Este protocolo describe el método para reducir la ingesta dietética de ácido fólico o colina en ratones hembra antes del embarazo con el objetivo de investigar el impacto de la dieta materna en los resultados de salud de la descendencia.
Artículo de método
Modificación de los niveles de ácido fólico o colina en la dieta materna para estudiar el impacto de las deficiencias en los resultados de salud de la descendencia
En este artículo
Resumen
Resumen
La nutrición materna durante el embarazo y la lactancia juega un papel importante en el neurodesarrollo de las crías. El metabolismo de un solo carbono (1C), que se centra en el ácido fólico y la colina, así como en otras vitaminas B, desempeña un papel clave durante el cierre del tubo neural del feto en desarrollo. Sin embargo, el impacto de estas deficiencias nutricionales maternas durante el embarazo en los resultados de salud de las crías después del nacimiento sigue siendo relativamente indefinido. Además, las deficiencias dietéticas maternas de ácido fólico o colina pueden afectar otros resultados de salud en la descendencia, lo que lo convierte en un modelo valioso. Este protocolo tiene como objetivo describir el procedimiento para inducir una deficiencia en el metabolismo de 1C en ratones hembra a través de modificaciones en la dieta. Las hembras se someten a dietas al destete, hasta los 2 meses de edad, durante 4-6 semanas antes del apareamiento y permanecen a dieta durante todo el embarazo y la lactancia. Las crías de estas hembras pueden ser evaluadas para obtener resultados de salud. Las hembras se pueden usar varias veces para generar descendencia, y los tejidos de las hembras se pueden recolectar para medir las mediciones de metabolitos 1C. Este protocolo proporciona una visión general de cómo inducir deficiencias dietéticas maternas de ácido fólico o colina para estudiar los resultados de salud de la descendencia.
Introducción
La nutrición materna durante el embarazo y la lactancia juega un papel vital en el desarrollo de la descendencia. El metabolismo de un carbono (1C) es una red metabólica clave que integra las señales nutricionales con la biosíntesis, la homeostasis redox y la epigenética. El ácido fólico y la colina son componentes centrales del 1C que desempeñan un papel importante en el cierre del tubo neural. Se recomienda ampliamente que las mujeres tomen suplementos de ácido fólico y colina durante sus años fértiles1. Si bien el papel crítico del ácido fólico en el desarrollo fetal está claramente establecido, los mecanismos subyacentes involucrados siguen sin estar claros. Se recomienda a las mujeres en edad fértil tomar ácido fólico antes de quedar embarazadas, ya que el cierre del tubo neural se produce dentro del primer trimestre2. Las madres embarazadas que tienen deficiencia de ácido fólico u otros componentes de 1C, como la colina, tienen una mayor incidencia de partos con defectos del tubo neural debido a la alta demanda de síntesis de nucleótidos y otros procesos requeridos por el período gestacional temprano3.
El impacto a largo plazo de las dietas maternas deficientes en la ingesta del metabolismo 1C en los resultados de salud de la descendencia es poco conocido. La investigación de nuestros laboratorios, así como de otros, ha demostrado que las dietas maternas deficientes en ácido fólico o colina tienen un impacto en los resultados de salud de la descendencia después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando modelos preclínicos 4,5,6. El impacto de la dieta materna también se ha demostrado en estudios clínicos donde se han descrito volúmenes cerebrales más pequeños y niveles de metilación alterados7. La teoría de los orígenes del desarrollo de la salud y la enfermedad (DOHaD) sugiere que las posibles enfermedades crónicas están programadas en el útero 8,9, y la dieta materna juega un papel importante.
Este protocolo está diseñado para describir el método para alterar el consumo dietético de 1C en ratones hembra antes del embarazo, con el propósito de examinar los efectos de la nutrición materna en los resultados de salud de la descendencia.
Protocolo
Este protocolo fue aprobado, y todos los animales fueron utilizados de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Medio Oeste (Protocolo 2983). En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J, de 2 meses de edad (peso corporal, ~20 g). En general, se pueden utilizar ratones hembra en edad reproductiva10. Para garantizar que se eviten los efectos de la camada, es necesario utilizar varias hembras para cada dieta11. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación experimental
- Obtenga una dieta deficiente en ácido fólico o colina de los fabricantes comerciales de alimentos para roedores. Consulte la Tabla 1 para obtener la lista detallada de micro y macronutrientes, incluida la cantidad exacta de ácido fólico o colina necesaria en dietas deficientes.
