) y la frecuencia ETM (el número de movimientos sacádicos de fase rápida durante un período de tiempo determinado). El cálculo de la ganancia se ha utilizado históricamente para medir directamente la velocidad angular del ojo para estimar la capacidad de seguimiento; Sin embargo, estos cálculos requieren mucha mano de obra y pueden derivarse arbitrariamente en función de los métodos de recolección de videooculografía y su posterior cuantificación. Para una evaluación más rápida de los OKR, se ha utilizado el recuento de la frecuencia de ETM como método alternativo para medir la agudeza de seguimiento⁷. Aunque esto proporciona una estimación bastante precisa de la capacidad de seguimiento, este método se basa en una métrica indirecta para cuantificar la respuesta de fase lenta e introduce una serie de sesgos. Estos incluyen un sesgo del observador en la determinación de la masa sacádica, una dependencia de respuestas sacádicas temporalmente consistentes a lo largo de una época determinada y una incapacidad para evaluar la magnitud de la respuesta de fase lenta.

Con el fin de abordar estas preocupaciones con los enfoques actuales de evaluación de OKR y permitir una cuantificación en profundidad de alto rendimiento de los parámetros de OKR, hemos desarrollado un nuevo método de análisis para cuantificar las formas de onda de OKR. Nuestro enfoque utiliza una plataforma de software accesible basada en Python llamada "PyOKR". Con este software, el modelado y la cuantificación de las respuestas de fase lenta de OKR se pueden estudiar con mayor profundidad y con una mayor parametrización. El software proporciona evaluaciones cuantitativas accesibles y reproducibles de las respuestas a una gran variedad de estímulos visuales y también seguimiento visual bidimensional en respuesta al movimiento horizontal y vertical.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins (JHUSOM) fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la JHUSOM. Todos los experimentos realizados en la Universidad de California, San Francisco (UCSF) se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Programa Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UCSF.

1. Recopilación de datos de comportamiento

1. Registre los movimientos oculares OKR utilizando el método de video-oculografía de elección para generar datos de onda (es decir, una serie temporal del ángulo de mirada del ojo en coordenadas esféricas).
   NOTA: Los datos representativos recolectados en JHUSOM se obtuvieron mediante cirugía de implante de cabeza y video-oculografía, como se describió anteriormente ^9,13 (Figura 1). Los datos representativos recogidos en la UCSF se obtuvieron a través de la cirugía de implante de cabecera y el método de videooculografía, tal y como se ha descrito anteriormente en¹⁰ (Figura 7).
   1. Tome nota de los parámetros del estímulo y de la grabación: la velocidad de fotogramas de la grabación, la velocidad y la dirección del estímulo, y los períodos de tiempo entre y después de las épocas del estímulo. En el caso de los estímulos sinusoidales, fíjate también en la amplitud y la frecuencia de la onda del estímulo.
2. Exporte los datos de onda recopilados como un archivo . Archivo CSV que contiene datos de ondas horizontales y verticales (acimut y elevación).
   1. Organice los datos de onda como un archivo delimitado por tabulaciones. Fichero CSV con dos columnas que contienen datos horizontales (epxWave) y datos verticales (epyWave).

2. Instalación de software de análisis

1. Descarga e instala Python.
   1. Para la supervisión de gráficos, instale Spyder a través de Anaconda.
   2. Para asegurarse de que los gráficos funcionen correctamente en Spyder, vaya a Herramientas > Preferencias > Consola de Ipython > Gráficos > Backend de gráficos. Establezca En línea en Automático.
2. Cree un nuevo entorno de Anaconda con Python.
3. Instale PyOKR a través de PyPi con pip install PyOKR para instalar la versión más reciente junto con las dependencias del paquete (Archivo de codificación suplementario 1 y Archivo de codificación suplementario 2)
4. Si se está utilizando una computadora con Windows, ejecute desde PyOKR import OKR_win como o y luego o.run().
5. Si se está utilizando una computadora Mac, ejecute desde el OKR_osx de importación de PyOKR como o y luego o.run().

