Artículo de método

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo intermuscular humano y secuenciación de ARN de núcleos individuales posteriores

DOI:

10.3791/66784

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3 de mayo de 2024

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1Translational Research Institute, AdventHealth, 2Steno Diabetes Center Copenhagen, 3Division of Endocrinology and Metabolism, University of Pittsburgh, 4Gerontology and Geriatric Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 5Department of Internal Medicine - Rheumatology, Allergy, and Clinical Immunology, University of California Davis Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo intermuscular (IMAT) es un depósito adiposo relativamente poco estudiado situado entre las fibras musculares. El contenido de IMAT aumenta con la edad y el IMC y se asocia con enfermedades metabólicas y degenerativas musculares; sin embargo, la comprensión de las propiedades biológicas de IMAT y su interacción con las fibras musculares circundantes es muy deficiente. En los últimos años, la secuenciación de ARN de una sola célula y de núcleos nos ha proporcionado atlas específicos del tipo de célula de varios tejidos humanos. Sin embargo, la composición celular del IMAT humano sigue siendo en gran medida inexplorada debido a los desafíos inherentes a su accesibilidad a partir de la recolección de biopsias en humanos. Además de la cantidad limitada de tejido recolectado, el procesamiento del IMAT humano es complicado debido a su proximidad al tejido muscular esquelético y la fascia. La naturaleza cargada de lípidos de los adipocitos lo hace incompatible con el aislamiento de una sola célula. Por lo tanto, la secuenciación de ARN de un solo núcleo es óptima para obtener transcriptómica de alta dimensión con resolución de una sola célula y proporciona el potencial de descubrir la biología de este depósito, incluida la composición celular exacta de IMAT. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales. Este protocolo permite el perfil de miles de núcleos utilizando un enfoque basado en gotas, lo que proporciona la capacidad de detectar tipos de células raras y poco abundantes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo intermuscular (IMAT) es un depósito adiposo ectópico que reside entre y alrededor de las fibras musculares1. Como se describe en detalle en una revisión reciente de Goodpaster et al., la IMAT se puede detectar mediante tomografía computarizada (TC) de alta resolución y resonancia magnética (RMN) (Figura 1A, B) y se encuentra alrededor y dentro de las fibras musculares en todo el cuerpo1. La cantidad de IMAT varía mucho entre individuos y está influenciada por el IMC, la edad, el sexo, la raza y el sedentarismo 2,3,4. Además, la deposición de IMAT se observa comúnmente en condiciones patológicas asociadas con la degeneración muscular5, y numerosos estudios han documentado un aumento de la masa de IMAT en individuos con obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico y resistencia a la insulina 6,7,8,9. Sin embargo, las propiedades celulares y biológicas de IMAT apenas están comenzando a desentrañarse. La accesibilidad limitada y la variación en las ubicaciones y el contenido de IMAT en todo el cuerpo han dificultado la recolección de muestras de este depósito adiposo único2. Además, las muestras se "contaminan" fácilmente con músculo esquelético (MS) en el momento de la recolección, lo que dificulta el desciframiento de la separación entre la contribución biológica de los diferentes tejidos (Figura 1C). Con este fin, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq), que ha ganado considerable atención durante la última década, sirve como una metodología ideal para permitir la separación de patrones de expresión génica derivados de IMAT y SM con resolución de una sola célula. Además, el aislamiento de núcleos es particularmente útil para el tejido adiposo debido a los grandes adipocitos cargados de lípidos, que son imposibles de disociar en una suspensión unicelular sin comprometer la integridad de las células. Por último, esta tecnología tiene el potencial de descubrir nuevos marcadores de adipocitos específicos de IMAT y descubrir la composición y presencia de diferentes poblaciones de células progenitoras, así como estudiar la variación de la composición celular en condiciones patológicas y normales.

