Este estudio describe un protocolo combinado de imágenes de resonancia magnética (IRM) y ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad, utilizando ratas vivas con cateterismo de venas yugulares para monitorear la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB).
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Artículo de método
Monitorización de la apertura de la barrera hematoencefálica en ratas con un sistema de ultrasonido preclínico focalizado
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Resumen
Resumen
El cerebro tiene una barrera sanguínea semipermeable altamente selectiva, denominada barrera hematoencefálica (BBB), que impide la entrega de agentes macromoleculares terapéuticos al cerebro. La integración de la ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad guiado por RM con la preinyección de microburbujas es una técnica prometedora para la modulación no invasiva y no tóxica de la BBB. La resonancia magnética puede ofrecer un contraste superior de los tejidos blandos y diversas evaluaciones cuantitativas, como la permeabilidad vascular, la perfusión y la distribución espacio-temporal de los agentes de contraste de la resonancia magnética. En particular, se ha demostrado que las técnicas de resonancia magnética con contraste con contraste a base de gadolinio son el estándar de oro para detectar aberturas de BHE. Este estudio describe una metodología integral que involucra protocolos de resonancia magnética y procedimientos con animales para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata. El modelo de rata proporciona el beneficio adicional de la utilización del catéter de vena yugular, lo que facilita la administración rápida de medicamentos. Un transductor FUS preclínico guiado estereotácticamente facilita el refinamiento y la simplificación de los procedimientos con animales y los protocolos de resonancia magnética. Los métodos resultantes se caracterizan por su reproducibilidad y simplicidad, eliminando la necesidad de conocimientos quirúrgicos especializados. Esta investigación pretende contribuir a la optimización de los procedimientos preclínicos con modelos de ratas y fomentar una mayor investigación sobre la modulación de la BHE para mejorar las intervenciones terapéuticas en los trastornos neurológicos.
Introducción
La BBB regula el movimiento de iones, moléculas y células entre los vasos sanguíneos y los tejidos cerebrales1. Esta función permite el mantenimiento de la función neuronal y la salud, al tiempo que evita la entrega de agentes macromoleculares terapéuticos a los tejidos cerebrales. La permeabilidad limitada de la BBB puede resultar en una disminución de la eficacia y efectividad de los tratamientos para tumores cerebrales y enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Alzheimer2. Por lo tanto, se han investigado varios enfoques, como la administración mejorada por convección, las inyecciones intracraneales directas, la disrupción osmótica y el diseño mejorado de fármacos, para evitar la BBB para la administración controlada de agentes terapéuticos3,4,5.
Sin embargo, estos enfoques tienen limitaciones intrínsecas como la invasividad, el riesgo de infección, el riesgo de hemorragia, la heterogeneidad y el rápido flujo de fármacos. El ultrasonido focalizado pulsado (FUS) de baja intensidad con inyección de microburbujas es una técnica no invasiva prometedora que permite la disrupción localizada y reversible de la BBB. Los efectos mecánicos de los ultrasonidos junto con las microburbujas pueden alterar transitoriamente la permeabilidad de la BBB (es decir, la apertura de la BBB)6,7. Para futuros avances en las aplicaciones de tratamiento que utilizan la apertura de BBB, los experimentos in vivo con animales pequeños son esenciales.
En este estudio, introdujimos protocolos de resonancia magnética y procedimientos con animales para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata. El protocolo incluyó un modelo de rata con un catéter de vena yugular canulado por una organización comercial (ver Tabla de Materiales). Un modelo de cateterismo de venas yugulares en ratas tiene los beneficios potenciales de la administración rápida de medicamentos, las pruebas de monitoreo hemodinámico y el cateterismo estable. La apertura de la BHE se logró utilizando un sistema FUS preclínico. Diseñado específicamente para la apertura de BBB en modelos de animales pequeños como ratas y ratones, este sistema incorpora componentes esenciales, como un sistema de sobremesa, una computadora de control, un transductor, un desgasificador de agua y los accesorios complementarios. El uso de este sistema FUS preclínico guiado estereotácticamente no solo mejora la precisión, sino que también agiliza los procedimientos con animales y los protocolos de resonancia magnética, lo que contribuye a la reproducibilidad y simplicidad del protocolo experimental general.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco (UCSF). En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (200-250 g). Las ratas fueron alojadas y cuidadas de acuerdo con las Pautas de la Oficina de Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Nacionales de Salud en ratones y ratas. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación animal
NOTA: Para los procedimientos internos, los animales se transportaron a la sala de preparación y los procedimientos se llevaron a cabo de la siguiente manera:
- Coloque las ratas individualmente en una cámara de Lucite y exponga isoflurano (2%-3%) mezclado con oxígeno extraído de un tanque de oxígeno medicinal hasta que estén inconscientes (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
NOTA: La anestesia con isoflurano permite la implementación de un protocolo de resonancia magnética a largo plazo. - Retire las ratas de la cámara y afeite el vello de las áreas anterior y posterior del cuello con una crema depilatoria (depilatoria).
- Aplique un ungüento lubricante en los ojos.