3. Análisis de los datos de las olas

1. Inicialización de análisis e importación de archivos
   1. Ejecute o.run() en un script .py para abrir la interfaz de usuario.
   2. En Archivo, utilice la función Abrir o el comando Ctrl+O [comando de iOS] para abrir un navegador que permitirá al usuario seleccionar el archivo de onda deseado.
   3. En Archivo, utilice el botón Exportar carpeta o el comando Ctrl+E para abrir un explorador de carpetas que permitirá seleccionar una carpeta de salida a la que se exportarán los análisis finales.
   4. Introduzca el nombre del archivo de análisis final en el archivo de salida en un formato recomendado, como AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Configure el programa para un animal individual utilizando el comando Establecer asunto en Archivo o el comando Ctrl+S para inicializar el conjunto de datos para un animal individual.
2. Definición de los parámetros del archivo de onda
   1. Para comenzar a establecer los parámetros del estímulo, defina la direccionalidad en Seleccionar la dirección del estímulo seleccionando una de las cuatro direcciones cardinales. Para estímulos sinusoidales, seleccione uno que contenga (Horizontal) o (Vertical) según corresponda, con la dirección cardinal definiendo la dirección inicial de la onda sinusoidal.
   2. Establezca el tipo de estímulo en Seleccionar el tipo de estímulo como Unidireccional, Oscilatorio u Oblicuo.
   3. Después de establecer la direccionalidad, importe su propio conjunto de datos de posición de estímulo (Importar datos de vectores de estímulo propios) o genere automáticamente un vector basado en parámetros (Generar vector de estímulo a partir de parámetros). Si importa un vector de estímulo, continúe con 3.2.3.1 y luego salte al paso 3.3. Si genera un vector de estímulo, continúe con los siguientes pasos.
      1. Si importa sus propios datos vectoriales, importe los valores de distancia del estímulo (es decir, una serie temporal que describa cuánto se mueve el estímulo entre cada marco de adquisición adyacente) en el mismo formato descrito en el paso 3.2.1. Además, analice todo el conjunto de datos como una época en lugar de dividirlo en épocas individuales, ya que la funcionalidad para crear subconjuntos de valores de estímulo importados no se ha agregado a partir de PyOKR v1.1.2.
   4. En Parámetros de estímulo, establezca los parámetros del estímulo utilizado para la recopilación de datos.
      1. Establezca el período de tiempo sin estímulo al principio (cabeza) y al final (cola) de una prueba dada con cara y cruz.
      2. Establezca la cantidad de tiempo que se muestra un estímulo, la cantidad de tiempo sin estímulo después y el número de épocas totales dentro de un ensayo determinado con Duración de la época, Longitud del postestímulo y Número de épocas, respectivamente.
      3. Para estímulos unidireccionales y oblicuos, establezca la velocidad del estímulo en grados por segundo con Velocidad horizontal y Velocidad vertical.
      4. Establezca la velocidad de captura de la cámara de colección con Velocidad de fotogramas de captura.
      5. Para estímulos sinusoidales, genere la onda sinusoidal para modelar estímulos oscilatorios con frecuencia y amplitud.
   5. Después de la parametrización, cree el modelo apropiado a partir de la información de estímulo ingresada anteriormente con Generar vector de estímulo a partir de parámetros.
   6. Seleccione una época determinada para el estímulo ingresado utilizando Seleccionar época para escanear el archivo de onda total.
3. Selección supervisada de las fases de seguimiento
   1. Para identificar las regiones de seguimiento lento, seleccione automáticamente las sacadas de fase rápida con Ajuste preliminar haciendo clic en Datos sin filtrar o Datos filtrados, que etiquetarán las posibles sacadas en función de los cambios de velocidad máxima.
   2. En Datos sin filtrar, confirme que las sacadas se seleccionan con precisión con un punto azul. Si la selección automática no es precisa, elimine manualmente los puntos con el botón izquierdo del ratón (LMB) o añada puntos con el botón derecho del ratón (RMB). Cuando las sacadas de fase rápida estén adecuadamente seleccionadas, guarde los puntos con el botón central del ratón (MMB) y cierre el gráfico.