NOTA: También se debe solicitar una dieta de control correspondiente; los detalles se enumeran en la Tabla 1. Estas dietas se basaron en AIN93G y contenían los nutrientes recomendados para roedores10. - En colaboración con el fabricante, determine la coloración de las dietas, ya que esto puede ayudar a la distribución de dietas correctas durante los estudios experimentales. En este estudio se utilizó el verde para las dietas deficientes en ácido fólico, el amarillo para la colina y el blanco para la dieta de control. Todos ellos son fácilmente distinguibles.
NOTA: No hay restricciones en el consumo de agua. El agua no contiene ácido fólico, colina u otros metabolitos 1C.
2. Inducir deficiencia dietética de ácido fólico o colina
- Antes de poner a las hembras a dieta, pesa a todos los animales. Esto se denominará peso de referencia.
- Dependiendo de la configuración individual de la jaula de laboratorio (ventilada o sin ventilación, consulte la tabla de materiales), reemplace o rellene los pellets de dieta especial para cada jaula varias veces a la semana. No llene en exceso los aros de comida de jaula con dietas especiales, ya que esto puede provocar el deterioro de los gránulos una vez que interactúan con la saliva de los animales y estropearse con el tiempo.
NOTA: Asegúrese de que el caldo dietético se almacene según las pautas del fabricante y se use antes de la fecha de vencimiento. - Mantenga a los ratones hembra en las dietas durante 4-6 semanas antes del apareamiento.
- Introduce a los ratones machos en las jaulas de las hembras para que se apareen. Asegúrese de que los machos se introduzcan en las jaulas de las hembras después de que las hembras hayan estado en dietas especiales durante un mínimo de 4 a 6 semanas. Introduzca un macho en una jaula para hembras durante uno o varios días.
NOTA: En el presente estudio, los machos se mantuvieron con las hembras durante toda la duración del experimento (~ 4 meses) para aumentar el número de crías producidas, ya que el apareamiento en ratones puede ocurrir después del nacimiento12. Las hembras después de los 6 meses de edad no se utilizaron para ningún estudio. - Revise diariamente a los ratones hembra en busca de un tapón copulatorio, lo que indica que se ha producido la reproducción.
- Recopile las medidas de peso de los ratones hembra cada semana para realizar un seguimiento de su estado de salud y embarazo.
NOTA: Es seguro que las hembras se mantengan en la dieta durante el embarazo (~ 21 días) y la lactancia (~ 21 días). - Cuando las crías se destetan de la madre (~ 21 días después del nacimiento), colóquelas en una dieta deficiente en ácido fólico y colina, así como en una dieta de control. Para obtener más información, consulte la sección de resultados.
NOTA: Al estudiar el impacto de la dieta materna en los resultados de salud de la descendencia, se recomienda que las crías se coloquen en una dieta de control después del destete. La dieta de control debe contener cantidades adecuadas de vitaminas y nutrientes para la supervivencia. - Al final del estudio (determinación de los pesos semanales para controlar la salud general de las hembras mantenidas con dietas deficientes en ácido fólico o colina), se practica la eutanasia de las madres con una sobredosis de CO2 (dosis, 10%-30% de desplazamiento de volumen por minuto, siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) y se recogen los tejidos (paso 3) para confirmar las deficiencias dietéticas.
3. Recolección de tejido para las mediciones de 1C y los metabolitos relacionados
NOTA: Al sacrificar animales, es importante asegurarse de que los animales no respondan a un pellizco en el dedo del pie. Una vez que los animales no responden, puede comenzar la disección de los tejidos. El tejido que se va a diseccionar debe determinarse de antemano 13,14 y los materiales deben estar preparados. Estos materiales incluyen tubos para almacenamiento, herramientas de disección apropiadas y hielo seco o nitrógeno líquido.
- Recolectar sangre y tejidos hepáticos siguiendo los protocolos previamente publicados15,16.
- Recoja ~ 500-1000 μL de sangre mediante una punción cardíaca siguiendo los pasos a continuación. Para más detalles, véase Parasuraman et al.17:
- Haz un corte en forma de V a través de la piel y la pared abdominal. Separe los órganos abdominales e inserte una aguja a través del diafragma hasta el corazón para recoger la muestra de sangre.
- Coloque las muestras de sangre en tubos recubiertos con EDTA. El tubo se puede dejar a temperatura ambiente hasta que se hayan recogido todas las muestras.
- Centrifugar las muestras de sangre en una centrífuga a 1000-2000 x g durante 7 min a 4 °C para aislar el plasma sanguíneo. Recoja el plasma en un tubo de microfuga de 1,5 ml y luego guárdelo a -80 °C hasta el análisis.
- Para extirpar el hígado, se abre el abdomen y se disecciona todo el hígado siguiendo el protocolo previamente publicado15.
- Después de extraer el hígado de la cavidad corporal, corte el tejido en trozos más pequeños con una tijera pequeña y congélelos con hielo seco o nitrógeno líquido.
NOTA: Los trozos de tejido congelados pueden colocarse en un tubo de microcentrífuga criogénica de 1,5 ml y mantenerse a -80 °C hasta el análisis.
- Después de extraer el hígado de la cavidad corporal, corte el tejido en trozos más pequeños con una tijera pequeña y congélelos con hielo seco o nitrógeno líquido.
- Recoja ~ 500-1000 μL de sangre mediante una punción cardíaca siguiendo los pasos a continuación. Para más detalles, véase Parasuraman et al.17:
Resultados
El objetivo de este estudio fue investigar el impacto de las deficiencias dietéticas maternas sobre el ácido fólico o la colina en los resultados de salud de la descendencia. Se determinaron los pesos semanales para monitorear la salud general de las hembras mantenidas con dietas deficientes en ácido fólico o colina. En nuestro trabajo previo, no se observaron cambios en el peso corporal entre los grupos dietéticos maternos4. La Figura 1 muestra los pesos basales y semanales de las hembras mantenidas con dietas de control, colina o deficiencia de ácido fólico durante las cuatro semanas previas al apareamiento (F (1.144,4.577) = 11.96, p = 0.196). Una observación general que se hace es que el número de crías en estas dietas especiales se reduce en el número de crías en comparación con la comida estándar de ratón. No se ha determinado que esto sea estadísticamente significativo.
Cuando los ratones hembra son alimentados con dietas deficientes en 1C, ya sea ácido fólico o colina, hay cambios en los metabolitos dentro de los tejidos corporales que procesan 1C. Las mediciones de 1C y metabolitos relacionados se pueden tomar utilizando una variedad de técnicas. En el presente estudio se utilizó cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC), como se describió anteriormente12. Se presentan las mediciones de 1C tanto en hígado (Tabla 2) como en plasma (Tabla 3) para homocisteína total, S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH), metionina, cistationina, betaína y colina. Existen diferentes formas de medir estos metabolitos; LC-MS es solo una vía.
Los datos presentados en la Tabla 2 y la Tabla 3 muestran algunos cambios menores en los niveles de metabolitos. Las mediciones actuales se tomaron cuando las hembras se apareaban con dietas durante 6 meses. Podría ser mejor medir los metabolitos después de 4 semanas o después de una o dos rondas de embarazos. Los datos del hígado y el plasma se analizaron utilizando ANOVAs de un factor y software estadístico y gráfico. Cualquier efecto significativo de la dieta ANOVA con las comparaciones por pares de Tukey, así como las comparaciones por pares entre la dieta de control y las dietas deficientes en ácido fólico o colina.
Figura 1: Peso corporal de ratones hembra mantenidos con dietas suficientes en un solo carbono y deficientes. Pesos corporales de ratones hembra antes de comenzar dietas especialmente formuladas (línea de base) y luego pesos semanales durante 4 semanas en control (CD), así como dietas deficientes en ácido fólico (FADD) y colina (ChDD). Los datos se presentan como media + error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Metabolismo de un carbono y funciones biológicas relacionadas (metilación y síntesis de nucleótidos). Las enzimas están indicadas en círculos negros. Abreviaturas: BHMT, betaína homocisteína metiltransferasa; CHDH: colina deshidrogenasa; COMT: catecol-O-metiltransferasa; DHFR: dihidrofolato reductasa; dTMP: monofosfato de desoxitimidina; dTTP: trifosfato de desoxitimidina; dUMP: monofosfato de desoxiuridina; dUTP: trifosfato de desoxiuridina; FR: receptor de folato; MTHFR: metileno hidrofolato reductasa; MTR: metionina sintasa; MTRR: metionina sintasa reductasa; RFC: portador de folato reducido; SAM: S-adenosilmetionina; SAH S-adenosilhomocisteína; y TS, timidilato sintasa. Esta figura es una modificación de Jadavjiet al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Lista de contenidos de micro y macronutrientes en dietas de control del metabolismo de un carbono, ácido fólico, deficiencia de colina. La dieta deficiente en ácido fólico contiene 0,3 mg/kg de ácido fólico. La dieta deficiente en colina contiene 300 mg/kg de tasa de bits de colina. Los valores se enumeran en la tabla con resaltados rojos entre paréntesis. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Concentraciones maternas de metabolitos de un carbono en tejido hepático aislado. Estos datos son una adaptación de Hurley et al.4. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Concentraciones maternas de metabolitos de un carbono en plasma aislado. Estos datos son una adaptación de Hurley et al.4. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Discusión
Durante la implementación de este protocolo en los laboratorios de investigación, hay varias notas importantes que los investigadores deben tener en cuenta antes de comenzar los experimentos. En primer lugar, en la fabricación de dietas, es necesario dar suficiente tiempo de antelación para fabricar la dieta antes del inicio del estudio experimental. Los plazos de entrega pueden variar de una empresa a otra, y también hay que tener en cuenta el envío de la dieta. Los ratones hembra que están en edad reproductiva (~2-2,5 meses de edad) se pueden poner en la dieta 4-6 semanas antes del apareamiento 4,6,14. En estudios previos solo se han utilizado ratones C57Bl/6J 4,5,6,18, pero otros grupos han utilizado ratones BALB/c en estudios similares 19,20,21.
La dieta manufacturada utilizada en este estudio contiene un 1% de succinilsulfatiazol para ayudar a reducir la síntesis de folato por parte de la flora intestinal; Esta es otra razón por la que se necesita utilizar una dieta de control, ya que contiene los mismos antibióticos que están presentes en las dietas deficientes. Una vez que la dieta ha sido fabricada y enviada, su almacenamiento es vital. Es importante seguir las instrucciones del fabricante para que la dieta pueda durar todo el tiempo que dure el estudio experimental. Es importante tener en cuenta que la comida estándar para ratones está formulada con niveles elevados de ácido fólico y colina para apoyar el embarazo y la salud general de las colonias de ratones. Por lo tanto, es necesario utilizar una dieta de control en estudios dirigidos principalmente a explorar los efectos de la deficiencia de ácido fólico y/o colina. Para este tipo de estudios experimentales, se recomienda obtener dietas de control de los fabricantes con la cantidad mínima recomendada de ácido fólico (2,0 mg/kg) o tasa de bits de colina (1150 mg/kg)10 (Tabla 1).
Además, aún no se ha probado la combinación de la deficiencia de ácido fólico y colina en las mujeres. Tanto el ácido fólico como la colina son importantes donantes de metilo, y existe una gran demanda de ellos durante el embarazo para la descendencia en desarrollo. Trabajos previos han demostrado que el metabolismo del folato y la colina están estrechamente relacionados con la función cerebral normal16,17. Esto también ha sido demostrado por otros en otros tejidos18,19. Se desconoce si una dieta deficiente en ácido fólico y colina produciría descendencia viable.
Al considerar el diseño experimental, es importante tener en cuenta que se ha reportado que las deficiencias dietéticas en 1C en machos impactan negativamente en los resultados de salud de la descendencia11. Este es un punto importante a tener en cuenta cuando se coloca a los machos en jaulas con hembras que se alimentan con una dieta deficiente en ácido fólico o colina. En este momento, el impacto de la deficiencia dietética a corto plazo en los hombres sigue siendo desconocido.
El éxito de la cría de ratones puede presentar desafíos en el progreso experimental. Se recomienda consultar al personal de cuidado de animales de la institución o a la literatura, incluidos los proveedores que crían ratones con éxito. Pesar a las hembras semanalmente ayudó a controlar la progresión del embarazo.
El impacto a largo plazo de las deficiencias maternas de 1C durante el embarazo en los resultados de salud de la descendencia requiere más investigación 4,14. Este protocolo ha descrito cómo inducir deficiencias dietéticas maternas de ácido fólico o colina en un modelo de ratón, así como cómo confirmarlo. Para determinar otros marcadores potenciales de deficiencias dietéticas de ácido fólico o colina, se debe consultar la Figura 2 18. Este modelo experimental facilita el estudio de las deficiencias dietéticas maternas de ácido fólico o colina durante el embarazo y la lactancia en los resultados de salud de la descendencia a largo plazo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 mL Ratones | hembra Eppendorf | ||
| C57BL/6 Charles | River | 27 | Los ratones también se pueden criar en casa. |
| Dieta deficiente en colina | Envigo | TD.06119 | |
| Dieta de control | Envigo | TD.190790 | |
| Tubos de EDTA | |||
| ácido fólico | Envigo | TD.01546 | |
| Prisma | https://www.graphpad.com/features | ||
| Carcasa para roedores | Lab Products, LLC | One JaulaRacks ventilados & Jaulas | |
| Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) | SCIEX, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, EE. UU. | Nexera |
Referencias
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