Artículo de método

Modelado in vitro de la deposición de grasa en la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 de julio de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe el uso de células HepG2 inducidas por ácido oleico como modelo para la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prevalencia de la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) ha aumentado debido a los cambios en los patrones económicos y de estilo de vida, lo que ha provocado importantes problemas de salud. En informes anteriores se ha estudiado el establecimiento de modelos animales y celulares para MASLD, destacando las diferencias entre ellos. En este estudio, se creó un modelo celular mediante la inducción de la acumulación de grasa en MASLD. Las células HepG2 se estimularon con el ácido graso insaturado ácido oleico a varias concentraciones (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) para emular MASLD. La eficacia del modelo se evaluó mediante ensayos del kit de recuento de células-8, tinción con Oil Red O y análisis del contenido de lípidos. Este estudio tuvo como objetivo crear un modelo celular fácil de operar para las células MASLD. Los resultados de los ensayos del kit de recuento de células 8 mostraron que la supervivencia de las células HepG2 dependía de la concentración de ácido oleico, con un IG50 de 1,875 mM. La viabilidad celular en los grupos de 0,5 mM y 1 mM fue significativamente menor que en el grupo control (P < 0,05). Además, la tinción de Oil Red O y el análisis del contenido de lípidos examinaron la deposición de grasa a diferentes concentraciones de ácido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) en células HepG2. El contenido de lípidos de los grupos de 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM fue significativamente mayor que el del grupo control (P < 0,05). Además, los niveles de triglicéridos en los grupos de OA fueron significativamente más altos que en el grupo control (P < 0,05).

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) abarca una variedad de afecciones, que incluyen esteatosis simple, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis y carcinoma hepatocelular 1,2,3,4,5,6, todas atribuidas a factores distintos al consumo de alcohol7. La MASLD es la enfermedad hepática más prevalente causada por lesión metabólica hepática, afectando a casi una cuarta parte de la población mundial 8,9,10,11,12. Si bien aún no se ha dilucidado la patogenia precisa de MASLD, varias teorías intentan explicar su desarrollo. Una noción predominante sugiere un alejamiento de la teoría clásica de "dos golpes" hacia un modelo de "múltiples golpes"1. Un elemento central de estas hipótesis es el papel de la resistencia a la insulina, que se cree que es fundamental en la patogénesis de MASLD13. Las investigaciones indican que la resistencia a la insulina en los hepatocitos conduce a un aumento de los niveles de ácidos grasos libres, formando posteriormente triglicéridos almacenados en el hígado14,15.

Los investigadores han utilizado modelos in vivo e in vitro para simular la deposición de grasa en MASLD; Sin embargo, replicar completamente su mecanismo patológico sigue siendo un desafío. A pesar de esta limitación, estos modelos han sido fundamentales en el estudio de posibles dianas terapéuticas para MASLD. Sin embargo, el desarrollo de un modelo estable de MASLD es crucial. Si bien los modelos animales son efectivos, requieren mucho tiempo y son costosos, lo que pone de manifiesto el creciente interés en los modelos celulares in vitro . Estos modelos suelen utilizar uno o varios ácidos grasos libres, como el ácido oleico (OA) y el ácido palmítico, para recrear el MASLD inducido por la dieta. Entre ellas, la línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo para establecer modelos celulares in vitro de MASLD.

La inducción de OA estimula las células HepG2 para replicar la deposición de grasa similar a MASLD, un método con una historia bien establecida. El objetivo de este estudio fue demostrar la viabilidad, la tinción de Oil Red O (ORO), el contenido de lípidos y el nivel de triglicéridos (TG) de las células HepG2 tratadas con 0,25 mM de OA. El objetivo de este experimento fue proporcionar más evidencia para el desarrollo de estudios de modelado MAFLD.

Protocolo

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NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Cultivo celular

  1. Cultivo de células HepG2 en matraces de cultivo que contienen el medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS], 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). Mantener los matraces de cultivo a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 .