   3. Si desea el filtrado automático, establezca un umbral de puntuación Z y haga clic en Datos filtrados para filtrar automáticamente las sacadas. Si es necesario, utilice la misma supervisión manual que se describe en el paso 3.3.2 para eliminar cualquier ruido.
   4. Después de una selección sacádica adecuada, presione Ajuste de punto para seleccionar la región que desea eliminar. Modifique los puntos superior e inferior a través de un esquema de control similar al descrito anteriormente en el paso 3.3.2. Edite los puntos superiores (verdes) con el LMB o el RMB y edite los puntos inferiores (rojos) con Mayús+LMB o Mayús+RMB. Cuando los puntos estén colocados correctamente, use el MMB para guardar los puntos.
      NOTA: si utiliza una Mac, el ajuste de los puntos inferior y superior se realiza en dos botones separados y sigue el mismo esquema de control que se describe en el paso 3.3.2.
4. Análisis de las fases de seguimiento lento
   1. Establezca el orden del modelo polinómico utilizando Establecer orden polinómico para definir el modelo polinómico que se ajustará a las fases lentas individuales.
      NOTA: Para estímulos unidireccionales u oblicuos, el valor predeterminado es 1 ya que la linealidad es necesaria para calcular la ganancia de seguimiento. Para los estímulos sinusoidales, se necesita un orden superior para modelar la curva de la onda, con un valor predeterminado de 15.
   2. Para analizar el seguimiento, seleccione Análisis final para generar los modelos de fase lenta (Figura 2) para las fases lentas seleccionadas (consulte la Figura 2A-D) y calcule las distancias, las velocidades y las ganancias de seguimiento promediadas a lo largo de la época (Figura 2E).
   3. Para ver el gráfico bidimensional (2D) o tridimensional (3D) de las regiones seleccionadas, seleccione Ver gráfico 2D o Ver gráfico 3D , respectivamente.
   4. Seleccione Agregar época para guardar los valores recopilados generados en el paso 3.4.2. Para ver todos los valores agregados de un animal determinado, así como los promedios de los ensayos recopilados, seleccione Ver conjunto de datos actual.
   5. Después de agregar una época, recorra el resto del archivo con Seleccionar época, siguiendo los pasos 3.3.1 a 3.4.4.
   6. Una vez que un archivo de onda se haya analizado completamente, repita este proceso para todos los demás archivos de un animal determinado abriendo nuevos archivos, estableciendo los parámetros apropiados y analizándolos en consecuencia. Repitiendo los pasos 3.2.1-3.4.5 para cada archivo, genere un conjunto de datos final que contenga todos los datos de oleaje de un animal determinado.
5. Exportación final de datos
   1. Una vez completado el análisis de datos para un animal determinado, con todas las direcciones o estímulos analizados, exporte el conjunto de datos a través de Exportar datos.
      NOTA: El conjunto de datos sin procesar se exportará en función del nombre del archivo de salida y se guardará a lo largo de la ruta establecida por la carpeta de salida como un CSV que contiene datos de época individuales con la media total de cada parámetro de estímulo.
   2. Después de exportar un animal individual, vuelva a inicializar el conjunto de datos con Ctrl+S y, a continuación, repita todos los pasos anteriores para analizar un nuevo animal.
   3. Si es necesario, reorganice todos los datos de salida recopilados para varios animales para facilitar el análisis utilizando el comando Ordenar datos en la pestaña Análisis .
      NOTA: Esta función compilará y ordenará todos los valores promedio de todos los archivos de animales analizados almacenados dentro de la carpeta de salida para permitir una generación más fácil de gráficos y comparaciones estadísticas. La ordenación depende de la nomenclatura de los archivos a partir de v1.1.2. Utilice el esquema de nomenclatura recomendado como se describe en el paso 3.1.4 para cada archivo (por ejemplo, WT_123_Analysis).

Resultados

Para validar el método de análisis descrito anteriormente, cuantificamos la ganancia de seguimiento de OKR en trazas de onda recolectadas de ratones de tipo salvaje y un mutante knockout condicional con un déficit de seguimiento conocido. Además, para probar la aplicabilidad más amplia de nuestro método de análisis, analizamos trazas derivadas de una cohorte separada de ratones de tipo salvaje adquiridos utilizando un método de recolección de video-oculografía diferente. El filtrado automático de los movimientos sacádicos facilita el procesamiento y análisis de los datos OKR (Figura 3). Utilizando registros de estímulos unidireccionales y sinusoidales (Figura 1D), calculamos las ganancias de seguimiento de OKR en las cuatro direcciones cardinales (Figura 2F) para animales de tipo salvaje (n = 13) a estímulos unidireccionales y también el seguimiento de las ganancias en respuesta a estímulos sinusoidales horizontales y verticales (Figura 4). La disparidad en la capacidad de seguimiento en relación con la dirección del estímulo para estímulos unidireccionales y sinusoidales se observa consistentemente en todos los ratones de tipo salvaje, con respuestas horizontales igualmente robustas que demuestran ganancias de seguimiento significativamente mayores que las respuestas verticales, como se ha descrito². Además, también se observan aumentos de seguimiento asimétrico entre las respuestas ascendentes y descendentes en ratones de tipo salvaje que utilizan ambos métodos de recolección de video-oculografía, como se ha informado previamente ^2,10. Las magnitudes relativas y la consistencia de las ganancias de seguimiento en comparación con la caracterización publicada de las respuestas de OKR indican que las ganancias de seguimiento calculadas con el software reflejan con precisión la capacidad de seguimiento. Además de los cálculos de ganancia unidireccional, el movimiento ocular horizontal y vertical se puede modelar simultáneamente (Figura 5), lo que permite una reconstrucción tridimensional del movimiento ocular en respuesta a un estímulo dado. Esto proporciona una capacidad de cuantificación adicional que es útil para futuros estudios que investiguen las respuestas horizontales y verticales acopladas entre sí⁹.