- Coloque la nariz en el cono de la nariz para mantener la anestesia con respiración espontánea (vaporizador de isoflurano entre 2%-2,5%, medidor de flujo de oxígeno a 1-1,5 L/min).
- Coloque la rata anestesiada en una mesa quirúrgica caliente y confirme con un pellizco en el dedo del pie.
NOTA: El protocolo de resonancia magnética incluía secuencias mejoradas con contraste, como imágenes de eco de gradiente ponderadas en T1 e imágenes de eco de espín ponderadas en T2. Estas secuencias se llevaron a cabo antes y después de la inyección de agentes de contraste basados en gadolinio (GAD) para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB). Esto implica la administración de agentes de contraste GAD mientras la rata está en un escáner de resonancia magnética7. Para facilitar este proceso, se utilizó un tubo de catéter que se extiende desde el catéter canulado en la rata. La extensión incluyó un conector de catéter y un tubo de polietileno de 30 cm. Para asegurar la permeabilidad y evitar fugas, el tubo de extensión se enjuagó con glicerol heparinizado (250 UI de heparina/1 mL de glicerol).
2. Sistema de ultrasonido focalizado guiado estereotácticamente
NOTA: Los animales fueron transferidos y colocados en una mesa en un sistema FUS estereotáctico. La nariz de la rata se colocó en el cono de la nariz para mantener la anestesia. El sistema FUS consta de un generador de funciones, un amplificador de RF y un osciloscopio. Antes de configurar el transductor, nos aseguramos de la correcta conexión de todos los dispositivos con el sistema. La configuración del transductor se completó mediante los siguientes pasos:
- Coloque un puntero afilado en la posición del Bregma en el cráneo y guarde la posición. La posición de Bregma se puede identificar señalando la ubicación de 9.0 mm anterior a Lambda en la línea media8. La Lambda se puede encontrar en el centro de la línea entre los tímpanos bilaterales9.
- Coloque gel de ultrasonido en la cabeza de la rata, la bolsa de acoplamiento de agua y el transductor (frecuencia de 1 MHz). Asegúrese de que no haya burbujas de aire entre la piel de la rata, la bolsa de acoplamiento de agua y el transductor.
- Conecte un cable BNC coaxial del transductor a la entrada del módulo del sistema FUS.
- En un ordenador de control) Haga clic en cargar para ver imágenes de ratas preregistradas; Se eligen una serie de puntos focales y presión acústica.
- En un ordenador de control) Haga clic en la prueba de movimiento en el módulo de tratamiento para asegurarse de que el transductor pueda cambiar entre puntos dentro de un período de ráfaga.
- Configure los parámetros de sonicación descritos en el paso 3.
3. Infusión de microburbujas y sonicación
- Activar la microburbuja.
NOTA: La microburbuja utilizada en este estudio se caracterizó por un diámetro de 1,7 μm y una concentración de 0,2 × 109 partículas por mililitro10. El vial de microburbujas se activó en base a las instrucciones de prescripción proporcionadas por el proveedor y un informe publicado anteriormente11.- Prepare una jeringa de 5 mL con punta Luer Lock y rellénela con 5 mL de inyección de cloruro de sodio al 0,9% sin aditivos.
- Retire la tapa verde y conecte la jeringa a la clavija dispensadora ventilada (consulte la Tabla de materiales) enroscándola en el sentido de las agujas del reloj.
- Retire la protección de la clavija y colóquela en el centro del tapón de goma del vial. Presione firmemente hasta que la punta esté completamente insertada en el tapón.
- Vacíe toda la jeringa de 5 ml en el vial empujando la varilla del émbolo.
- Agite el vial enérgicamente durante 20 s para mezclar todo el contenido. Un líquido blanco y lechoso consistente mostrará que se han formado microesferas lipídicas de hexafluoruro de azufre.
- Para obtener la dosis requerida, invierta la jeringa y extraiga lentamente el volumen previsto de la suspensión en una jeringa de 5 ml.
- Utilice una bomba de infusión.
NOTA: Se utilizó el enfoque de infusión12 para administrar microburbujas a las ratas utilizando una bomba de jeringa. Se conectó una jeringa que contenía microburbujas a un conector de catéter insertado en la rata. Las microburbujas se transfirieron a través de tubos de polietileno y el caudal de la bomba de infusión se ajustó a 0,66 mL/min. Esta velocidad de infusión permite la inyección de 2 mL de microburbujas de una jeringa de 3 mL durante 3 min. La infusión comenzó antes de la sonicación durante 1 minuto y continuó durante todo el período de sonicación de 2 min. - Realizar sonicación.
NOTA: En este estudio, se eligieron pulsos FUS con los siguientes parámetros: (1) Región diana: hipocampo izquierdo; (2) Número de manchas: 6 para cubrir el hipocampo en el cerebro; (3) Longitud de ráfaga: 10 ms; (4) Período de ráfaga: 1200 ms; (5) Presión acústica: 0,65 MPa; (6) "Modo ráfaga" en el menú del modo de sonicación en el sistema FUS; (7) Tiempo de sonicación: 120 s.