2. Efecto del ácido oleico en la viabilidad celular medido por el kit de recuento celular-8

  1. Disolver un volumen específico de OA en dimetilsulfóxido (DMSO) para lograr una concentración de 200 mM. Almacene la solución a -20 °C para su uso futuro.
  2. Siembre células HepG2 en una placa de 96 pocillos con una densidad celular de 6 × 103 celdas por pocillo. Agregue 100 μL de DMEM a cada pocillo. Incubar y cultivar las células a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2 durante 24 h. Divida las células HepG2 en dos grupos:
    1. Grupo de control: añadir medio de cultivo celular.
    2. Grupo OA: añadir OA al medio de cultivo celular para alcanzar concentraciones finales de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM.
  3. Después de 24 h de incubación inicial, desechar el sobrenadante de cada pocillo y agregar OA de acuerdo con el grupo especificado, agregando 100 μL por pocillo. Para el grupo de control, agregue 100 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo. Continúe incubando las células durante otras 24 h.
    NOTA: Asegúrese de que cada grupo tenga seis pozos replicados. Para evitar la evaporación, agregue 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al anillo exterior de los pocillos en la placa de 96 pocillos.
  4. Después de 24 h de incubación, agregue 10 μL de kit de conteo de células-8 (CCK-8) a cada pocillo, mezcle suavemente e incube durante 2 h en la oscuridad. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora, colóquela en el lector de microplacas y mida el valor de absorbancia a 450 nm (A450). Los valores de IG50 se contabilizaron según el DO.

3. Tinción de aceite rojo O para observar la formación de gotas de lípidos intracelulares

  1. Siembre las células HepG2 en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y cultive las placas en una incubadora de temperatura constante durante 24 h. Consulte la Figura 1 para obtener una representación visual de los pasos descritos.
  2. Después de 24 h de cultivo celular, agregue 2 mL de medio de cultivo celular que contenga OA a cada pocillo, logrando concentraciones finales de 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM y 1 mM. Después de 24 h adicionales, retire el medio de cultivo celular de cada pocillo y lave dos veces con PBS. Agregue 1 mL de fijador ORO a cada pocillo e incube durante 30 min.
  3. Prepare la solución de tinción ORO mezclando la solución de tinción A con la solución de tinción B en una proporción de 3:2. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego filtre una vez a través de un filtro de 0,45 μm. Guarde la solución filtrada en un tubo de centrífuga protegido de la luz hasta su uso.
  4. Deseche el fijador y lávese dos veces con agua destilada. Añadir 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incubar durante 30 s. Deseche el 60% de la solución de isopropanol y agregue 1 mL de solución de tinción ORO recién preparada a cada pocillo antes de incubar durante 20 minutos. Deseche la solución de tinción ORO, agregue 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incube durante 30 s. Lava 5 veces con agua para eliminar el exceso de tinte.
  5. Cubra las células con agua destilada y observe bajo un microscopio. Una vez recogidas las imágenes, desecha el líquido de la placa y deja que se seque. A continuación, añada 2 mL de isopropanol a cada pocillo y agite el plato en un agitador orbital durante 10 min. Transfiera el líquido a una nueva placa de 96 pocillos, con 16 pocillos en cada grupo, agregando 100 μL por pocillo. Calcule el contenido de lípidos midiendo la densidad óptica (OD) de cada pocillo utilizando un lector de microplacas a 510 nm (A510).

4. Efectos de diferentes concentraciones de ácido oleico sobre el triglicérido total en el sobrenadante celular HepG2

  1. Equilibre el kit a temperatura ambiente durante 20 minutos y prepare las placas necesarias para el experimento.
  2. Recoja el sobrenadante celular y centrifugue a 1.570 × g durante 10 min. Establecer pozos estándar y probar pozos de muestra. Agregue 50 μL de concentración estándar ([S0 → S5] seguida de: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) a los pocillos estándar. Además de los pocillos en blanco y estándar, agregue 10 μL de muestras diferentes a los pocillos de muestra, seguido de agregar 40 μL de diluyente de muestra a cada pocillo. Añadir 100 μL de anticuerpo de detección-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo, sellar con una membrana de placa e incubar a 37 °C durante 1 h en un horno de temperatura constante.
  3. Deseche el sobrenadante, séquelo en papel sin polvo y lave cada pozo con 1 solución de lavado. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min. Repita el proceso de lavado 5 veces.
  4. Agregue 50 μL de sustrato A y 50 μL de sustrato B a cada pocillo. Mezclar suavemente e incubar durante 15 min a 37 °C. Agregue 50 μL de solución de terminación a cada pocillo y mida el valor OD de cada pocillo a 450 nm (A450) dentro de los 15 min.
  5. Represente la concentración del patrón a lo largo del eje x y el valor de absorbancia (OD) correspondiente a lo largo del eje y para realizar una regresión lineal y derivar la ecuación de la curva para calcular el valor de concentración de cada muestra.

5. Análisis estadístico

  1. Determinar diferencias significativas en los datos cuantitativos.
  2. Calcule la media ± la desviación estándar (DE) y represente gráficamente los datos. Considere que P < 0,05 son estadísticamente significativos.