Para validar la utilidad del software para identificar cambios significativos en el comportamiento en diferentes condiciones experimentales, volvimos a analizar nuestros datos publicados⁹ para confirmar que los déficits en el seguimiento vertical evaluados en ese estudio mediante el conteo manual de movimientos sacádicos de fase rápida se reflejan en las ganancias de seguimiento utilizando la metodología presentada aquí. Trabajos previos muestran que la inactivación genética en la retina del factor de transcripción T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) a través del knockout condicional usando Protocadherina 9-Cre (Pcdh9-Cre) causa una pérdida específica de las células ganglionares selectivas en dirección ON sintonizadas hacia arriba (up-oDSGC), y que Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); Los mutantes Pcdh9-Cre exhiben una pérdida específica del seguimiento vertical de OKR⁹. El análisis cuantitativo utilizando el método descrito aquí muestra que Tbx5f/f; Los animales con Pcdh9-Cre conservan ganancias normales de seguimiento horizontal (Figura 6A), similares a las descritas anteriormente y obtenidas mediante el recuento manual de sacadas de fase rápida (ETM) (Figura 2F); sin embargo, estos ratones muestran una pérdida significativa del seguimiento vertical, con ganancias casi nulas en respuesta a los estímulos ascendentes y descendentes (Figura 6B, C). Además, el análisis de las respuestas sinusoidales confirma que los animales Tbx5 cKO exhiben mayores ganancias de seguimiento horizontal, mientras que muestran una disminución significativa del seguimiento vertical (Figura 6D-F). Un nuevo análisis de este fenotipo descrito anteriormente utilizando PyOKR demuestra la precisión y sensibilidad de esta nueva metodología, que permite comparaciones cuantitativas de las respuestas de OKR en ratones de diferentes cepas genéticas.

Por último, analizamos los rastros de OKR verticales de tipo salvaje recogidos en la UCSF para validar la utilidad de la aplicación de software con diferentes métodos de video-oculografía y parámetros de estímulo. Los datos de la UCSF se recogieron utilizando un sistema de proyección hemisférica en el que las rejillas móviles se presentan al ratón a través de la reflexión de un proyector de longitud de onda de 405 nm sobre un hemisferio que rodea al animal con la cabeza fija¹⁰ (Figura 7A). Las rejillas verticales unidireccionales se presentaron a los ratones a una velocidad de 10 grados por segundo, y las respuestas OKR se registraron en intervalos de 60 s (Figura 7B,C). Las trazas verticales se analizaron cuantitativamente a través del PyOKR, y las respuestas ascendentes se compararon con las respuestas descendentes (Figura 7D). Las respuestas al alza fueron significativamente más fuertes que las bajistas, como se esperaba¹⁰; sin embargo, las ganancias de seguimiento se redujeron ligeramente en comparación con las trazas registradas en JHUSOM (Figura 2F). Además, se analizó la cuantificación de las respuestas sinusoidales mediante PyOKR (Figura 7E), y una asimetría significativa en las respuestas verticales a estímulos que se mueven sinusoidalmente se refleja en las ganancias calculadas (Figura 7F). Las diferencias entre los valores de ganancia recopilados en JHUSOM y UCSF se pueden atribuir a diferencias entre los parámetros del estímulo, incluidas las diferentes velocidades, tipos y longitudes de onda del estímulo; sin embargo, la consistencia general que observamos en nuestro análisis de los datos obtenidos utilizando cada método de recopilación muestra que nuestro PyOKR puede adaptarse fácilmente más allá de nuestro sistema de recopilación de datos JHUSOM OKR y aplicarse a otras grabaciones de OKR, independientemente de los métodos de video-oculografía. Estos resultados demuestran que la plataforma de software descrita aquí es precisa y se puede aplicar generalmente al estudio de las respuestas oculomotoras, lo que permite comparaciones cuantitativas precisas entre animales pertenecientes a diferentes grupos para avanzar en el estudio de los circuitos de estabilización visual de la imagen.

