Este protocolo presenta un método completo y eficiente para analizar la reparación del hueso mandibular. Describimos una técnica reproducible para la fractura mandibular no estabilizada en un modelo de ratón, que permite analizar el proceso de reparación ósea endocondral con un mínimo daño tisular y pérdida ósea.
Artículo de método
Técnica menos invasiva para la fractura mandibular no estabilizada en modelos murinos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fracturas no estabilizadas se pueden realizar en sitios mandibulares en ratones, lo que permite analizar la reparación ósea utilizando un modo de osificación endocondral. Para reflejar con mayor precisión este proceso in vivo, es necesario contar con un protocolo estandarizado para evitar la pérdida ósea excesiva y el daño de los tejidos blandos, particularmente en el sitio mandibular, un sitio anatómico caracterizado por un acceso mínimo. Hasta donde sabemos, describimos por primera vez un protocolo menos invasivo de fractura mandibular no estabilizada en ratones. Los ratones adultos se anestesian con isoflurano y reciben una dosis preoperatoria de buprenorfina por inyección subcutánea. Se realiza un abordaje submandibular, con una incisión en la piel a lo largo del borde inferior de la mandíbula. El músculo masetero se eleva en un plano subperióstico a lo largo de la rama mandibular con un elevador perióstico. Se realiza una fractura vertical y completa de la rama desde el borde basilar hasta la escotadura coronoides (entre las apófisis condilar y coronoides), utilizando un dispositivo de cirugía ósea piezoeléctrica bajo irrigación salina con suero fisiológico en el borde basilar y tijeras para completar la fractura de la rama mandibular. El abordaje de la piel se cierra con suturas de seda. Este procedimiento detallado para fracturas mandibulares no estabilizadas ofrece un procedimiento eficiente que permite una pérdida ósea mínima y daño de tejidos blandos. Esta técnica garantiza resultados exitosos y consistentes para reflejar con precisión el proceso de reparación del hueso endocondral en modelos de ratón.
Introducción
La reparación ósea implica procesos de osificación tanto membranosa como endocondral, dependiendo de la fractura o de la estabilización de la osteotomía. La reparación ósea después de osteotomías o fracturas óseas estabilizadas se basa en la osificación membranosa, mientras que las fracturas no estabilizadas o las osteotomías mal estabilizadas se consolidan según un modo de osificación endocondral1. La reparación ósea membranosa se caracteriza por la formación de hueso por diferenciación directa de las células mesenquimales en osteoblastos, mientras que la reparación ósea endocondral implica la formación de una plantilla cartilaginosa transitoria, que se diferencia en osteoblastos para formar el callo óseo2.
La reparación ósea depende de múltiples interacciones tisulares y celulares; También está influenciado por factores específicos del sitio y por la fuerza ejercida sobre el callo3. El hueso mandibular es un hueso móvil que soporta las fuerzas masticatorias, formado principalmente por el hueso cortical. El proceso de reparación del hueso mandibular está influenciado por el sitio y la dirección de la fractura. Es bien sabido que las lesiones musculares y del periostio pueden afectar la consolidación ósea, así como una importante pérdida ósea en el sitio de la fractura 4,5,6.
El análisis de la reparación ósea endocondral mandibular implica protocolos estandarizados y reproducibles para comparaciones valiosas y no sesgadas. En cuanto a la literatura, solo unos pocos autores reportan protocolos para fracturas mandibulares no estabilizadas en modelos de ratones 3,7, y en su mayoría con dirección anterior a nivel molar8. Con el desarrollo de esta técnica, nuestro objetivo es evitar lesiones musculares y del periostio y limitar la pérdida ósea en el sitio de la fractura para analizar mejor el proceso de reparación ósea endocondral sin factores de confusión. Además, el propósito de desarrollar una nueva técnica para la fractura mandibular en ratones fue minimizar el dolor postoperatorio y la muerte animal frecuente en este tipo de cirugía en animales pequeños. Por primera vez, describimos un protocolo menos invasivo para la fractura mandibular no estabilizada a nivel de la rama en ratones. Este protocolo in vivo evita el daño muscular y periostio excesivo o la pérdida ósea en el sitio de la fractura y ayuda a reducir el nivel de dolor postoperatorio y el riesgo de muerte del animal.
Protocolo
Este protocolo sigue las directrices de cuidado animal de Imagine Institute y ha sido validado por comités de ética y el ministerio francés (APAFIS 26995).
