La tomografía por emisión de micropositrones (PET) y la microtomografía computarizada (TC) son herramientas de investigación poderosas e ideales para seguir la progresión de la calcificación cardiovascular. Debido a su naturaleza no invasiva, se pueden obtener imágenes de pequeños animales de investigación en múltiples puntos de tiempo. El reto radica en la cuantificación precisa de la calcificación cardiovascular. Aquí, proporcionamos un protocolo, utilizando imágenes de las etapas posteriores de la enfermedad como plantilla, para cuantificar con precisión la progresión de la calcificación cardiovascular en estudios longitudinales. El protocolo implica 1) la alineación del área del tórax en múltiples imágenes del mismo animal durante un estudio longitudinal como primer paso, 2) la definición de una región de interés (ROI) situada dentro del corazón y la aorta en el sitio de los depósitos de calcio más grandes que se hacen evidentes en imágenes posteriores, y 3) segmentación y cuantificación simultáneas de los depósitos de calcio en todas las imágenes adquiridas durante el estudio longitudinal. Este método simplificado mejora la precisión del análisis de imágenes en el seguimiento de la progresión de la calcificación cardiovascular al mejorar la precisión de la definición del ROI y reducir la variabilidad asociada con las técnicas anteriores que analizan las exploraciones individuales de forma independiente.