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Figura 1: Imágenes de IMAT. Imagen representativa de resonancia magnética (RM) de IMAT de (A) una mujer delgada de mediana edad y (B) un hombre de mediana edad con obesidad. Rojo: tejido adiposo subcutáneo, amarillo: tejido adiposo intermuscular, verde: músculo esquelético, azul: hueso. Imagen cortesía de Heather Cornnell, Instituto de Investigación Traslacional AdventHealth. (C) Muestra de tejido fresco con IMAT (rodeado por una línea negra discontinua). Imagen cortesía de Meghan Hopf, del Instituto de Investigación Traslacional AdventHealth y Bryan Bergman, de la Universidad de Colorado. Esta figura ha sido modificada con permiso de Goodpaster et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se han publicado varios estudios de la industria ganadera que investigan el marmoleado de la carne (IMAT en particular) en cerdos, pollos y ganado utilizando células individuales (sc) y snRNA-seq10. Estos estudios han identificado varias subpoblaciones de adipocitos y marcadores de potenciales células progenitoras de IMAT 11,12,13; sin embargo, se desconoce si estas composiciones celulares se traducen al IMAT humano. Hasta donde sabemos, solo un estudio ha analizado la heterogeneidad celular del músculo humano con infiltración grasa, obtenido de pacientes masculinos con artrosis de cadera, utilizando snRNA-seq14. Los investigadores reportaron una pequeña población de adipocitos y varias subpoblaciones de progenitores fibroadipogénicos (FAP) dentro de la gran población de mionúcleos14. Nuestro estudio es el primero en desarrollar un método para interrogar directamente IMAT diseccionado manualmente de músculo humano para la composición celular utilizando snRNA-seq.

Es importante destacar que los protocolos para la secuenciación de snRNA deben personalizarse para el tejido específico estudiado, ya que la cantidad de tejido disponible y las propiedades físicas del tejido específico dictarán los pasos de procesamiento óptimos. La producción de tejido para IMAT suele ser pequeña, a menudo no excede los 50 mg, incluso cuando se realizan biopsias guiadas por ecografía. Por lo tanto, el procesamiento adecuado de este tejido escaso es esencial. Creemos que este protocolo servirá como un recurso valioso para los investigadores que estudian el IMAT humano.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La muestra utilizada para este protocolo formó parte del Estudio de Músculo, Movilidad y Envejecimiento (SOMMA)15, que fue aprobado por el Western IRB-Copernicus Group (WCG) Institutional Review Board y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito para su participación en el estudio.

NOTA: Este protocolo es una adaptación de un protocolo anterior utilizando 100 mg de tejido adiposo subcutáneo abdominal humano en una plataforma basada en nanopocillos16. El protocolo actual está optimizado para 50 mg de IMAT humano y la preparación de bibliotecas utilizando una plataforma basada en gotas. Es posible que se requiera una mayor optimización de este protocolo para los aislamientos de núcleos de IMAT no humanos u otros depósitos adiposos.

1. Preparación de tampones y reactivos (Tabla 1 y Tabla 2)

NOTA: Prepare los tampones frescos el día del experimento y no los reutilice.

  1. Enfriar previamente una centrífuga a 4 °C.
  2. Preparar el tampón de homogeneización y el medio de aislamiento de núcleos.
    1. Obtenga dos cubos de hielo y enfríe previamente 2 tubos cónicos de 15 ml.
    2. Mezcle todos los reactivos para el tampón de homogeneización (HB) en un tubo cónico de 15 mL en el orden indicado en la Tabla 1. Mantener en hielo. Mezclar por vórtice.
    3. Mezcle todos los reactivos para el medio de aislamiento de núcleos (NIM) en un tubo cónico de 15 mL en la lista ordenada de la Tabla 2. Mantener en hielo. Mezclar por vórtice.
    4. Prepare Triton-X al 10% añadiendo 100 μL de Triton X-100 a 900 μL de agua libre de nucleasas. Vórtice para asegurar una mezcla adecuada. Mantener a temperatura ambiente (RT).

ReactivoVolumen (μL)Concentración final (mM)
1 vez2 veces
1 M MgCl210205
1 m tampón Tris, pH 8.0204010
2 M KCl255025
1,5 m de sacarosa (-4oC)334668250
TDT de 1 mM240,001 (~1 μM)
Inhibidor de la proteasa 100x20401 vez
Superasin 20 U/μL40800,4 U/μL
Agua libre de nucleasas15493098-
Volumen total20004000-

Tabla 1: Tampón de homogeneización (HB). Mantener en hielo. Mezclar por vórtice.

ReactivoVolumen (μL)Concentración final (mM)
1 vez2 veces
EDTA0.40.80.1
Inhibidor de la ARNasa Ribolock (40U/μL)40800,8 U/μL
1% BSA-PBS (-/-)1959.63919.2-
Volumen total20004000-

Tabla 2: Medio de aislamiento de núcleos (NIM). Mantener en hielo. Mezclar por vórtice.

2. Pulverización de tejido congelado (Figura 2A)

  1. Configure la estación de trabajo para la homogeneización.
    1. Llene el bote con nitrógeno líquido (LN2).
      PRECAUCIÓN: cuando trabaje con LN2, use siempre gafas y guantes criogénicos.
    2. Obtenga 2 morteros, 1 mortero, 1 espátula de microcuchara, 1 doblón de vidrio y 1 mortero de acero inoxidable para el tapón automático.
    3. Configura el dosuncer automático.
    4. Llene un vaso de precipitados con hielo y enfríe previamente la ducha de vidrio.
  2. Llene los 2 morteros (que contienen el mortero y la espátula) con LN2 para enfriar los instrumentos. Deja que el LN2 se evapore y repite.
  3. Mientras los instrumentos se enfrían, agregue 1 ml de HB a la ducha de vidrio.
  4. Llene ambos morteros con LN2 por última vez y vierta la muestra de 50 mg de IMAT en uno de los morteros.
  5. Pulveriza el IMAT con el mortero presionándolo suavemente sobre el trozo de tejido para romperlo en trozos pequeños. Asegúrate de que todas las piezas estén pulverizadas.
  6. El LN2 se evaporará lentamente mientras pulveriza el tejido. Cuando el tejido esté correctamente pulverizado, y todavía quede 1/4 - 1/2 de un mortero de LN2 , incline el mortero hacia el borde del mortero para recoger el tejido pulverizado por el labio. Deje que el LN2 se evapore por completo.
  7. Inmediatamente después de que se haya evaporado el último LN2 , coloque el tejido pulverizado en el vaso que contiene 1 mL de HB.

3. Homogeneización del tejido pulverizado

  1. Homogeneizar el tejido pulverizado con el dosificador automático. Lleve el vidrio hacia arriba y hacia abajo del mortero de acero inoxidable durante 10 golpes en la dirección hacia adelante, seguidos de 10 golpes en la dirección inversa.
  2. Asegúrese de que la solución esté turbia después de la homogeneización y no contenga trozos visibles de tejido. A menudo se espera un color rosa claro debido a la contaminación con tejido muscular.
  3. Transfiera el homogeneizado a un tubo de baja unión preenfriado de 1,7 mL en hielo.
  4. Utilice 400 μL de HB para enjuagar la onza y asegurarse de que todo el material se transfiere y añádalo al tubo.
    NOTA: Se pueden procesar dos muestras a la vez. Para hacer esto, duplique la cantidad de HB y NIM. Pulverizar y homogeneizar una muestra de tejido e inmediatamente después pulverizar y homogeneizar la segunda muestra de tejido para poder realizar los pasos de aislamiento y limpieza en paralelo.

4. Aislamiento y limpieza de núcleos (Figura 2B)

  1. Añadir 14 μL de Triton-X (10%) al homogeneizado para una concentración del 0,1%.
  2. Mantenga el tubo en hielo y en la oscuridad durante 10-15 minutos mientras realiza un vórtice cada 3 minutos.
  3. Humedecer previamente un filtro de células de 100 μm y otro de 40 μm (por muestra) con 100 μL de RT DPBS para cada uno en un tubo cónico de 50 mL.
  4. Filtre el homogeneizado a través del filtro de células de 100 μm.
  5. Enjuague el tubo de 1,7 ml con 400 μl de HB y filtre a través del filtro de células de 100 μm.
  6. A continuación, filtre la solución a través del filtro de células de 40 μm.
  7. Transfiera una cantidad igual de solución a dos tubos de baja unión preenfriados de 1,7 mL, lo que corresponde a ~ 900 μL en cada tubo.
  8. Centrifugar los tubos durante 10 min a 2700 x g a 4 °C. Debe haber una pequeña bolita visible después de la centrifugación.
  9. Retire y deseche la capa lipídica superior y el sobrenadante restante, dejando ~50 μL de solución del primer tubo.
  10. Repita para el segundo tubo.
  11. Vuelva a suspender completamente el pellet en el primer tubo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 20 veces y transfiéralo a un nuevo tubo de baja fijación de 1,7 ml. Evita crear burbujas.
  12. Repita este procedimiento para el segundo tubo y transfiera la solución resuspendida al mismo tubo.
  13. Añadir 500 μL de NIM y mezclar con pipeteo.
  14. Centrifugar el tubo con una balanza a 1000 x g durante 10 min a 4 °C.
  15. Retire el sobrenadante, dejando ~50 μL, y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que el gránulo se vuelva a suspender. Opcionalmente, transfiera el gránulo resuspendido a un nuevo tubo limpio si queda algún resto de lípidos en el costado del tubo.
  16. Añadir 200 μL de NIM y mezclar mediante pipeteo.

5. Tinción y recuento de núcleos (Figura 2C y Figura 3)

NOTA : Para facilitar el recuento, establezca un protocolo de "conteo de núcleos" en un contador de células automatizado, ya que el ajuste del campo claro y los canales DAPI puede afectar en gran medida el recuento. Ajuste los canales para que solo se capturen los núcleos y no los residuos. Asegúrese de que el canal de campo claro solo marque los "objetos" que también tengan una mancha DAPI.

  1. Agregue 1 gota de la solución de tinción de células vivas y déjela en la oscuridad, sobre hielo, durante 15 minutos.
  2. Filtre la solución a través de un filtro de células de 30 μm.
  3. Mezcle la solución de núcleos pipeteando y agregue 10 μL de la solución a un portaobjetos de la cámara de recuento de células.
  4. Cuente los núcleos mediante un contador de células automatizado.
    NOTA: La concentración óptima es de 1000 núcleos/μL correspondiente a 1,0 x 106/mL.
    1. Asegúrese de que no haya grumos de núcleos, ya que esto podría obstruir el chip para generar gotas de núcleos individuales (Figura 3).
    2. Si la concentración de núcleos no es lo suficientemente alta, centrifugar la solución a 1000 x g durante 10 minutos a 4 °C para obtener un pellet, retirar el sobrenadante y volver a suspender en un volumen más pequeño.
    3. Si el grado de residuos en la solución es alto, vuelva a suspender la solución de los núcleos en un volumen mayor de NIM (es decir, 1 mL) y vuelva a filtrar a través de un filtro de células de 30 μm. A continuación, centrifugar a 1000 x g durante 10 min a 4 °C y volver a suspender en el volumen adecuado en relación con la concentración de núcleos.
  5. Después de obtener la concentración de núcleos, proceda directamente al primer paso en la preparación de la biblioteca.

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Figura 3: Tinción de núcleos aislados. Imagen del contador celular de núcleos teñidos con NucBlue/DAPI (imagen de la izquierda) y la imagen de campo claro correspondiente (imagen de la derecha). La presencia de pequeñas cantidades de escombros es evidente en la imagen de campo claro. El contador de celdas automatizado utilizado aquí no tiene una opción para incluir barras de escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Parámetros de preparación y secuenciación de la biblioteca

  1. Consulte un protocolo completo para la preparación de bibliotecas utilizando el enfoque de núcleo único basado en gotas disponible en la página web del proveedor17.
    1. Apunta a una recuperación de núcleos objetivo de 10.000. Sin embargo, en el caso de muestras con un alto nivel de escombros o núcleos frágiles, se anticiparía un menor número de núcleos recuperados.
    2. Almacene las muestras a 4 °C durante un máximo de 72 horas después del paso 2.3. en el protocolo de preparación de la biblioteca para combinar el procesamiento de más muestras en paralelo. Para ello, procese dos muestras hasta el paso 2.3 en dos días consecutivos y, al tercer día, procese las 4 muestras juntas desde el paso 3 en adelante en el protocolo de preparación de la biblioteca.
  2. Parámetros de secuenciación: Secuencia en una plataforma de secuenciación con el objetivo de 50.000 lecturas de extremos emparejados por núcleo.
    NOTA: Los datos presentados en este protocolo se secuenciaron en la plataforma NovaSeq 6000, con el objetivo de realizar 50.000 lecturas de extremos emparejados por núcleo.

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Figura 2: Flujo de trabajo del protocolo. Ilustración esquemática del flujo de trabajo en (A) pasos 2 y 3, (B) paso 4 y (C) paso 5 del protocolo. La figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Procesamiento y análisis de datos

NOTA : En este protocolo, se introducen brevemente algunos de los programas informáticos y paquetes de R recomendados para procesar los datos de secuenciación resultantes, centrándose en los pasos posteriores al preprocesamiento inicial (Tabla 3). Este estudio proporciona métricas generales de control de calidad (QC) y un ejemplo de aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) en la Figura 4. Sin embargo, una descripción en profundidad del análisis bioinformático está fuera del alcance de este protocolo. Por lo tanto, los lectores pueden consultar la reciente revisión sobre las mejores prácticas para el análisis de células individuales de Heumos et al.18.

  1. Preprocesamiento de los datos de secuenciación
    1. Mapea las lecturas de núcleos individuales al genoma humano de referencia GRCh38.
    2. Incluya las lecturas de intrones en el recuento.
  2. Realice el control de calidad y el filtrado de los datos utilizando el paquete Seurat R 19.
    1. Calcule una puntuación de complejidad celular dividiendo el número log(10) de genes detectados por el número log(10) de lecturas detectadas.
    2. Represente las métricas de control de calidad más importantes mediante un histograma o un gráfico de violín, incluido el número de genes detectados por núcleo, el porcentaje de lectura mitocondrial y la puntuación de complejidad celular.
    3. Filtre los núcleos con menos de 200 o más de 10.000 genes por núcleo, más del 10% de lecturas mitocondriales y una puntuación de complejidad inferior a 0,8.
  3. Normalice los datos y realice la reducción de la dimensionalidad.
    1. Utilice la función SCTransform de Seurat para normalizar los datos utilizando 2000 características variables.
    2. Agrupe los datos mediante las siguientes funciones del paquete R de Seurat: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters y RunUMAP.
    3. Trace un UMAP para visualizar la agrupación en clústeres de los datos.
  4. Filtre los dobletes pronosticados con el paquete DoubletFinder R 20 y vuelva a agrupar los datos.
  5. Anote los grupos utilizando marcadores genéticos conocidos de los tipos de células que se espera que estén presentes en el tejido (enfoque supervisado) o en función de los 5 genes principales expresados diferencialmente entre los grupos (enfoque no supervisado).
  6. Utilice decontX21para determinar el grado de contaminación del ARN ambiental y para ajustar la matriz de expresión génica para el ARN ambiental.
    1. Incluya la matriz genética en bruto como antecedente.
  7. Guarde el objeto Seurat para explorarlos en el futuro.
    NOTA: El código para el control de calidad y el análisis de agrupamiento está disponible en el archivo complementario 1.
Paquetes de software/R utilizados en el flujo de trabajo de datosSoftware/paquetes alternativosEtapa de procesamiento
CellRanger (Guardabarros)STARsolo, kallistoRecorte, alineación, mapeo
SeuratSingleCellExperiment, CellrangerControl de calidad, análisis y exploración de datos
DoubletFinderscds, scdblFinder, ScrubletDetección de dobletes
DecontXSoupX, CellBenderAjuste del ARN ambiental

Tabla 3: Software/herramientas para el flujo de trabajo de datos.

Resultados

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Este flujo de trabajo fue diseñado para guiar el procesamiento de muestras humanas IMAT congeladas para obtener perfiles de expresión génica con una resolución de un solo núcleo, lo que permite la identificación del tipo de célula. Aquí se presenta una muestra representativa de IMAT de un participante en el estudio SOMMA.

El primer paso de cualquier análisis de los datos de snRNA-seq es evaluar la calidad de los datos para identificar los núcleos de mala calidad, que potencialmente deberían eliminarse del conjunto de datos. Es importante destacar que los pasos de filtrado y los umbrales deben determinarse para el tipo específico de muestra y conjunto de datos que tiene a mano, ya que las métricas comúnmente evaluadas pueden diferir entre tejidos y tipos de células22,23. La Figura 4A proporciona imágenes de algunas de las métricas clave utilizadas para evaluar la calidad de los datos de snRNA-seq generados. El número de genes detectados por núcleo depende de la profundidad de secuenciación y del tipo de célula, pero se esperaría que estuviera por encima de 200 para núcleos de buena calidad18,23. Se encontró que los datos generados utilizando este protocolo están dentro del rango esperado con una mediana de 1134 genes por núcleo, de un total de 4662 núcleos.

Se evalúa el porcentaje de lecturas mitocondriales, ya que un alto grado de contaminación mitocondrial puede surgir de núcleos dañados o ARN ambiental que se adhiere a los núcleos, lo que indica núcleos de mala calidad. En el conjunto de datos aquí presentado, se encontró una mediana del porcentaje de lectura mitocondrial de 2,65, que está muy por debajo del umbral del 5%-20% comúnmente utilizado en la literatura 24,25,26. El porcentaje de lecturas ribosómicas difiere según los tipos de células y los tejidos. Sin embargo, dado que grandes proporciones de genes ribosómicos pueden influir en la agrupación de los datos, se recomienda comprobar el porcentaje de lectura ribosómica y, potencialmente, eliminar los genes ribosómicos o los núcleos con altos niveles de genes ribosómicos del conjunto de datos antes de agruparlos. Los datos generados con este protocolo mostraron un bajo nivel de lecturas ribosómicas con una mediana del 2,46% y un máximo del 16,5%, por lo que no filtramos en función de esta métrica. Por último, se calculó una puntuación de complejidad celular basada en el número log(10) de genes detectados dividido por el número log(10) de lecturas detectadas. Se espera que los núcleos de buena calidad estén por encima de 0,8 y se obtuvo una mediana de 0,92 en la muestra utilizada en este estudio. Sobre la base de estas métricas de control de calidad, se puede decidir qué núcleos filtrar del conjunto de datos. Para el análisis, elegimos filtrar los núcleos con menos de 200 o más de 10.000 genes por núcleo, más del 10% de lecturas mitocondriales y una puntuación de complejidad inferior a 0,8.

Después de la evaluación inicial de la calidad y el paso de filtrado, se puede generar un UMAP para visualizar la agrupación de los núcleos. El agrupamiento se realizó con base en los 2000 genes más variables mediante la transformación de SCT. Los pasos iniciales de agrupamiento se pueden utilizar para verificar si alguna de las características de QC se agrupa, por ejemplo, núcleos con lecturas mitocondriales altas. Además, la información de agrupación es necesaria para algunos métodos de detección de dobletes, incluido DoubletFinder20, que se utilizó en este protocolo. Se utilizó DoubletFinder con una tasa de multiplicación esperada establecida en 4,8%, según lo sugerido por los proveedores de la plataforma basada en gotas. Después de la eliminación del doblete, se estimó el nivel de contaminación ambiental del ARN, que es particularmente común en las preparaciones de un solo núcleo, ya que el ARN se libera del citoplasma tras la lisis celular y se dispensa en las perlas de gel en emulsión (GEM) y se amplifica en los siguientes pasos de preparación de la biblioteca. Por lo tanto, se han desarrollado varias herramientas para corregir el problema inherente de la contaminación ambiental por ARN (ver Tabla 3). Utilizamos el paquete R decontX21, en el que la matriz de fondo en bruto (incluyendo solo gotas vacías) se utiliza para ajustar la matriz de expresión génica, mejorando la firma de expresión génica real.

El agrupamiento y la capacidad de detectar tipos de células poco abundantes dependen del número de núcleos. Este estudio detectó todos los tipos celulares principales esperados en IMAT (Figura 4B) de un total de 3817 núcleos después del filtrado de control de calidad, la eliminación de dobletes y el ajuste del ARN ambiental. Estos incluían células madre, progenitores fibroadipogénicos (FAP) y adipocitos maduros, así como pericitos, células musculares lisas, células inmunitarias, células progenitoras musculares y mionúcleos procedentes de la contaminación de células musculares esqueléticas.

En general, hemos demostrado que este protocolo produce datos de núcleo único de alta resolución que permiten la detección de la anotación del tipo de célula, importante para desentrañar la biología y los orígenes celulares de IMAT.

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Figura 4: Evaluación de la calidad, agrupamiento y anotación del tipo de célula de los datos de secuenciación. (A) Gráficos de violín de métricas esenciales para la evaluación de la muestra y el rendimiento de la secuenciación, incluido el número de genes detectados por núcleo, el porcentaje de lecturas mitocondriales, el porcentaje de lecturas ribosómicas y la complejidad celular medida como el número log(10) de genes detectados dividido por el número log(10) de lecturas detectadas. Los valores medianos de cada métrica se indican en cuadros cerrados. Número total de núcleos: 4662. (B) UMAP que muestra la agrupación de núcleos individuales y el diagrama de puntos correspondiente que muestra la expresión génica relativa de los genes marcadores de tipo celular para cada grupo después del filtrado. Número de núcleos: 3817. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: El código para el control de calidad y el análisis de agrupamiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay varios desafíos inherentes a trabajar con IMAT. Además de su limitada accesibilidad, la producción de material de muestra suele ser muy escasa y la "contaminación" del músculo esquelético es casi imposible de evitar. Para obtener una muestra de la mejor calidad, se debe penetrar en la fascia muscular al insertar la aguja de biopsia (para asegurarse de que no se recolecta tejido adiposo subcutáneo) y eliminar la mayor cantidad posible de tejido muscular mediante la disección de la muestra bajo un microscopio inmediatamente después de la recolección, seguido de un procesamiento posterior para histología, congelación instantánea, etcétera. Este es el primer método para utilizar muestras IMAT recolectadas prospectivamente y diseccionadas del músculo esquelético. Comparativamente, los datos previos de snRNA-seq en IMAT han sido a través de aislamientos de núcleos de una mezcla de biopsias de músculo esquelético con infiltración grasa conocida y no solo el IMAT.

El IMAT es de naturaleza más densa en comparación con los tejidos adiposos subcutáneos, por lo que la pulverización adecuada del tejido durante el aislamiento de los núcleos es esencial para liberarlos de la estructura del tejido. Una pulverización inadecuada puede conducir a un menor rendimiento de núcleos, lo que es desfavorable con una cantidad limitada de tejido. Además, calcular el número correcto de núcleos en la solución de núcleos preparada es un paso crítico para garantizar que haya suficientes (pero no demasiados) núcleos para cargar en el chip para la generación de GEM. Demasiados núcleos, o la presencia de grandes grupos de núcleos o desechos, pueden dar lugar a una obstrucción, lo que afecta a la concentración final de ADNc y, en última instancia, a la salida de secuenciación. Sortear la aglomeración de núcleos y los residuos en la preparación de los núcleos individuales es difícil y se ve afectado por la calidad de la muestra. La aglomeración de núcleos y/o la presencia de residuos pueden reducirse incluyendo un paso de filtrado adicional con el filtro de células de 30 μm.

Es importante procesar las muestras rápidamente para reducir el riesgo de degradación del ARN. Mantener las soluciones en hielo o enfriadas durante todos los pasos posibles de aislamiento de los núcleos, así como la adición de una cantidad suficiente de inhibidores de la ARNasa, puede minimizar la degradación. Debido a la importancia del tiempo de procesamiento de cada muestra, recomendamos ejecutar un máximo de dos muestras a la vez. Además, la solución de los núcleos debe manipularse con cuidado para no hacer que los núcleos sean demasiado frágiles. Los núcleos frágiles son susceptibles de estallar tras la generación de GEM, lo que puede dar lugar a grandes cantidades de ARN ambiental en la muestra. En este protocolo, se excluyó la etapa de filtrado con jeringa (descrita en el protocolo STAR16) para preservar la integridad de los núcleos.

La elección del método de preparación de la biblioteca depende de la pregunta de investigación. Hemos trabajado tanto con un enfoque de núcleos individuales basado en gotas como en nanopozos. El enfoque basado en nanopocillos perfila 1200-1600 núcleos y aproximadamente 3000-6000 genes detectados por núcleo16. Además, este enfoque apoya la transcriptómica de longitud completa, lo que permite la investigación de la variación estructural, los pseudogenes y las variantes de empalme27. En comparación, se pueden perfilar más de 10.000 núcleos utilizando el enfoque basado en gotas, pero a expensas de un menor número de genes detectados por núcleo (2-3 veces menor). Para este protocolo, hemos optado por utilizar una de las plataformas basadas en gotas, ya que el mayor número de núcleos perfilados nos proporciona una mayor capacidad para detectar tipos de células raras con una baja abundancia28.

La principal limitación de snRNA-seq es la pérdida de contenido citosólico, lo que restringe el análisis de expresión a las transcripciones nucleares. El núcleo contiene entre 10 y 100 veces menos ARNm que el de toda la célula29, lo que podría ser motivo de preocupación para descubrir todos los tipos de células de un tejido. Sin embargo, un estudio reciente de Gupta et al. encontró que la transcriptómica nuclear, en comparación con la transcriptómica de células enteras29, detectó poblaciones celulares similares y perfiles de expresión de genes biológicamente relevantes en preadipocitos cultivados y adipocitos maduros. Resultados similares se han encontrado en otros tipos celulares 30,31.

El aislamiento de un solo núcleo tiene sus ventajas a la hora de proporcionar patrones de expresión génica de resolución de una sola célula (sc) de células frágiles incompatibles con scRNA-seq. Además, se pueden utilizar muestras congeladas de biobanco y el aislamiento de los núcleos no requiere la digestión enzimática del tejido, lo que puede inducir una respuesta de estrés en las células, afectando el transcriptoma32. Mediante el uso de snRNA-seq, pudimos perfilar transcripcionalmente los adipocitos y otros tipos de células presentes en IMAT, lo que no sería posible con scRNA-seq debido a que los adipocitos están cargados de lípidos e incompatibles con el enfoque basado en gotas.

Una aplicación importante de snRNA-Seq de IMAT es descifrar la composición celular y las diferencias transcripcionales de IMAT en diferentes estados metabólicos. Además, los conjuntos de datos de snRNA-seq se pueden utilizar para deconvolucinar la secuenciación masiva de ARN en IMAT para evaluar las diferencias de composición celular a mayor escala33. Además, el análisis pseudo-temporal de los datos de snRNA-seq puede servir para identificar trayectorias de maduración celular, lo que es de particular interés en tejidos como IMAT, en los que los orígenes celulares de los adipocitos maduros aún se debaten.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Bryan Bergman, PhD de la Universidad de Colorado, por proporcionar la imagen de la biopsia IMAT en la Figura 1C del estudio MoTrIMAT (R01AG077956). Agradecemos que el Estudio de la Musculatría, la Movilidad y el Envejecimiento haya facilitado la muestra IMAT de la que se muestran los datos en el apartado de resultados representativos. El Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA, por sus siglas en inglés) financió el Estudio del Músculo, la Movilidad y el Envejecimiento (SOMMA; R01AG059416) y sus estudios auxiliares SOMMA AT (R01AG066474) y SOMMA Knee OA (R01AG070647). El apoyo a la infraestructura del estudio fue financiado en parte por los Centros Claude D. Pepper de la Independencia Americana Antigua del NIA en la Universidad de Pittsburgh (P30AG024827) y la Universidad de Wake Forest (P30AG021332) y los Institutos de Ciencias Clínicas y Traslacionales, financiados por el Centro Nacional para el Avance de la Ciencia Traslacional, en la Universidad de Wake Forest (UL1 0TR001420).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,2 y micro; m Filtros de jeringa Corning Millipore Sigma CLS431229
1,7 mL de tubos LoBind de ADN Tubosde baja uniónEppendorf22431021
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100x inhibidor de la proteasaThermo Fisher Scientific78437
10X Separador magnético 10XGenomics 230003
10X Adaptador devórtice 10X
tubos canónicos de 15 mLSarstedt6,25,54,502
2100 Bioanalyzer AgilentG2939BA
50 mL tubos cónicosSarstedt6,25,47,254
CellRangerGenomicsN/A
Chromium iXkit de accesorios 10X GenomicsPN1000323
Chromium iX Controller10X Genomics PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X GenomicsPN1000127
Chromium Next GEM Kit de perlas de gel de 3' de una sola célula v3.1 10X GenomicsPN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.110X GenomicsPN1000130
Countess 3 Contador de células automatizadoThermo Fisher ScientificAMQAX2000Contador de células automatizado
Portaobjetos de la cámara de recuento de células CountessThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderR N/A
DPBS (sin calcio, sin magnesio)Thermo Fisher Scientific14190144
TDTThermo Fisher ScientificR0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns10X Genomics PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE 10X GenómicaPN2000048
Falcon 100 y micro; m Colador de célulasCorning Life Science352360
Falcon 40 µ m Filtro de célulasCorning Life Science352340
Glicerina (glicerol), 50% (v/v) Solución acuosaRicca Chemical Company3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Construction Kit v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30µ m)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient TermocicladorEppendorf6331000017
MgCl2 AmbionAM9530G
Mortero y morteroLogística de atención médica 14075
Reactivo de sondas NucBlue Live ReadyThermo Fisher ScientificR37605
Agua libre de nucleasas (no tratada con DPC)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Albúmina sérica bovina sin ácidos grasos, polvoSigma-Aldrich820024
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Inhibidor de la ARNasa RibolockThermo Fisher ScientificEO0382
SeuratR N/A
SacarosaSigma-AldrichS0389
SUPERasin 20 U/µ LThermo Fisher ScientificAM2695
ThermoMixer CEppendorf 
Homogeneizador de tejidosGlass-Col099C K54
Tampón Tris pH 8.0Thermo Fisher Scientific
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0Gibco15575020
3300025382000015 AM9855G

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).">Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).">Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
  3. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).">Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
  4. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).">Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
  5. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).">Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).
  6. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).">Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
  7. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).">Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
  8. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).">Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  9. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).">Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
  10. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).">Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).
  11. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).">Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).
  12. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).">Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).
  13. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077(2021).">Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077(2021).
  14. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111(2023).">Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111(2023).
  15. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).">Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
  16. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).">Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).
  17. https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022).">10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022).
  18. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).">Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
  19. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).">Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
  20. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).">McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
  21. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57(2020).">Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57(2020).
  22. https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022).">Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022).
  23. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).">Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  24. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).">Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  25. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).">Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  26. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772(2022).">Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772(2022).
  27. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).">Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).
  28. https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf (2018).">CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf (2018).
  29. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).">Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
  30. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).">Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  31. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).">Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  32. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).">Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  33. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).">Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).

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