1. Animales
- Determine el número de animales por grupo. Recomendamos 12 animales por grupo. Determinar el sexo y la edad de los ratones. Este protocolo está adaptado para ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad (machos o hembras).
- Dé a los animales, al menos 1 semana antes del procedimiento, un suplemento nutricional en gel para la aclimatación.
2. Procedimiento quirúrgico
- Prepare el material requerido. Autoclave de los instrumentos: tijeras, atornillador de agujas, pinzas, inserto y pieza de mano del dispositivo de cirugía ósea piezoeléctrica y elevador. Prepare guantes estériles, suturas de seda (4/0), afeitadora, gasa de algodón, solución de povidona yodada al 10%, mesa térmica, isoflurano y la mascarilla para el hocico para la inhalación de isoflurano.
- Preparar buprenorfina a 0,1 mg/kg, diluida en suero fisiológico inyectable estéril. Administrar buprenorfina por inyección subcutánea con una aguja de 25G 30 min antes de la cirugía.
- Prepare la placa calefactora (37 °C), coloque un soporte de espuma sobre ella y fije la máscara del hocico con agujas pequeñas o cinta adhesiva.
- Colocar el ratón en el tanque de isoflurano para la inducción, con difusión de isoflurano (4%). Pruebe la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie. En caso de inducción suficiente, se observará una falta de reflejo pedal.
- Coloque el ratón anestesiado boca arriba sobre la placa calefactora cubierta por un campo estéril que se mantiene a 37 °C durante todo el procedimiento. Coloque la mascarilla en el hocico para la inhalación continua de isoflurano (mantenimiento al 2,5%). Fije las extremidades del ratón con cinta adhesiva.
- Aplique lubricante ocular bilateralmente para prevenir la sequedad ocular inducida por la anestesia general. Afeitar el vello submandibular, usar guantes estériles y desinfectar la piel con varias pasadas de solución de povidona yodada al 10% y alcohol.
- Realizar el abordaje cutáneo submandibular como se describe a continuación.
- Realizar una incisión en la piel desde el ángulo mandibular hasta la unión 1/3 posterior - 2/3 anterior de la rama horizontal de la mandíbula con microtijeras.
- Diseccionar los tejidos subcutáneos para exponer el músculo masetero.
- Desinserte el músculo masetero que se adhiere con el uso de un elevador perióstico desde el borde inferior de la mandíbula.
- Eleve el músculo masetero en un plano subperióstico a lo largo de la rama mandibular con el elevador.
- Realizar una pequeña osteotomía (3 mm de longitud) en el borde inferior de la mandíbula utilizando el dispositivo de cirugía ósea piezoeléctrica bajo irrigación con suero fisiológico (10 mL/min máximo) en el borde inferior de la mandíbula, anterior al ángulo mandibular, en la parte posterior de la concavidad (Figura 1, Figura 2).
- Localizar el borde posterior de la mandíbula y la escotadura coronoides (con las microtijeras o las pinzas) y completar la fractura con el uso de pequeñas tijeras rectas insertadas a lo largo de la rama mandibular para evitar la apertura adicional del músculo masetero y la lesión. Para permitir la correcta orientación de la fractura, coloque las tijeras perpendicularmente al borde inferior de la mandíbula.
- Verificar que la fractura sea totalmente completa: se debe observar la movilidad total entre los dos segmentos óseos durante la movilización blanda de los 2 segmentos con pinzas.
- Cierre el abordaje cutáneo con suturas de seda (4/0) con suturas separadas. No se necesita sutura en el periostio.
NOTA: Alternativamente, el abordaje cutáneo puede suturarse con otras suturas no adsorbibles (p. ej., suturas de polipropileno). - Realizar radiografías laterales cefálicas para confirmar la dirección de la fractura (Figura 3).
- Vuelva a colocar el ratón en el tanque de isoflurano para una breve reinducción antes de realizar las radiografías. A continuación, coloque el ratón en extensión, en el lado lateral, con la cabeza ligeramente en hiperextensión para el análisis de rayos X.
- En caso de fractura demasiado anterior situada a nivel de un molar mandibular o cuando la fractura desprendió el ángulo mandibular (Figura 4), observar un aumento anormal del volumen del callo óseo. En estos casos, excluir a los animales del estudio para evitar cualquier sesgo en el análisis.
- Revise a los ratones hasta que recuperen la conciencia antes de volver a colocarlos en la jaula.
3. Cuidados postoperatorios
- Prepare una jaula para ratones sin croquetas y enriquecimiento duro para evitar cualquier fuerza masticatoria.