4. Procedimiento de resonancia magnética con un escáner preclínico 3T
- Después de la sonicación, transfiera los animales a una mesa en un escáner preclínico 3T libre de criógenos.
- Coloca a las ratas en posición prona. Mantenga la temperatura de la almohadilla térmica en el escáner y controle la frecuencia respiratoria mediante un sensor de almohada neumática. Realizar el protocolo de resonancia magnética para evaluar varios tipos de imágenes de resonancia magnética (Tabla 1).
- Incluir otras técnicas de imagen cuantitativa, como la imagen ponderada por difusión (DWI), el mapeo T2*, el mapeo T1 y la resonancia magnética con contraste dinámico (DCE), además de la resonancia magnética con contraste, para demostrar su potencial practicidad para diversos estudios de imagen. Consulte la Tabla 1 para conocer los protocolos de resonancia magnética utilizados en este estudio.
- Inyecte agentes de contraste de resonancia magnética basados en GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) después de la secuencia de eco de gradiente de resonancia magnética ponderada en T1 y adquiera imágenes posteriores al GAD
NOTA: Para una rata de 200 g, inyectamos 200 μL del agente de contraste para RMN y lo seguimos con una solución salina de 200 μL para enjuagar el tubo.
5. Examen macroscópico del cerebro de rata
NOTA: Después de la resonancia magnética, se inyectaron 2 mL de solución azul de Evans (2% diluido con solución salina tamponada con fosfato) y se dejó reposar a la rata durante al menos 30 minutos para permitir que la solución se extendiera y circulara por todo el cuerpo. Posteriormente, las ratas fueron sacrificadas con una sobredosis de isoflurano (5%) para el examen macroscópico del cerebro (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Para confirmar la eutanasia, se requirió un puñetazo en los dedos de los pies y se observó que el animal cesaba la respiración durante al menos 1 minuto. Se realizó el procedimiento de perfusión, seguido de un examen del cerebro de rata. El procedimiento de perfusión se resume de la siguiente manera:
- Realizar una toracotomía con una tijera quirúrgica para exponer los órganos del tórax y visualizar la región cardíaca.
- Incisión (~5 mm) en la aurícula derecha.
- Introducir solución salina en el ventrículo izquierdo con fines de perfusión.
- Abra el hueso del cráneo con unas tijeras quirúrgicas para develar y presentar el cerebro.
NOTA: La perfusión adecuada debe dar como resultado una apariencia uniformemente brillante del cerebro, mientras que las áreas azules persistentes indican una fuga de albúmina asociada a la BBB, según lo detectado por el azul de Evans.
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Resultados
Este estudio presenta un protocolo preclínico para monitorear la apertura de la BHE en un modelo de rata utilizando un sistema FUS comercial. El sistema FUS se instaló sobre una mesa o un carro grande (Figura 1). Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano mezclado con oxígeno mediante un cono nasal en el marco con el soporte del transductor. Se insertó un hidrófono que resuena a 500 kHz para detectar la cavitación acústica dentro del transductor FUS con una frecuencia resonante de 1,0 MHz....
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Discusión
Se ha desarrollado un protocolo y un procedimiento animal utilizando un modelo de rata de cateterismo de la vena yugular para estudios de apertura de BHE. Si bien existen numerosos protocolos preclínicos, este protocolo incorpora un sistema FUS disponible comercialmente y un modelo de rata, lo que minimiza los procedimientos de preparación de animales y, por lo tanto, garantiza la reproducibilidad experimental.
En este protocolo, la selección de microburbujas se basó en su estabilidad y almace...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue parcialmente apoyado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) K99DE032397, la Subvención de Semillas del Departamento de UCSF (No. 7504831), la subvención RAP de UCSF (PI: Kazim Narsinh, MD) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, GA 3535/1-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 1 mL | BD plastipak | ||
| 20 mL, Cloruro de Sodio 0.9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| Jeringa de 3 mL BD | plastipak | ||
| Jeringa de 5 mL | BD plastipak | ||
| Aguja roma, 21 G | Tecnologías de infusión SAI | B21-50 | |
| Conector de catéter, 21 G | Infusión SAI tecnologías | CC-25-25 | |
| Solución de bloqueo de catéter | Tecnologías de infusión SAI | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glicerol |
| Evans | Blue Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israel | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE Vaporizador de isoflurano | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Bomba de jeringa | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurano USP | Vet uno | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| ratas macho Sprague-Dawley (200– 250 g) | Aguja de Charles River Laboratories | ||
| , 18 G | BD Precisionglide | ||
| Solución salina tamponada con fosfato | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Tubo de polietileno | BD Intramedic | ||
| preclínico 3T libre de criógenos Bruker Biospin scanner | Ratón Bruker | Biospec3T | |
| con cateterismo de venas yugulares | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 transductor de ultrasonido focalizado | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 sistema de ultrasonido focalizado de sobremesa | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, EE. UU. | ||
| pasador dispensador ventilado | B Braun | 4550560 |
Referencias
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