Resultados

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Efecto del ácido oleico sobre la viabilidad celular
Las células HepG2 se expusieron a concentraciones variables de OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), lo que resultó en una disminución en las tasas de supervivencia celular a 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM en comparación con 0 mM. Se observó significación estadística a 0,5 mM (P < 0,05) y 1 mM (P < 0,05) en comparación con 0 mM. Los resultados del impacto de la OA en la viabilidad celular, evaluados por el kit CCK-8, se muestran en la Figura 2. El valor de GI50 para las células HepG2 tratadas con OA se calculó como 1,875 mM.

Tinción de Oil Red O para observar la formación de gotas de lípidos intracelulares
La tinción con ORO es un método comúnmente utilizado para la visualización de lípidos16,17. En consecuencia, se observó al microscopio la formación de gotas de lípidos en las células HepG2 incubadas con OA durante 24 h tras la tinción con ORO. Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, la intensidad de la tinción roja en las células tratadas con OA fue mayor que en las células no tratadas. Las gotas de lípidos rojos estaban presentes en el plasma de las células HepG2 después del tratamiento con OA, y las cantidades de gotas de lípidos y lípidos aumentaban con el aumento de las concentraciones de OA (Figura 5).

Efectos de diferentes concentraciones de ácido oleico sobre el triglicérido total en el sobrenadante celular HepG2
Los hallazgos experimentales, como se ilustra en la Figura 6, revelaron que, en comparación con el grupo de control, el tratamiento de las células HepG2 con concentraciones variables de OA (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) resultó en un aumento significativo en el contenido de TG del sobrenadante celular en el grupo OA (P < 0,05).

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Figura 1: Diagrama de flujo para la tinción de Oil Red O. Abreviaturas: OA = ácido oleico; OD = densidad óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Efecto del ácido oleico sobre la viabilidad celular, evaluado mediante un ensayo de recuento de células-8. Cada barra representa la media ± SD (n = 6). *P < 0,05. Abreviatura: OA = ácido oleico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes de tinción de Oil Red O de múltiples puntos de tiempo (direcciones de las 3, 6, 9 y 12 en punto). La formación de gotas de lípidos se detectó utilizando un microscopio invertido para cultivo celular con un aumento de 40x. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Efecto del ácido oleico sobre las gotas de lípidos en las células, evaluado mediante tinción con Oil Red O. La formación de gotas de lípidos se detectó utilizando un microscopio invertido para cultivo celular con un aumento de 40x. Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Efecto del ácido oleico sobre el contenido lipídico en las células, evaluado por el valor de la densidad óptica. Los cambios relativos de plegamiento se presentan en los valores de densidad óptica en diferentes grupos. Cada columna representa la media ± DE (n = 16). *P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Efectos de varias concentraciones de ácido oleico sobre los niveles de triglicéridos totales en el sobrenadante de células HepG2. Se presentan cambios relativos en el plegamiento en el valor de los niveles de triglicéridos en diferentes grupos. Cada columna representa la media ± SD (n = 3). *P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El MASLD es un síndrome clinicopatológico caracterizado por un depósito excesivo de grasa intracelular en los hepatocitos debido a factores más allá del alcohol y otros agentes hepáticos establecidos18. La MASLD está estrechamente relacionada con la lesión hepática por estrés metabólico adquirido, especialmente asociada con la resistencia a la insulina y la susceptibilidad genética. Para estudiar y cribar eficazmente los fármacos para detectar la MASLD, es crucial seleccionar un modelo experimental adecuado. El establecimiento de un modelo celular es particularmente vital en la investigación de MASLD, ya que facilita una comprensión más profunda de los mecanismos patológicos y la evaluación de los efectos de nuevos medicamentos.

Este protocolo describe un modelo in vitro de MASLD establecido a través de células HepG2 inducidas por OA. La tinción de ORO y el análisis del contenido de lípidos sirven como métodos críticos para crear este modelo. Además, la evaluación de la viabilidad celular y el contenido total de TG en los sobrenadantes celulares es esencial para evaluar la concentración adecuada de OA. El criterio diagnóstico para la MASLD implica la presencia de más del 5% de TG almacenado en las células hepáticas19,20. Los modelos de células MASLD se basan principalmente en las células HepG2 21,22,23,24,25,26,27,28, conocidas por su exitosa utilización en la construcción de modelos de degeneración del hígado graso en varios estudios nacionales e internacionales. A pesar de tener su origen en células de hepatoma, las células HepG2 comparten muchas características fenotípicas con los hepatocitos y se cultivan y propagan fácilmente29,30. Pruebas como el kit CCK-8, la tinción de ORO, el contenido de lípidos y las mediciones de TG total ofrecen enfoques simples, objetivos y razonables para evaluar la viabilidad celular, la acumulación de grasa y el contenido de lípidos en los sujetos del estudio. En este contexto, la OA se alinea con la patogénesis de MASLD31, donde el exceso de energía se almacena en forma de lípidos cuando la ingesta de energía supera el consumo.

Los investigadores han utilizado OA 23,28,31,32,33, ácido palmítico 34,35 y combinaciones de ácido oleico/palmítico26,36 para replicar el modelo MASLD. Tanto el ácido palmítico como la OA contribuyen a la degeneración grasa del hígado y a la acumulación de TG. El ácido palmítico, el ácido graso saturado más abundante en el cuerpo humano, exhibe una lipotoxicidad significativa, lo que conduce a la acumulación de lípidos en los hepatocitos, aumento de los radicales reactivos de oxígeno intracelulares y muerte o necrosis celular37. Por el contrario, la OA conduce a un depósito de TG intracelular más pronunciado (Figura 6) y a una menor modulación celular38. Por lo tanto, los investigadores a menudo utilizan células HepG2 inducidas por OA para establecer modelos MASLD in vitro. Como se describe en el paso del protocolo 2.2.2, es crucial calentar la solución de OA al agregarla. En este estudio, la tinción de ORO y el análisis del contenido de lípidos se basaron en la deposición de lípidos de las células HepG2, lo que apoyó eficazmente la exploración de modelos in vitro de MASLD con mecanismos complejos y redujo el tiempo y el costo necesarios para la investigación.

El ORO se une fácilmente a TG en forma de gota, produciendo manchas de naranja a rojo indicativas de grasa, con una intensidad de color que depende de la concentración de lípidos. Sin embargo, la solución de tinción ORO es inestable y propensa a la precipitación, por lo que no es adecuada para la preparación anticipada. Por lo tanto, la solución de tinción ORO se preparó después del paso 3.2 del protocolo, tomando precauciones para evitar la exposición a la luz durante la preparación y la incubación (pasos 3.2, 3.3 del protocolo). En el paso 3.5 del protocolo, la selección de imágenes en múltiples puntos de tiempo (direcciones de las 3, 6, 9 y 12 en punto) representa una modificación clave del experimento que es esencial para mejorar la precisión de los resultados. Aunque las concentraciones elevadas de OA afectan a la supervivencia celular, lo que representa una limitación de este método, se ha demostrado que una concentración adecuada de OA garantiza la viabilidad celular.

Este estudio empleó un enfoque integral, utilizando un kit CCK-8, tinción de ORO, análisis del contenido de lípidos y medición de TG total para establecer y validar el modelo de MASLD. El kit CCK-8 se utilizó para evaluar el efecto de los fármacos en la viabilidad celular, sirviendo como un paso crucial de validación. En el futuro, este modelo es prometedor para el cribado de fármacos y la investigación de mecanismos destinados a comprender la patogénesis de MASLD e identificar posibles dianas terapéuticas. Para garantizar aún más la calidad de la fiabilidad de la validación, los niveles de expresión de las proteínas diana implicadas en el modelo se analizarán mediante Western blot y análisis cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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El estudio actual fue financiado por "Estudio sobre los problemas clave del efecto curativo de Koumiss en las enfermedades regionales de la medicina mongola" en el proyecto apoyado en 2018 del programa de ciencia y tecnología del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Región Autónoma de Mongolia Interior.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m filtroMillex
0.25% Tripsina-EDTA (1x) Tripsina-EDTAGibco25200-056
0.45 µ m filtroMillex
2 mL viales crigénicosCORNING430659
25 cm2 matraz de cultivo celularCORNING430639
placa de cultivo celular de 6 pocillosCORNING3516
placa de cultivo celular de 96 pocillosCORNING3599
placa de hemogramasShanghái Jing Jing Reactivo bioquímico & Instrumento Co.
Kits de recuento de células Kit-8 ensayosBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd. CA1210-1000T
CO2 incubadoraNUAIRENU-5710E
  DMSO Dimetilsulfóxido Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd. D8371
etiquetado de enzimas
Suero bovino fetal,Gibco10099141
HepG2calificadas Instituto de Investigación de Biotecnología Chuanglian del Norte de China (BNCC) de Beijing (BNCC)221031
instrucciónInstituto de Bioingeniería de Nanjing Jiacheng20170301
Microscopio invertido para cultivo celularLeicaDMi1 
IsopropanolTianjin Zhiyuan Reactivo Químico Co.
Kit de manchas rojas de aceite, para células cultivadasBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd. G1262
Ácido oleico  Sangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.
Penicilina EstreptomicinaGibco15140122
SPSS 24.0Software
02270113 Equipo de Gibco 8122691 medio Eagle modificado de Dulbecco Tecan Spark línea de células Triglicéridos humanos (TG) ELISA 2021030141A502071 estadístico

Referencias

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