- Aísle el ratón operado en una sola jaula durante la1ª semana hasta que la piel se haya curado por completo. A la semana de la postoperatoria, el grupo operó a ratones hembra juntos en la misma jaula.
- Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) mediante inyecciones subcutáneas a las 4 h, 24 h, 48 h y 72 h después del procedimiento.
- Alimente a los ratones con gel dietético blando durante todos los períodos postoperatorios desde el día 0 hasta el final del período de consolidación (es decir, 28 días) para evitar el dolor y el desplazamiento secundario de la fractura.
- Pesar diariamente a los ratones desde el día 0 hasta el día 4 después de la fractura, por la mañana, antes de la inyección de buprenorfina, y luego 3 veces por semana hasta el sacrificio del animal (14 días después de la fractura).
- Evaluar el bienestar postoperatorio de los animales para optimizar el cuidado postoperatorio de los animales. Utilizar la escala de puntuación de la Tabla 1 para evaluar el estado postoperatorio del animal y adaptar el seguimiento. Cuando la puntuación es > 1, se administra la inyección de buprenorfina, y cuando la puntuación es > 3 y/o en caso de pérdida de peso > 20% del peso preoperatorio a pesar del enriquecimiento alimentario, se debe hablar de la eutanasia (Tabla 1).
Resultados
En cuanto a los procedimientos quirúrgicos in vivo , para realizar de forma óptima este procedimiento de fractura mandibular no estabilizada en un modelo de ratón, se requiere un aprendizaje y formación específicos.
Esta técnica de fractura mandibular no estabilizada permite estudiar el proceso de reparación ósea endocondral. Tras la eutanasia, se recogieron muestras mandibulares en paraformaldehído al 4% (24 h). Después de la descalcificación completa con EDTA pH 8, las secciones se incrustaron en parafina. Se realizaron cortes seriados sagitales, desparafinados en solución de desparafinación y luego rehidratados antes de la tinción con rojo sirus/azul alcián, utilizando protocolos estándar. Las imágenes histológicas confirmaron la formación de un callo blando con una plantilla cartilaginosa (Figura 5). La cicatrización ósea se completa a las 4 semanas después de la fractura, como lo demuestran los análisis de micro-TC. Sugerimos estudiar el proceso de reparación ósea en diferentes puntos clave desde el inicio de la formación del callo (p. ej., cada 7 días (día 7, 14, 21) o más dependiendo del objetivo del estudio) hasta el final de la cicatrización ósea (es decir, el día 28), con análisis histomorfológicos y morfométricos micro-TC.
Sobre la base de un análisis retrospectivo de este procedimiento realizado en 58 ratones de tipo salvaje (fondo C57BL/6J), la tasa de éxito del protocolo es del 86,3% y una tasa de exclusión del 13,7%. La exclusión se debió a la muerte espontánea prematura en el postoperatorio precoz (3%), a la decisión de eutanasia en ratones que presentaban una puntuación crítica (1%; puntuación > 3 y/o en caso de pérdida de peso > 20%), o en caso de posición anormal de la osteotomía, con división anormal del ángulo mandibular (5%), o cuando la fractura estaba a nivel de los molares (n=1/58). En este último caso se observó infección, con desdoblamiento anormal de la fractura a nivel molar (n= 1/58; Tabla 2).
Figura 1: Imagen del abordaje cutáneo submandibular de la rama ascendente mandibular. El borde inferior de la mandíbula se fractura con un inserto de piezotomo, lo que permite una pérdida ósea mínima (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción de la mandíbula del ratón. Vista lateral de la mandíbula de un ratón salvaje de 6 semanas de edad (teñida con rojo alizarina / azul alcián): 1. Cóndilo, 2. Apófisis coronoides, 3. Muesca coronoides, 4. Apófisis angular, 5. Borde posterior de la rama, 6. Borde basilar (o inferior) de la mandíbula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Radiografía del cráneo del ratón. Radiografías laterales del cráneo de un ratón de 6 semanas de edad de tipo salvaje (vista sagital) que muestran el aspecto de la mandíbula de un ratón no fracturado (izquierda) y el aspecto de la mandíbula de un ratón fracturado y la dirección de la fractura mandibular no estabilizada (flechas), desde el borde inferior hasta la escotadura coronoides, situada anteriormente al cóndilo (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Radiografía del cráneo del ratón en condiciones subóptimas. Radiografías laterales del cráneo de un ratón de 6 semanas de edad de tipo salvaje (vista sagital) que muestran una fractura anormal del ángulo mandibular (flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos. Resultados a los 14 días post-fractura en un ratón de tipo salvaje (C57BL/6J). Vistas coronales 3D representativas de una tomografía computarizada reconstruida del sitio de la fractura mandibular, que muestra el callo óseo (flechas blancas). Imágenes representativas del cartílago calloso (tinción Rojo Sirus/Azul Alcián) que confirman la presencia de un proceso de reparación ósea endocondral. Abreviaturas: B = Hueso, C = Cartílago. Barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 0 | 1 | 2 | |
| Aspecto animal | Normal | Reducción de inodoros | Pelos alborotados, espalda arqueada |
| Comportamiento | Normal | Hipomovilidad | Hipomovilidad, reducción de la ingesta de alimentos, pérdida de peso > 10 % |
| Signos clínicos | Normal | Inflamación de la cicatriz | Cicatriz abierta, infección |
Tabla 1. Escala de puntuación de bienestar postoperatorio.
| n = 58 ratones | |
| Tasa de éxito | 86.3 % |
| Tasa de exclusión: | 13.7 % |
| Muerte espontánea prematura | 3% |
| Puntuación crítica < 3, y/o pérdida de peso > 20 % | 1% |
| Fractura anormal dividida en el ángulo mandibular | 5% |
| División anormal de la fractura, a nivel de los molares | 1.7 % |
Tabla 2. Tasas de éxito y exclusión del protocolo.
Discusión
La técnica permite la realización de fracturas mandibulares no estabilizadas en un modelo de ratón dentro de un abordaje abierto mínimo en un corto tiempo de procedimiento (alrededor de 10 min o menos). Este procedimiento a corto plazo limita el riesgo de morbilidad y muerte animal, especialmente en animales pequeños como ratones. Para obtener resultados comparables en el análisis del proceso de reparación ósea endocondral, se debe tener especial cuidado en realizar las fracturas mandibulares en la misma dirección sin un corte anormal del ángulo mandibular, ya que este efecto indeseable puede aumentar anormalmente el volumen del callo óseo y retrasar el período de consolidación. Este protocolo para la fractura mandibular no afecta el crecimiento de los incisivos mandibulares después de la cirugía. Para mejorar la eficacia de este protocolo, aconsejamos al experimentador que primero haga ejercicio con animales sacrificados de edad similar y diseccione inmediatamente después de fracturar la mandíbula para visualizar directamente la dirección de la fractura si es necesario.
Los progenitores mesenquimales que migran de los músculos adyacentes al callo contribuyen a la reparación ósea6. Se ha demostrado que el periostio y las lesiones musculares impactan en la consolidación ósea 5,6. Además, las secciones musculares extensas conducen a un mayor riesgo de sangrado y pueden provocar una infección postoperatoria. La piezocirugía se ha desarrollado en gran medida en el campo de la cirugía ósea craneofacial; Se ha reportado que tiene tasas más bajas de lesión de tejidos blandos y dolor postoperatorio en comparación con las osteotomías convencionales 7,9. Para minimizar la lesión del músculo masetero y del periostio, utilizamos la piezocirugía para iniciar la fractura en el borde inferior de la mandíbula y completamos la fractura con tijeras en el nivel superior de la rama para evitar una sección extensa del músculo masetero. Esto implica controlar la posición del borde posterior de la mandíbula y la escotadura coronoides antes de fracturar la parte superior de la rama con las tijeras. No encontramos dificultad para completar la fractura con el uso de tijeras pequeñas y rectas después de haberla iniciado con piezocirugía en el borde inferior de la mandíbula. Experimentamos este procedimiento en ratones adultos con diferentes antecedentes genéticos (C57BL/6J, CD1 (resultados no mostrados)), con diferentes densidades óseas y tamaños mandibulares (prognatismo, micrognatia). Sin embargo, aconsejamos comprobar que la longitud de las tijeras es la adecuada para fracturar la rama superior una sola vez para evitar cualquier fractura anormal.
El riesgo de sangrado se minimiza en este procedimiento debido a este enfoque abierto mínimo. En el caso de sangrado excesivo que puede ocurrir durante la elevación muscular, una breve compresión del sitio quirúrgico con una gasa detiene el sangrado. Un riesgo potencial de infección del sitio de operación puede ocurrir en caso de fractura de un diente molar cuando la fractura mandibular está demasiado ubicada anteriormente; este efecto adverso se puede detectar en las radiografías laterales postoperatorias. En este caso, el animal debe ser excluido del estudio. La infección postoperatoria del sitio quirúrgico también puede deberse a un hematoma; Esto puede prevenirse mediante la realización de suturas cutáneas separadas, permitiendo la evacuación espontánea cuando se produce un sangrado anormal antes de la operación. La anestesia general con isoflurano versus inyección intraperitoneal evita tasas de mortalidad excesivas relacionadas con los efectos traumáticos adversos de las inyecciones intraperitoneales. En nuestra experiencia, no observamos ninguna muerte animal directamente relacionada con la anestesia general con isoflurano.
Los ratones pueden presentar una reducción postoperatoria de la ingesta de alimentos. En caso de ingesta insuficiente de alimentos o aumento de peso insuficiente, se puede agregar croquetas en polvo tamizadas al gel. Para mejorar la ingesta de alimentos en el postoperatorio, se recomienda dar gel de suplemento nutricional con croquetas al menos 1 semana antes del procedimiento de acomodación. Recomendamos realizar radiografías adicionales durante el seguimiento (cada semana, durante el seguimiento) y en el momento del sacrificio para evaluar el posible desplazamiento de la fractura. En condiciones no patológicas, la consolidación ósea es completa 4 semanas después de la fractura.
Varios autores han descrito diferentes protocolos para las fracturas no estabilizadas de la mandíbula en ratones 3,10,11. Los instrumentos utilizados para realizar la osteotomía pueden ser diferentes, a saber, fresas, pinzas quirúrgicas, etc. Sin embargo, el uso de taladros puede provocar una mayor pérdida ósea y lesiones de tejidos blandos. Hasta donde sabemos, este procedimiento de fracturas mandibulares no estabilizadas es el primero en asociar la piezocirugía y las tijeras para completar la osteotomía. Esta técnica tiene la ventaja de preservar los tejidos blandos al tiempo que permite una osteotomía precisa con una pérdida ósea mínima.
Como todas las técnicas, este método tiene algunas limitaciones. Se prefirió realizar la fractura con el uso de tijeras después de iniciarla con un inserto de cirugía piezoeléctrica para evitar cualquier sección de músculo masetero extendida y lesión del periostio que pudiera exacerbar un posible retraso en la consolidación y/o formación de pseudoartrosis. Sin embargo, esta técnica implica controlar la posición de la escotadura coronoides sin una visualización total de la rama mandibular para realizar la fractura en la misma dirección. Por lo tanto, se espera una curva de aprendizaje, dependiendo de la experiencia quirúrgica. Además, la dirección de la fractura mandibular en las radiografías puede ser difícil de visualizar dependiendo del dispositivo de rayos X. No utilizamos micro-TC in vivo para confirmar la dirección de la fractura, ya que podría comprometer la recuperación del ratón debido al aumento de la duración de la anestesia general.
El estudio del proceso de reparación ósea endocondral implica la realización de fracturas no estabilizadas, lo que permite una mejor comprensión del proceso de reparación ósea. Este paso es necesario si queremos plantearnos ensayos preclínicos en modelos de ratón con defectos de reparación ósea con el objetivo de desarrollar nuevas aplicaciones clínicas para el tratamiento de la reparación ósea defectuosa y la pseudoartrosis en pacientes en el contexto de enfermedades genéticas o en el caso de secuelas postraumáticas o posttumorales.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
El estudio cuenta con el apoyo parcial del Departamento de Filantropía de Mutuelles AXA a través de la Cátedra Head and Heart y la ANR BonyBrain. Agradecemos a todos los miembros de la plataforma SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, París, Francia, por su contribución a la realización del procedimiento.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina : Buprecare 0.3 mg/kg | Elevador Animalcare | ||
| OBWEGESER ancho 6mm Largo 17,5cm | Pinzas Collin Medical | HA 5905 | |
| : Placa de almohadilla MORIA 11 cm N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Mesa calefactora Bioseblab 55 cm x 33 cm | Bioseblab | 707 | |
| Portaagujas HOLDER : Micro Halsey Needle Holder - Metal | LABODERM | 21,100 | |
| Neo Clear | Merck Millipore, Darmstadt, Alemania | 109843 | |
| Ocry Gel Tube 10 g (lubricante ocular) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotome 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Inserto piezotomo Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Tijeras micro | MORIA | MC52 | |
| Suturas de seda PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Tijeras rectas | MORIA | 4877A | |
| Vetflurano (isoflurano) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Referencias
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