Figura 1: Recopilación de datos de respuesta OKR. (A) Aparato de arena virtual OKR para la estimulación conductual, como se describió anteriormente ^9,13. Cuatro monitores rodean a un animal con la cabeza fija (1), mostrando un estímulo de tablero de ajedrez en continuo movimiento (2). El tambor virtual puede presentar movimiento unidireccional en las cuatro direcciones cardinales, así como estímulos sinusoidales oscilatorios. El ojo izquierdo del ratón se ilumina con una luz infrarroja (IR) y se graba con una cámara (3) para registrar las respuestas visuales del sistema reflejadas en el seguimiento ocular. (B) El análisis del seguimiento ocular se realiza mediante la captura de la pupila y un reflejo corneal generado por la luz infrarroja. La recolección de datos y el cálculo de los movimientos oculares en respuesta al tambor virtual se realizaron como se describió anteriormente ^9,13. (C) Esquema de vectores oculares que se mueven verticalmente (onda Y) y horizontalmente (onda X). (D) Trazas de muestra de la respuesta de seguimiento de un ojo al movimiento unidireccional hacia arriba y hacia atrás, y también al movimiento sinusoidal vertical y horizontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de seguimiento de respuestas visuales unidireccionales. (A-D) Identificación y selección de fases de seguimiento lento para el análisis de ganancia. Se muestran trazos unidireccionales de muestra con respuestas visuales al movimiento hacia adelante (A), hacia atrás (B), hacia arriba (C) y hacia abajo (D) en relación con el ojo del ratón. Las fases lentas se identifican mediante la adición de puntos rojos y verdes descritos en el paso 3 para eliminar los movimientos sacádicos, y las fases lentas seleccionadas se resaltan en amarillo. Las regresiones polinómicas se superponen a las trazas como líneas. (E) Cuantificación de las trazas de muestra (A-D) tal como se organizan en la lectura de PyOKR. Para cada trazo, se calculan las velocidades XY totales y las ganancias respectivas, independientemente de la direccionalidad. En las respuestas unidireccionales, estas velocidades totales generalmente reflejarán la velocidad individual en una determinada dirección; Sin embargo, en el caso de las respuestas sinusoidales, este valor reflejará la velocidad media general del ojo. Los componentes de velocidad horizontal y vertical se desglosan para mostrar la velocidad en cada dirección respectiva. A continuación, se calcula la ganancia en función de las velocidades de estímulo presentadas. (F) Ganancias de seguimiento calculadas de animales de tipo salvaje (n = 13) en las cuatro direcciones cardinales en comparación con su cuantificación ETM asociada. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizan con un ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El filtrado automático de los movimientos sacádicos facilita el procesamiento y el análisis de los datos OKR. (A-D) El filtrado automático de las trazas de la Figura 2A-D elimina los movimientos sacádicos y modela solo el movimiento de fase lento mediante la eliminación de cambios rápidos de velocidad y la unión de las fases lentas. La pendiente final representa el movimiento total del ojo durante la época dada. (E) Cuantificación de las ganancias de los datos de muestra filtrados, tal como se organizan en la lectura de PyOKR. (F) La comparación de los valores de ganancia entre los rastros oculares de muestra no filtrados vs. filtrados no refleja diferencias significativas. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizan con una prueba U de Mann-Whitney entre resultados sin filtrar y filtrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Derivación de las ganancias de seguimiento en respuesta a estímulos visuales oscilatorios. (A,B) Las respuestas de movimiento ocular vertical (A) y horizontal (B) a estímulos que se mueven sinusoidalmente se pueden modelar en relación con los parámetros de estímulo oscilatorio definidos. Las regiones seleccionadas se etiquetan en amarillo con la aproximación polinómica superpuesta sobre el trazado. Un modelo del estímulo se presenta como una onda sinusoide naranja detrás de la traza para permitir la referencia de cuál es el estímulo en cada punto. (C) Los cálculos de ganancia de las respuestas sinusoidales de tipo salvaje (n = 7) reflejan respuestas asimétricas entre la capacidad de seguimiento horizontal y vertical. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizan con un ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. **p<0,01,***p<0,005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El seguimiento direccional se puede modelar en sus componentes horizontal y vertical. (A) Componente vertical de una onda de seguimiento ocular en respuesta a un estímulo ascendente. (B) Componente horizontal de una onda de seguimiento ocular en respuesta a un estímulo ascendente. (C) Trayectoria general del ojo en direcciones verticales y horizontales. (D) Modelo tridimensional del vector de movimiento del ojo a lo largo del tiempo en respuesta al movimiento descendente. Los datos de rastreo sin procesar se muestran en rojo y el modelo de regresión de la trayectoria se muestra en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis de los OKR en Tbx5f/f; Los ratones Pcdh9-Cre muestran déficits significativos en las ganancias de seguimiento vertical unidireccional. (A) Tbx5f/f; Los animales con Pcdh9-Cre no muestran cambios significativos en la ganancia de seguimiento horizontal. (B,C) Tbx5f/f; Los animales con Pcdh9-Cre muestran una reducción significativa de la ganancia en sus respuestas verticales: hacia arriba (B) y hacia abajo (C). (D,E) Respuestas sinusoidales de Tbx5f/f; Pcdh9-Cre animales en respuesta a estímulos oscilatorios horizontales (D) y verticales (E). f) Cuantificación de Tbx5f/f; Las respuestas oscilatorias de Pcdh9-Cre muestran aumentos significativos en las ganancias de seguimiento horizontal, pero muestran disminuciones en las respuestas verticales. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizan con las pruebas U de Mann-Whitney. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Aplicación de PyOKR a los datos adquiridos a partir de métodos alternativos de videooculografía. (A) Aparato para la estimulación virtual de tambores OKR, como se describe¹⁰. Un proyector DLP de longitud de onda de 405 nm se refleja a través de un espejo convexo en un hemisferio para crear un tambor virtual que rodea el campo de visión del animal. Los movimientos oculares se miden utilizando una cámara NIR colocada fuera del hemisferio. Las rejillas de barra unidireccionales y sinusoidales se muestran a un animal con la cabeza fija en direcciones verticales. (B,C) Las fases de seguimiento ascendente (B) y descendente (C) se identifican y seleccionan para el análisis cuantitativo. Las fases lentas se resaltan en amarillo. (D) Ganancias de seguimiento calculadas a partir del seguimiento vertical de animales de tipo silvestre (n = 5) utilizando los métodos descritos aquí. Se observa una capacidad de seguimiento asimétrica, con una disminución significativa del seguimiento descendente. (E) Respuesta oscilatoria a estímulos sinusoidales modelada para cuantificar las ganancias de seguimiento en animales de tipo salvaje (n = 8). Las fases lentas se resaltan en amarillo. (F) La cuantificación de las ganancias sinusoidales revela una disminución de las ganancias de seguimiento descendente en comparación con las ganancias ascendentes. Los datos se presentan como media ± DE. Los datos se analizan con las pruebas U de Mann-Whitney. *p<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de codificación suplementario 1: PyOKR Windows Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: PyOKR Mac Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

PyOKR proporciona varias ventajas para estudiar las respuestas visuales reflejadas en los movimientos oculares. Estos incluyen opciones de precisión, accesibilidad y recopilación de datos, además de la capacidad de incorporar parametrización y velocidades de estímulo variables.

La evaluación de la ganancia de seguimiento ocular directo proporciona una caracterización precisa del movimiento ocular que es una métrica cuantitativa más directa que el recuento manual tradicional de sacadas de fase rápida (ETM). Aunque útil, el conteo sacádico proporciona una evaluación indirecta del movimiento de seguimiento real. La plataforma de software PyOKR proporciona una cuantificación directa de las velocidades de seguimiento, teniendo en cuenta parámetros adicionales, incluidas las amplitudes sacádicas y la longitud de las fases lentas. Además, el conteo de movimientos sacádicos en fase rápida se basa en la evaluación de la frecuencia de los movimientos sacádicos durante un período de tiempo determinado, lo que requiere que cada rastro tenga poco o ningún ruido, incluidas las muestras sacádicas aleatorias del estrés animal. Estos factores hacen que muchos rastros recogidos sean inutilizables y, por lo tanto, añaden un tiempo significativo para la recopilación de datos con el fin de evaluar con precisión el seguimiento ocular. Sin embargo, el software descrito aquí aborda este problema cuantificando directamente las fases lentas individuales dentro de una traza dada y calculando las ganancias en puntos instantáneos a lo largo de la traza. Lo logra comparando la velocidad del movimiento del ojo con la velocidad del estímulo en un punto dado. Dado que la frecuencia sacádica ya no es el parámetro definitorio para el análisis, el ruido puede eliminarse fácilmente bajo la supervisión del usuario, lo que reduce el impacto del ruido en la calidad del análisis. Esto permite que los datos recopilados sean más utilizables y que la estadística sea más potente a la hora de analizar estos datos, lo que aumenta la precisión y la reproducibilidad a la hora de cuantificar el seguimiento ocular y caracterizar los parámetros OKR para ratones individuales y diferentes grupos de ratones. El filtrado automatizado de los movimientos sacádicos basado en los cambios rápidos en la velocidad del ojo encontrados a través de un método de puntuación Z también se ha utilizado para caracterizar la ganancia de seguimiento¹⁰. Para incorporar este método de filtrado dentro del software, incluimos este tipo de filtrado de velocidad pero con herramientas adicionales como la parametrización de umbrales y la supervisión sacádica manual para reducir los posibles errores generados por este enfoque. Si se utilizan trazas sin procesar para el análisis en lugar de utilizar el filtrado automatizado, los cambios rápidos en el movimiento ocular causados por movimientos sacádicos, parpadeos o angustia del ratón se identifican a través de cambios de velocidad máxima a través de una estimación de la densidad de kernel gaussiana de la velocidad de la traza. Esto permite la selección automática de las regiones de segmentación y, finalmente, la eliminación basada en la supervisión manual del usuario. La supervisión manual proporciona una mayor tolerancia a las trazas ruidosas, lo que permite a los usuarios corregir rápidamente las marcas de falsos positivos o falsos negativos para cambios oculares rápidos. Además, dado que PyOKR utiliza aproximaciones polinómicas para modelar el movimiento general de los ojos en una dirección determinada, el ruido en puntos individuales se suaviza, lo que permite evaluar las velocidades de trayectoria con cierta tolerancia al ruido en la traza. Solo en el caso de una calidad de datos extremadamente mala en todo el rastreo o una calibración incorrecta durante la recopilación de datos, el software no podrá generar análisis de datos precisos. En conjunto, al incorporar herramientas de supervisión de usuario, filtrado y cálculo instantáneo de ganancias, la aplicación de software PyOKR descrita aquí genera un seguimiento de las ganancias con alta precisión y métricas más directas que los métodos anteriores.

PyOKR también tiene muchas características que permiten personalizar los análisis de OKR para satisfacer las necesidades del usuario. La introducción de los parámetros de estímulo, así como de los vectores de estímulo en bruto, permite al usuario definir con precisión cualquier estímulo deseado. Estos pueden incluir estímulos unidireccionales, sinusoidales u oblicuos, todos los cuales el software puede utilizar para generar ganancias de seguimiento precisas para las respuestas visuales asociadas. Con la parametrización del estímulo de esta metodología, las ganancias instantáneas calculadas en cada fotograma se pueden generar de forma fiable con alta precisión, independientemente del estímulo introducido. Aunque los datos de estímulos oblicuos no se analizaron aquí, se pueden calcular ganancias precisas a través de vectores de velocidad XY descompuestos para reconstruir un ángulo oblicuo, lo que permite cálculos precisos de ganancia de estímulos oblicuos. A través de la parametrización accesible de la configuración de estímulos, nuestra herramienta es ampliamente aplicable al trazado de ondas en respuesta a cualquier estímulo visual. Además, el software facilita un mayor rendimiento y una cuantificación reproducible en comparación con los métodos anteriores. La clasificación de los seguimientos de OKR requiere mucho tiempo y trabajo; sin embargo, la interfaz de usuario optimizada de PyOKR es capaz de filtrar fácilmente muchos seguimientos a una velocidad mayor de lo que era posible anteriormente. Esto no solo permite una cuantificación más rápida de las trazas, sino que también revela parámetros OKR adicionales, incluida la cuantificación directa de las velocidades oculares, los componentes vectoriales direccionales del movimiento ocular y las ganancias instantáneas en relación con el estímulo en los componentes horizontal y vertical del vector de movimiento. Además, dada la identificación automatizada de los movimientos sacádicos y el cálculo de las velocidades de seguimiento que ofrece nuestro método, el posible sesgo del experimentador en el análisis de datos se reduce en gran medida en comparación con otros métodos de cuantificación, como el recuento manual de ETM o el filtrado automatizado de trazas, que pueden generar falsos negativos. Además, se pueden generar grandes cantidades de datos de comportamiento y compilarlos automáticamente para simplificar el análisis posterior. A través de las funciones de exportación y clasificación de datos disponibles en PyOKR, los datos de seguimiento de múltiples animales y condiciones se pueden procesar automáticamente para permitir el almacenamiento organizado de datos, así como un análisis estadístico rápido. Para realizar experimentos que empleen múltiples condiciones durante la misma sesión de grabación, como la manipulación de circuitos o respuestas visuales, recomendamos recopilar datos en archivos de onda discreta o épocas subestablecidas que permitan el almacenamiento de conjuntos de datos separados en función de las variables independientes de interés derivadas de esta única sesión de grabación. Un ejemplo sería si uno está probando diferencias en las respuestas a diferentes frecuencias de onda sinusoidal dentro de un paradigma experimental, recomendaríamos guardar diferentes parámetros en diferentes archivos de onda para un análisis separado, como WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis y WT_1_Freq0.3Analysis. En la versión actual, una vez que se analizan las épocas, no hay funcionalidad para seleccionar valores de época individuales dentro del conjunto de datos, aunque esto podría agregarse en el futuro si es necesario.

Por último, nuestro método es adaptable a múltiples métodos de recogida de video-oculografía y proporciona una plataforma de análisis robusta que puede adaptarse fácilmente a las necesidades específicas de un laboratorio. A través del análisis de datos de OKR de tipo salvaje y mutantes existentes, y también de datos de OKR de tipo salvaje recopilados utilizando diferentes métodos y estímulos, demostramos aquí que nuestra herramienta de análisis es capaz de a) cuantificar el seguimiento de OKR de cualquier estímulo direccional con alta precisión y rendimiento; b) identificar las diferencias de comportamiento del sistema visual resultantes de perturbaciones genéticas; y c) evaluar los datos de seguimiento visual de diferentes métodos de videooculografía. La accesibilidad y la adaptabilidad general de nuestra plataforma de análisis facilitan un mayor estudio de las respuestas OKR y mejorarán los estudios conductuales que caracterizan el ensamblaje y la dinámica de los circuitos neuronales en el contexto de las respuestas oculomotoras.

Para obtener mediciones precisas y posteriores análisis de datos útiles, son necesarios varios pasos para la recopilación de datos. Recomendamos recopilar datos de OKR en varias sesiones para permitir que el animal se aclimate al aparato de prueba de comportamiento y reducir el impacto del estrés animal en las respuestas conductuales; sin embargo, el registro excesivo puede conducir a la potenciación de la respuesta OKR¹³, por lo que se recomienda tener cuidado en el diseño de los regímenes de prueba. Durante la recopilación de datos OKR, la calibración adecuada del equipo de video-oculografía es fundamental para una cuantificación precisa, ya que la calidad de los datos analizados es una función directa de la traza procesada. Es importante destacar que el uso del IDE de Spyder es necesario para la supervisión de grafos a través de Matplotlib. Dada la accesibilidad y el diseño del marco de nuestra plataforma, todas las herramientas necesarias están disponibles para que otros amplíen las capacidades del software y adapten esta plataforma a distintos paradigmas experimentales de comportamiento.

En conclusión, describimos aquí una herramienta nueva, accesible y versátil para el análisis de las respuestas conductuales de los OKR con mayor profundidad y con más potencia cuantitativa que la que está disponible actualmente utilizando las metodologías existentes. PyOKR puede ser utilizado fácilmente por usuarios novatos de Python y contiene una canalización de análisis establecida y una interfaz para el análisis rápido y preciso de las ondas de OKR con mayor rigor y reproducibilidad. La adaptabilidad de este software proporciona un marco flexible que los usuarios pueden adaptar fácilmente a sus necesidades específicas y a sus procedimientos de recopilación de datos. Anticipamos que este método cuantitativo avanzará en el estudio de las respuestas oculomotoras y mejorará nuestra comprensión del desarrollo y la función de los circuitos neuronales que impulsan los comportamientos del sistema visual.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ratones C57BL/6J	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Cámara de registro de reflejos optocinéticos - JHUSOM	Custom-built	N/A	se describe en Al-Khindi et al.(2022)9 y Kodama et al. (2016)13
Cámara de registro de reflejos optocinéticos - UCSF	Custom N	/A	se describe en Harris y Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Regalo de B. Bruneau	N/A	Como se describe en Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD