Imagen y cuantificación de la vasculatura hepática de ratones mediante ecografía Doppler ultrarrápida

Resumen

La ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS) con alta resolución espacial (100 μm) y sensibilidad representa una modalidad de imagen no invasiva adecuada para obtener una visión cualitativa completa de la vasculatura hepática. UFUS también facilita las mediciones cuantitativas de la microvasculatura, con el objetivo de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad vascular.

Resumen

Las imágenes no invasivas in vivo de la vasculatura son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos de la enfermedad en roedores. Para lograr imágenes de alta sensibilidad de la microvasculatura utilizando métodos de ultrasonido Doppler, se prefieren las modalidades de imagen que emplean el concepto de imágenes ultrarrápidas. Al aumentar la velocidad de fotogramas del ecógrafo a miles de fotogramas por segundo, es posible mejorar la sensibilidad del flujo sanguíneo hasta 2 mm/s y obtener información funcional sobre la microcirculación en comparación con una sensibilidad de alrededor de 1 cm/s en los modos Doppler convencionales. Si bien las imágenes de ultrasonido Doppler ultrarrápido (UFUS) se han adoptado en la neurociencia, donde pueden capturar la actividad cerebral a través del acoplamiento neurovascular, presentan mayores desafíos al obtener imágenes de la vasculatura de los órganos abdominales debido a los movimientos más grandes relacionados con la respiración. El hígado, situado anatómicamente debajo del diafragma, es particularmente susceptible al movimiento fuera del plano y al movimiento respiratorio oscilante. Estos artefactos no solo afectan negativamente a las imágenes Doppler, sino que también complican el análisis anatómico de las estructuras vasculares y el cálculo de los parámetros vasculares. Aquí, presentamos un análisis cualitativo y cuantitativo de la vasculatura hepática en ratones mediante UFUS. Identificamos las principales estructuras vasculares anatómicas y proporcionamos ilustraciones gráficas de la anatomía macroscópica hepática, comparándola con una evaluación anatómica en profundidad de la vasculatura hepática basada en lecturas Doppler. Además, hemos desarrollado un protocolo de cuantificación para mediciones robustas del volumen sanguíneo hepático de la microvasculatura a lo largo del tiempo. Para contemplar futuras investigaciones, el análisis vascular cualitativo proporciona una visión general completa y sugiere una terminología estandarizada para los investigadores que trabajan con modelos de ratón de enfermedad hepática. Además, ofrece la oportunidad de aplicar la ecografía como método complementario no invasivo para inspeccionar defectos vasculares hepáticos in vivo y medir las alteraciones microvasculares funcionales en el interior del órgano antes de desentrañar las anomalías de los vasos sanguíneos a nivel de micras mediante tinción ex vivo en secciones de tejido.

Introducción

Los modelos preclínicos de ratón son ampliamente utilizados para estudiar el inicio y la progresión de la enfermedad microvascular hepática ^1,2. El seguimiento longitudinal es ventajoso, ya que las alteraciones de los capilares sanguíneos ocurren en una etapa temprana de la enfermedad, antes de que aparezcan la inflamación y la fibrosis, lo que puede resultar en cirrosis con el tiempo¹. Para investigar la progresión de la enfermedad, es esencial contar con potentes herramientas de imagen para visualizar y medir la función de los vasos sanguíneos in vivo. El ultrasonido Doppler ultrarrápido (UFUS) representa una modalidad adecuada por su bajo costo, portabilidad, simplicidad y capacidad en tiempo real, pero también porque es un procedimiento no invasivo y que ahorra tiempo³. En comparación con la ecografía Doppler convencional, que puede alcanzar una resolución espacial similar pero está restringida a un flujo sanguíneo grande, el UFUS permite la detección de un flujo sanguíneo lento hasta 2 mm/s desde 1 cm/s, lo que permite sondear la contribución de vasos mucho más pequeños⁴. UFUS mejora la sensibilidad, lo que se logra a través de transmisiones de onda plana con un gran campo de visión en una sola insonificación para aumentar la velocidad de fotogramas y, por lo tanto, el número de imágenes de ultrasonido disponibles⁵. El elevado número de muestras temporales mejora la cancelación de la señal procedente del tejido y mejora la detección de los ecos reflejados por los dispersores sanguíneos, aumentando la sensibilidad sin necesidad de agentes de contraste⁶. Al estimar la energía de los ecos del dispersor de sangre a través de la estimación Doppler de potencia, se obtiene una cantidad que es proporcional al volumen de sangre en cada píxel, incluso si los vasos sanguíneos son demasiado pequeños para ser resueltos en la imagen⁷.

El UFUS ofrece una combinación favorable de resolución espacial y temporal, lo que lo convierte en una herramienta adecuada para la evaluación cualitativa de la arquitectura vascular hepática. Si bien el funcionamiento de un escáner de ultrasonido es relativamente sencillo, se requiere una comprensión integral de la anatomía del hígado para navegar a través de la vasculatura hepática de los diferentes lóbulos del hígado en ratones. Estudios recientes se han centrado en describir la anatomía hepática murina y el árbol vascular hepático mediante tomografía microcomputarizada 3D (μ-TC)^8,9. A pesar de que algunas de las diferencias morfológicas entre los hígados humanos y de ratón están bien documentadas¹⁰, la investigación realizada en roedores a menudo adopta terminologías anatómicas relevantes para los humanos, lo que lleva a cierta confusión en el contexto de los animales cuadrúpedos. Incluso una nomenclatura estandarizada reconocida, como Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), carece de suficiente información sobre terminologías consistentes para las estructuras vasculares hepáticas de los roedores¹¹. Más allá del desafío de las estructuras anatómicas mal documentadas en roedores, surgen dificultades aún mayores en la interpretación de las lecturas de ultrasonido, particularmente cuando se anticipa un enfoque reproducible.

La obtención de información funcional no invasiva sobre órganos vivos a través de varias escalas espaciales plantea desafíos para la obtención de imágenes in vivo ³. Las modalidades de imagen hepática de alta gama, como la TC, la resonancia magnética y la angiografía (RMN/ARM), o las imágenes Doppler convencionales con ondas focalizadas, son esenciales para evaluar la progresión de la enfermedad, pero no logran capturar la mayoría de la dinámica del flujo sanguíneo, con la excepción de las imágenes fotoacústicas 12,13,14. El UFUS tiene una alta sensibilidad y puede detectar un flujo sanguíneo lento en vasos pequeños, que no se limitan a un flujo mayor de un centímetro por segundo ^4,15. Recientemente, hemos desarrollado un método de imagen personalizado basado en consideraciones anatómicas utilizando UFUS, que permite la medición fiable del volumen sanguíneo hepático en un modelo de ratón con expansión vascular¹⁶.

En este protocolo, describimos el procedimiento para la obtención de imágenes no invasivas de UFUS en el hígado utilizando una plataforma de ultrasonido disponible comercialmente desarrollada originalmente para imágenes cerebrales funcionales. Para agilizar el proceso y mejorar la recuperación de información, ofrecemos una ilustración completa del hígado de ratón con nomenclatura anatómica y un método completo de análisis. Además, proporcionamos una representación detallada de las lecturas de imágenes adquiridas como referencia, indicando estructuras anatómicas comunes y puntos de referencia para ayudar a la selección del plano dependiente del operador. Además, incluimos una ilustración relevante de los análisis cualitativos y cuantitativos de la vasculatura hepática.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo la legislación europea (Directiva 2010/63/UE) y las directrices del gobierno holandés y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico de la Universidad de Leiden.

1. Preparación del ratón para la obtención de imágenes UFUS (Tiempo ~ 10 min)

1. Preparación de la configuración de imágenes
   1. Centrifugar el gel de transmisión de ultrasonidos en tubos de 50 mL a 100 x g durante 3-5 min para evitar la formación de burbujas de aire.
   2. Encienda la almohadilla térmica y caliéntela hasta 35 °C. Llene el tanque de agua impreso en 3D con agua desionizada.
      NOTA: Las burbujas de agua o las pequeñas partículas presentes en el agua pueden perturbar la medición Doppler.
2. Anestesia del animal
   1. Pesa al animal. Se utilizaron compañeros de camada machos y hembras de 8 a 16 semanas de edad con un peso corporal de 19 a 32 g. Preparar una mezcla anestésica de Ketamina con una dosis de administración de 100 mg/kg y Xilacina 10 mg/kg en NaCl al 0,9%. Prepare la mezcla estéril y fresca todos los días porque la mezcla no es estable y puede perder potencia.
      NOTA: El peso corporal preferido del animal es entre 23-30 g.
   2. Desinfectar el lugar de la inyección, es decir, el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen, con gasa y etanol al 70%. Inyecte 10 μL/g de peso corporal intraperitoneal (ip) con una aguja de 27 G y una jeringa desechable de 1 mL o una jeringa de insulina de 30 G.
   3. Vuelva a colocar al animal en una jaula sobre una almohadilla térmica sin cerrar la tapa de la jaula. Temporizador de inicio.
      NOTA: La anestesia profunda debe durar aproximadamente 40 minutos. Si se desea una sesión de imágenes más larga, considere el uso de anestesia reversible, como mezclas de ketamina 60 mg/kg y medetomidina 0,4 mg/kg en NaCl al 0,9%, seguidas de reversión con inyección subcutánea de atipamezol 1 mg/kg. Se prefiere la anestesia por inyección a la anestesia por inhalación debido a la configuración de las imágenes.
   4. Comprobar la eficacia de la anestesia. Confirme si la anestesia está funcionando pellizcando suavemente las patas traseras después de aproximadamente 5 minutos. Si el animal aún reacciona, espere otros 2-3 minutos para lograr la anestesia completa.
   5. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de la córnea y el traumatismo ocular cuando el animal está profundamente dormido. Vuelva a comprobar los reflejos y comience el procedimiento sólo cuando el animal no muestre ninguna reacción al pellizco.
3. Preparación de la zona de imagen (Figura 1)
   1. Recorte el vientre del animal suavemente con un recortador veterinario mientras se coloca sobre una almohadilla térmica. Realice el recorte muy suavemente sin aplicar compresión en el pecho o el abdomen.
   2. Aplique la crema depilatoria durante no más de 2 minutos.
      ATENCIÓN: No prolongue el tiempo de incubación de la crema depilatoria, ya que puede causar inflamación de la piel. Esto no solo afecta a la calidad de las imágenes, sino que también puede causar molestias al animal.
   3. Retira la crema depilatoria con unos pañuelos de papel y límpiala suavemente con agua tibia.
4. Coloque el animal y la configuración de imágenes para las mediciones Doppler (Figura 2A).
   1. Coloque al animal dorsalmente sobre una almohadilla térmica y asegure suavemente las patas con cinta adhesiva. Hidrata la piel con una pequeña cantidad de agua tibia.
   2. Aplique el gel de transmisión de ultrasonidos centrifugado directamente sobre la piel afeitada con una jeringa de 20 ml.
      NOTA: Las burbujas de aire pueden afectar las imágenes Doppler y causar artefactos.
   3. Coloca el tanque de agua impreso en 3D lleno de agua sobre el animal. Asegúrese de que la altura del tanque de agua sea adecuada para el animal, aproximadamente 1 mm por encima de él, y no apriete al animal.
   4. Compruebe si hay aire entre el gel de transmisión de ultrasonidos y el termoplástico de polimetilpenteno (PMP) del tanque de agua.

2. Operación de la sonda y selección del plano (Tiempo ~ 10 min)

1. Inicie el software y cree una sesión experimental en el sistema. Inicie el software de escaneo.
   NOTA: El software de escaneo está integrado en el sistema.
2. Centre los motores haciendo clic en Sí en la ventana emergente. Se utiliza un sistema motorizado para controlar de forma remota la sonda mediante un software de escaneo. Al centrar los motores, la sonda se moverá automáticamente en tres direcciones, es decir, vertical, lateralmente y girada. Asegúrese de que ningún objeto obstaculice la trayectoria de la sonda para evitar dañar el equipo.
   NOTA: Es crucial centrar los motores; De lo contrario, puede producirse una disfunción del software.
3. Cree una nueva sesión experimental seleccionando Sesión en el menú. Complete la información requerida en el panel de sesión, incluido el proyecto, el asunto, la sesión, el nombre de usuario, el comentario y la etiqueta. Haga clic en Validar.
   NOTA: La sesión debe crearse antes de adquirir o guardar datos de imágenes. La información de la sesión se puede cambiar durante el experimento, pero tenga en cuenta que también alterará el destino para guardar los datos.
4. Coloque la sonda. La sonda ultrasónica lineal de 15 MHz con 128 elementos está conectada al sistema a través de un sistema motorizado compuesto por un módulo de motor de cuatro ejes, es decir, tres direcciones de movimiento de traslación y una de rotación.
   1. Vaya al menú Mover sonda y use el sistema de posicionamiento controlado por computadora para mover la sonda al agua en el tanque de agua impreso en 3D. Utilice los botones de control indicados en la posición de la sonda para mover los motores, definiendo los pasos en mm para el movimiento de traslación (X, Y y Z) o en ° para el movimiento de rotación (R). Para evitar accidentes en la dirección Z, defina el límite Z en Seguridad.
      NOTA: Es crucial que los elementos de la sonda estén en contacto con el agua. Sin embargo, evite mover la sonda completamente en el agua, ya que esto puede dañar el equipo. Si los motores no pueden alcanzar la posición, se muestra una advertencia Fuera del espacio de trabajo.
   2. Guarde las coordenadas como posición de referencia haciendo clic en Establecer inicio. No modifique las traslaciones y rotaciones simultáneamente porque R es relativo a X, Y y Z. Siempre haga clic en Establecer inicio antes de modificar R.
   3. Defina los parámetros de imagen y visualización. Vaya al menú Vista en vivo y haga clic en Reproducir para seleccionar el plano de interés.
      PRECAUCIÓN: Inicie solo una visualización en vivo o una adquisición cuando los elementos de la sonda de ultrasonido estén rodeados por un medio que coincida con la impedancia acústica para garantizar la vida útil del equipo y evitar el sobrecalentamiento.
5. Elija los parámetros de imagen en Ajuste preestablecido.
   1. Cargue una secuencia de ultrasonido ultrasensible Doppler de 10 ms con el botón Cargar secuencia , por ejemplo, 11 ondas planas compuestas (ángulos de -10° a 10°) con un voltaje de imagen de 25 V y una velocidad de fotogramas Doppler de 10 ms.
      NOTA: No es necesario utilizar una secuencia Doppler rápida (por ejemplo, 10 ms) para obtener imágenes y filtrar los movimientos respiratorios del órgano durante el análisis.
   2. Defina la profundidad de imagen entre 1 mm y 50 mm, con una profundidad máxima de imagen de 50 mm. La configuración predeterminada es una profundidad de 9 mm de 1 mm a 10 mm, con la profundidad recomendada entre 2 mm y 12 mm.
      NOTA: Dependiendo del tamaño del animal y del tanque de agua, la profundidad de la imagen se puede adaptar a las necesidades específicas.
6. Seleccione los parámetros de visualización.
   1. Elija Doppler para obtener una imagen de la vasculatura.
      NOTA: La intensidad de píxeles en U.A. representa el volumen sanguíneo y debe compararse solo cuando se usa la misma sonda y secuencia.
   2. Elija Averaging (Promedio) para aplicar el promedio temporal para optimizar la relación señal-ruido.
      NOTA: El promedio temporal de las imágenes aumenta la calidad de la imagen, pero reduce la velocidad de fotogramas. Dependiendo del objetivo, se debe hacer una compensación adecuada.
   3. Elija Compresión de imagen: Logarítmico (alto), Raíz cuadrada (intermedio) o Lineal (bajo). Alternativamente, adapte el rango de contraste de forma automática o manual usando controles deslizantes para las opciones de contraste alto y bajo.
      NOTA: Los datos no se ven afectados por la elección de la compresión de la imagen; solo afecta a la visualización de las imágenes en tiempo real.
   4. Seleccione la escala del mapa de colores de negro a blanco marcando la opción Gris o de negro rojizo a amarillo marcando Caliente.
7. Selección de plano (Figura 2B)
   1. Seleccione el plano de imagen en puntos de referencia anatómicos. Cambie entre la visualización de Doppler y el modo B para familiarizarse con la anatomía de los lóbulos y la vasculatura del hígado.
   2. Detenga la vista en vivo haciendo clic en el icono Detener .
   3. Vaya al menú Mover sonda para navegar por la sonda y seleccione un plano haciendo clic en Establecer inicio para guardar las coordenadas como posición de referencia. Asegúrese de que el árbol vascular esté bien definido y sea visible con la menor señal fuera del plano posible.
   4. Vuelva al menú Vista en vivo y haga clic en el icono Detener .

3. Adquisición de escaneo Doppler (Tiempo ~ 20 min)

1. Inicie una adquisición Doppler con una velocidad de fotogramas de 10 ms.
   1. Vaya al menú fUS 2D para obtener imágenes de las variaciones hemodinámicas a lo largo del tiempo en una posición específica (Figura 3). Para aumentar el contraste, administre un bolo de 50 μL por vía intravenosa (iv) inyectadas microburbujas con una concentración de 2 x 10⁸ microburbujas por mL en la vena de la cola.
   2. En el toque Preset, defina la duración total de la grabación en segundos (30 s). Elija un modo continuo sin pausa entre las imágenes configurando Tiempo entre imágenes en 0 s.
   3. Presione el botón Grabar para iniciar la adquisición 2D. La grabación se puede cancelar pulsando el botón Stop . Los datos pueden perderse cuando la adquisición se interrumpe antes de su finalización.
2. Visualizar y adaptar la grabación adquirida.
   1. Modifique el contraste y el mapa de colores si lo desea en tap Visualización. Vuelva a reproducir la grabación si es necesario desplazándose por los fotogramas con el control deslizante, que se incluye en la función Tiempo.
3. Guarde los datos.
   1. Proporcione un nombre para la grabación adquirida para guardar el archivo en formato .scan en la carpeta de sesión. Al final de cada grabación se propone automáticamente una ventana emergente para guardar los datos. Los datos se guardan automáticamente.
4. Inicie otra adquisición haciendo clic en la pestaña Preajuste y repita desde el paso 3.1.1 en adelante.
5. Retire la configuración de imágenes y cuide al animal.
   1. Vaya al menú Mover sonda para mover verticalmente la sonda fuera del tanque de agua impreso en 3D. Retire el gel ultrasónico y desfije el animal.
   2. Sacrificar al animal cuando el diseño experimental alcanza el punto final; De lo contrario, continúe con los siguientes pasos.
   3. Aplique un poco de crema humectante en el área de la piel afeitada del animal si se pretenden medidas longitudinales.
   4. Vuelva a colocar al animal en la jaula y deje que se despierte de la anestesia bajo una lámpara de calor para evitar la hipotermia. Vigile al animal mientras se recupera.
   5. Vuelva a colocar al animal en el estante de la jaula con ventilación individual cuando vuelva a caminar normalmente. Termine los experimentos con animales de laboratorio antes de analizar el conjunto de datos.

4. Análisis cuantitativo (Tiempo ~ 1 h)

1. Abra el script de análisis gui_analysis.m disponible en el archivo complementario 1.
2. Seleccione el escaneo y establezca los parámetros cuantitativos en la configuración: 10 regiones de interés (ROI) con un tamaño de vóxel de 2 x 2. Elija 40 ms para cada fotograma para realizar la integración Doppler.
3. Dibujar la periferia vascular del órgano; los 10 ROI se preposicionan automáticamente entre arterias claramente visibles y se pueden ajustar manualmente si es necesario (Figura 4A). Cierre el cuadro de diálogo flotante cuando esté satisfecho con el posicionamiento. Asegure una adquisición estable (Figura 4B) para un cálculo robusto del volumen sanguíneo, evitando adquisiciones afectadas por artefactos de movimiento fuerte (Figura 4C).
4. Cuantifique el volumen sanguíneo hepático medio en U.A. del total de 10 ROI estimando automáticamente la media y la desviación estándar de los valores de fotograma tranquilo dentro del registro de 30 s (Figura 4D).
   NOTA: La tabla de datos de intensidades de ROI se puede copiar/pegar directamente en un archivo de hoja de cálculo.
5. Repita el análisis para al menos dos planos adicionales, -0,3 mm y -0,6 mm, en dirección caudal. Cuantificar todos los datos de adquisición antes de realizar el análisis estadístico.
6. Verifique la desviación estándar de las intensidades en toda la imagen y determine un punto de corte como la media general (μ) con 2 desviaciones estándar (2σ) para excluir objetivamente las mediciones susceptibles a artefactos de movimiento (Figura 4E).
   NOTA: La media y la desviación estándar de los valores de fotograma silencioso estimados en toda la imagen se proporcionan en la primera fila de la tabla de datos.
   PRECAUCIÓN: Los artefactos de movimiento impiden una cuantificación robusta y deben identificarse objetivamente en función del análisis de toda la imagen temporal.
7. Tome el promedio de todo el volumen sanguíneo hepático medio cuantificado en 3 planos diferentes en 30 ROI por animal en el paso 4.3 (Figura 4F). Aplique la prueba ROUT del 1% en un software de análisis estadístico para identificar ROI atípicos antes de promediar 30 ROI por animal. Para mejorar la estimación del volumen sanguíneo, registre planos adicionales por animal.
8. Para administrar el tratamiento del vehículo, desinfecte el lugar de la inyección, es decir, el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen, con gasa y etanol al 70%. Inyecte 20 μL de solución salina o DMSO ip con una aguja de 27G y una jeringa desechable de 1 mL o una jeringa de insulina de 30G o administre 100 μL de metilcelulosa (Hidroxipropil) por sonda nasogástrica utilizando una aguja de alimentación reutilizable de 30G con punta redonda. Graficar los datos de 3 cohortes que recibieron solución salina o DMSO por vía ip o administración oral (po) de celulosa (Figura 4G). Realizar análisis de forma ciega sin revelar la afección y/o el tratamiento recibido.
   NOTA: La administración del vehículo no tiene ningún impacto en las mediciones del volumen sanguíneo.

Resultados

Siguiendo el protocolo, se facilita la imagen de la vasculatura hepática a partir de la estandarización de las estructuras anatómicas y la terminología correspondiente (Figura 1). Con el fin de proponer una nomenclatura estandarizada para los investigadores que utilizan modelos hepáticos preclínicos, mostramos esquemáticamente la posición común del hígado en la cavidad abdominal de ratones (Figura 1A), proporcionamos la disposición estructural de los diferentes lóbulos hepáticos (Figura 1B) y especificamos la red vascular arterial (Figura 1C). Equipados con experiencia anatómica, las imágenes de UFUS in vivo se realizaron utilizando un tanque de agua impreso en 3D para reducir los artefactos de movimiento (Figura 2A). La impedancia acústica se corrigió introduciendo la sonda en el agua y aplicando gel de transmisión de ultrasonidos directamente sobre la piel afeitada del animal. Al adoptar esta configuración, la respiración y otros artefactos de movimiento se reducen, ya que la sonda no está en contacto directo con el pecho y el abdomen en movimiento del animal. De esta forma, visualizamos la estructura vascular de los lóbulos derecho e izquierdo, fácilmente accesibles por OVNI debido a su localización superficial (Figura 2B). Otros lóbulos hepáticos, como el lóbulo caudado y el lóbulo cuadrado, están situados más profundamente en el cuerpo, lo que dificulta la identificación anatómica adecuada de la vasculatura hepática mediante UFUS.

Una vez demostrada la importancia de las indicaciones e interpretaciones anatómicas estandarizadas y comúnmente aceptadas de las estructuras vasculares, realizamos múltiples exploraciones Doppler en varios planos para proporcionar una visión completa de la vasculatura hepática obtenida por UFUS con contraste en ratones (Figura 3). Delineamos la red arterial hepática de los lóbulos hepáticos individuales, es decir, lóbulos lateral izquierdo (LL), medial izquierdo (LM), lateral derecho (RL) y medial derecho (RM). Además, se etiquetan las arterias principales, como la aorta abdominal (AA), la arteria hepática (HA), la arteria hepática lateral izquierda (LLHA) y la arteria hepática medial derecha (RMHA). Es importante tener en cuenta que los lóbulos del hígado pueden estar ligeramente colocados de manera diferente dependiendo de la ubicación y el movimiento peristáltico del intestino delgado (MS), así como del estado de llenado del estómago (S). Esta visión general mejorada con contraste de toda la vasculatura hepática del ratón proporciona un atlas vascular completo para la obtención de imágenes hepáticas in vivo mediante UFUS.

Una selección precisa de los planos anatómicos es crucial para obtener una lectura cuantitativa derivada de un lóbulo hepático. Se pueden lograr mediciones sólidas del volumen sanguíneo seleccionando manualmente 10 regiones de interés (ROI) por plano (Figura 4A). Para una cuantificación fiable del volumen sanguíneo de la microcirculación, se necesita una adquisición estable con baja variación en las intensidades medias de la imagen. Esto se determina en función del valor medio de la imagen (MIV) de toda la imagen a lo largo del tiempo (Figura 4B), en contraste con una grabación que es susceptible a artefactos de movimiento significativos (Figura 4C). Para manejar los artefactos de movimiento, se utilizó la selección automática de MIV bajo para la cuantificación confiable de las mediciones del volumen sanguíneo hepático (Figura 4D) mediante el trazado de la desviación estándar de todo el MIV bajo temporal de una imagen completa (Figura 4E). Las exploraciones Doppler de múltiples planos por animal muestran una intra e intervariabilidad aceptable dentro y entre ratones de 3 cohortes diferentes después de un tratamiento atípico con 30 ROI por animal con la prueba ROUT del 1% (Figura 4F). Para mejorar la estimación del volumen sanguíneo por animal, se recomienda registrar planos adicionales o aumentar el número de ROI seleccionados por avión. Además, las lecturas del volumen sanguíneo se pueden utilizar para controlar el tratamiento farmacológico, centrándose específicamente en las microvasculaturas. Al administrar el vehículo a través de dos vías de administración, demostramos que no hay efecto sobre las mediciones del volumen sanguíneo hepático (Figura 4G). Estos resultados indican que la deleción génica o la administración del tratamiento no se ven afectadas por la administración de vehículos, lo que garantiza un diseño experimental robusto. En general, se proporciona un protocolo cuantitativo objetivo y reproducible para futuras investigaciones que exploren los defectos vasculares hepáticos en varios modelos de ratón.

Figura 1: Anatomía del hígado murino. (A) Vista general esquemática de la posición del hígado en la cavidad abdominal bajo el diafragma del ratón. (B) Descripción esquemática del hígado murino con cuatro lóbulos hepáticos, es decir, lóbulo izquierdo, cuadrado, caudado y derecho, y la tríada portal que consta de la vena porta, la arteria hepática y el conducto biliar. (C) Ilustración esquemática de la red arterial de la vasculatura háptica. Identificación de arterias hepáticas (HA) y ramas (rama) con nomenclatura latina proporcionada. Abreviatura: HA = Arteria hepática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes de ultrasonido Doppler ultrarrápido (UFUS) de la vasculatura hepática en ratones. (A) Resumen esquemático de la configuración experimental para imágenes in vivo no invasivas. (B) Ilustraciones esquemáticas de la dirección de la imagen y los representantes asociados del lóbulo medial derecho e izquierdo, así como del lóbulo lateral izquierdo, fotografiadas por UFUS. Abreviatura: AA = Abdominales aorta, LLL = Lóbulo lateral izquierdo, love my life = Lóbulo medial izquierdo, RML = Lóbulo medial derecho. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS) representativa con contraste de la vasculatura hepática murina. Una visión general de toda la vasculatura hepática de un ratón adulto en 3 posiciones, es decir, lateral derecho, medial y lateral izquierdo, en 4 planos desde el cráneo hasta la caudal. La referencia se sitúa directamente debajo del diafragma en la imagen medial y 1 cm lateral a la derecha y a la izquierda, con los mismos planos en dirección caudal. Abreviatura: AA = Aorta abdominal, HA = Arteria hepática, LLL = Lóbulo lateral izquierdo, LLHA = Arteria hepática lateral izquierda, love my life = Lóbulo medial izquierdo, RLL = Lóbulo lateral derecho, RMHA = Arteria hepática medial derecha, RML = Lóbulo medial derecho, SI = Intestino delgado, S = Estómago. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Medición cuantitativa del volumen sanguíneo hepático mediante ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS). (A) Representantes del lóbulo medial (ML) de ratones control adultos C57BL/6 de tipo salvaje en el plano 1 seleccionado bajo el diafragma, correspondiente a 0 mm, el plano 2 a -0,3 mm y el plano 3 a -0,6 mm con una selección de 10 regiones de interés (ROI). Barra de escala 1 mm. Ilustración de Doppler de potencia de 30s con (B) adquisición estable (gris) y (C) movimiento tisular (rojo) basado en los valores medios de la imagen en unidades arbitrarias (U.A.) de toda la imagen para la evaluación cuantitativa. (D) Reconocimiento automatizado de bajas intensidades (U.A.) para la medición cuantitativa del volumen sanguíneo a lo largo del tiempo. (E) Desviación estándar (desviación estándar) de intensidades bajas trazadas para identificar adquisiciones inestables (rojo) causadas por artefactos de movimiento indicados por un corte de la media general (μ) del número (N) de animales de 3 cohortes con 2 SD (2σ) evaluación de la desviación estándar (SD) de bajas intensidades (U.A.) en condición fisiológica (gris) en ratones control adultos C57BL/6 de tipo salvaje. (F) La cuantificación de los cambios en el volumen sanguíneo medidos in vivo a lo largo del tiempo con un promedio de 3 planos, es decir, 30 ROI en total por animal, se representan como intensidad de píxeles (U.A.). Detección de valores atípicos mediante la prueba ROUT 1%. (G) No hay diferencia entre el tipo de vehículo de reparto y la ruta de administración. La cohorte 1 (n = 6) recibió una inyección intraperitoneal (ip) de solución salina, la cohorte 2 (n = 3) inyección ip de DMSO y la cohorte 3 (n = 6) administración oral (po) de celulosa. ANOVA de un factor con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, ns P > 0,05. Abreviatura: A.U. = Unidades arbitrarias, DMSO = Dimetilsulfóxido, ip = Intraperitoneal, po = Administración oral, ROI = Región de interés, St. Desviación = Desviación estándar, UFUS = Ultrasonido Doppler ultrarrápido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo Suplementario 1: Ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS) de mediciones de volumen sanguíneo hepático. Script gui_analysis.m proporciona una interfaz gráfica para el posicionamiento automático de la región de interés (ROI) para las mediciones del volumen sanguíneo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este protocolo, demostramos cómo realizar imágenes UFUS no invasivas de la vasculatura hepática del ratón. Presentamos una descripción detallada del procedimiento de imagen, que abarca el manejo del animal, el funcionamiento del escáner de ultrasonido y el análisis de datos para calcular los cambios en el volumen sanguíneo in vivo. Para facilitar la interpretación de los datos de ultrasonido, proporcionamos una visión general completa de las estructuras anatómicas que pueden ser visualizadas claramente por UFUS. Además, describimos un procedimiento de cuantificación estandarizado para mediciones robustas de parámetros vasculares. Es posible lograr una resolución adecuada sin el uso de un agente de contraste, lo que permite una evaluación cuantitativa segura y sencilla del volumen sanguíneo hepático de la microcirculación. Hacemos hincapié en el uso de nomenclatura anatómica estandarizada para evitar confusiones y malas interpretaciones, particularmente cuando se evalúan las mediciones cuantitativas de la microvasculatura.

Las imágenes OVNI de la vasculatura murina han sido reportadas previamente, principalmente en el campo de la neurociencia⁷. Las imágenes cerebrales no se ven afectadas negativamente por los artefactos de movimiento, a diferencia del hígado, que es muy susceptible al movimiento respiratorio. Debido a su posición anatómica bajo el diafragma, la depilación en la región abdominal debe realizarse con mucha suavidad para evitar introducir una respiración irregular minimizando las fuerzas físicas sobre la región del tórax y el abdomen. Además, lograr un grado adecuado de anestesia es esencial para garantizar una respiración oscilante regular, un factor que puede corregirse con relativa facilidad en los pasos posteriores al procesamiento. La sensibilidad de UFUS se ha mejorado aquí mediante la aplicación de un filtro de descomposición de valores singulares (SVD) para eliminar los artefactos de movimiento⁶ y mediante una mayor censura de los fotogramas de alto movimiento. Las películas Power Doppler de alta velocidad de fotogramas se adquieren aquí a 10 ms para permitirnos visualizar y medir aún más el efecto del movimiento de la respiración en fotogramas que generaron picos de alto valor debido a artefactos de movimiento. La frecuencia respiratoria podría identificarse a partir del pico en la transformada rápida de Fourier de la señal de imagen promedio, y se pueden descartar los marcos máximos correspondientes al alto movimiento del órgano.

Las imágenes Doppler de ultrasonido reproducibles dentro de un solo animal a lo largo del tiempo, así como entre animales de diferentes pesos corporales, aún pueden enfrentar varias limitaciones. En primer lugar, la posición del hígado puede verse influida por factores como un estómago muy lleno y el movimiento peristáltico del intestino. Esta influencia es particularmente pronunciada cuando se selecciona el lóbulo hepático lateral izquierdo como referencia. Por lo tanto, recomendamos elegir el lóbulo lateral izquierdo solo en animales más grandes y preferir el lóbulo medial derecho o izquierdo en animales más pequeños. En segundo lugar, pueden producirse movimientos respiratorios pesados y no oscilantes en animales angustiados, lo que da lugar a artefactos de movimiento que son difíciles de corregir y, en consecuencia, no pueden utilizarse para el cálculo del volumen sanguíneo. Por lo tanto, es crucial una elección adecuada de la anestesia, junto con una dosis adaptada al peso corporal. Por último, el límite de resolución restringe la visualización de la microvasculatura hepática, es decir, se pueden visualizar vasos sanguíneos con diámetros que van hasta 100 mm³.

Recientemente se propuso el uso de agentes de contraste para obtener una imagen detallada de la vasculatura del ratón mediante el seguimiento de microburbujas. Este enfoque puede lograr una alta resolución espacial y proporcionar mediciones cuantitativas de la velocidad de la sangre¹⁷. Sin embargo, el seguimiento de las microburbujas sigue siendo un gran desafío para mover los órganos internos, especialmente cuando se adquieren en 2D.

Aquí, demostramos que las mediciones estables del volumen sanguíneo hepático obtenidas por Doppler ultrarrápido podrían adquirirse en ratones control de tres cohortes que recibieron diferentes vehículos administrados por inyecciones IP o sonda oral. Recientemente, estas mediciones del volumen sanguíneo se utilizaron con éxito en un modelo de ratón con enfermedad hepática¹⁶. Para elaborar, la expansión vascular se detectó a nivel microscópico electrónico y se confirmó mediante mediciones cuantitativas utilizando UFUS. Este estudio enfatizó la sensibilidad de la evaluación in vivo para investigar defectos vasculares a nivel funcional y cuantitativo, incluso con una angioarquitectura hepática preservada, lo cual es prometedor para el diagnóstico clínico y el seguimiento.

En resumen, este protocolo sirve como guía para estudios cualitativos y cuantitativos no invasivos de la vasculatura hepática en ratones. También se puede emplear para el seguimiento longitudinal debido a su procedimiento no invasivo y sencillo. Además, tiene el potencial de proporcionar evaluaciones funcionales de los vasos sanguíneos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(Hidroxipropil)metilcelulosa HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0.5% HPMC
Centrífuga ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Tubos de centrífuga 50 mL cónico Polipropileno estéril	Tubos CELLSTAR	227 261
Puntas de algodón	Meditip Clean	G80215
Agua desionizada	en casa
Crema depilatoria	cerca de la
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	estéril
Absoluto de etanol	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Aguja de alimentación, reutilizable	FST Fine Science Tools	18064-20
Pinzas con punta fina Pinza Dumont #5	FST Fine Science Tools	11252-00
Almohadillas de gasa 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
Prisma GraphPad	GraphPad Software, Inc	Versión 9
Script de análisis GUI	Inserm	gui_analysis.m	necesita un escaneo Doppler de 10 ms
Almohadilla térmica 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Jeringa de insulina 30G 0,30 x 8 mm, 0,3 mL y 0,5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamina Anesketina	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH Limpiador de baja pelusa	ULINE	S-8115
Cinta de laboratorio 19 mm x 50 m x 0,125 mm	Stokvis	M451
Software MATLAB	MathWorks Versión	R2022b
Crema hidratante	cercana a la
Aguja amarilla 30G 0,3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Pomada oftálmica Oculentum Simplex	Añadido Pharma 220201
Pañuelos de papel	casa
Marcador de laboratorio permanente	VWR	52877-310
Solución salina fisiológica (NaCl 0,9%)	FRESENIUS KABI	B102986	estéril
Contenedor desechable para objetos punzantes Medical Dispo 2.5 L	APmedical	UN3291
Tubo estéril con cierre seguro de 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086
Jeringa 1 mL	BD Plastipak	303172
Jeringa 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
	West Bend	40053
Recortadora	Exacta Aesculap	GT416
Ultrarrápido plataforma de ultrasonido	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus Un prototipo	con una secuencia de 10ms
Gel de transmisión de ultrasonidos Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Tanque de agua impreso en 3D 10 x 10 x 1,5 cm polimetilpenteno (PMP) 0,125 mm	GoodFellow Cambridge limitado	ME311100/2	archivo CAD a pedido
Xilacina Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL