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Uso de la administración de fármacos guiada por micropipetas como método alternativo a la sonda nasogástrica oral en modelos de roedores

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DOI:

10.3791/66836

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26 de julio de 2024

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1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos la administración de fármacos guiada por micropipeta (MDA) como un método alternativo a la sonda nasogástrica oral que incentiva al animal de investigación a ingerir tratamientos fácilmente con un mínimo de estrés e incomodidad.

Resumen

La sonda nasogástrica oral (OG) con el uso de una cánula conectada a una jeringa es uno de los métodos más comunes utilizados para administrar una dosis precisa de compuestos al estómago de los animales de investigación. Desafortunadamente, este método presenta dificultades tanto para el operador como para el animal de investigación. Los estudios han demostrado que la OG puede provocar complicaciones, como esofagitis, perforación del esófago y administración inadvertida de fármacos traqueales. Además, la OG se asocia con un aumento de los niveles plasmáticos y fecales de corticosterona (debido al estrés), alteración de la presión arterial y aumento de la frecuencia cardíaca, lo que podría influir negativamente o sesgar los resultados del estudio. Un método alternativo desarrollado anteriormente, denominado administración de fármacos guiada por micropipetas (MDA), incentiva al animal a consumir tratamientos fácilmente de una manera mínimamente invasiva. En este trabajo, presentamos ejemplos del uso de la técnica MDA con tratamientos reconstituidos en diferentes vehículos y demostramos la administración efectiva de los variados tratamientos a múltiples cepas de ratones diferentes. Además, demostramos que el MDA es una técnica que disminuye el momento y la invasividad de la administración de fármacos y no afecta a la composición del microbioma intestinal evaluada mediante el análisis cuantitativo de las principales especies microbianas intestinales. En general, la MDA puede ofrecer una alternativa menos estresante y eficaz a la OG.

Introducción

La administración de fármacos a modelos de roedores se realiza comúnmente a través de sonda nasogástrica oral (OG), que consiste en administrar una preparación líquida directamente en el estómago utilizando una cánula conectada a una jeringa que contiene la solución. Esta técnica da como resultado una dosificación consistente y precisa del tratamiento para el animal, pero también conlleva múltiples desventajas. La OG ha sido examinada por no modelar adecuadamente las exposiciones dietéticas humanas 1,2. Además, la OG aumenta el riesgo de lesiones no intencionales en el sistema digestivo superior (perforación del esófago y el estómago), aspiración del tratamiento administrado y lesiones del tracto respiratorio3. La OG también se asocia con malestar4, aumento de la presión arterial y la frecuencia cardíaca5, así como estrés 6,7 y, a veces, la muerte8 debido a la disminución de la tolerancia al sonda nasogástrica por parte del animal. Estos cambios fisiológicos pueden interferir o confundir los resultados experimentales; Por lo tanto, se han explorado nuevos procedimientos para evitar estos efectos secundarios. Los estudios han utilizado procedimientos alternativos a la OG, como el uso de gelatina como vehículo farmacológico9, tiras de disolución oral (ODS)10, agujas sonda recubiertas de sacarosa11, tubos de alimentación flexibles, galletas de trigo12, miel13 y gránulos de mantequilla de maní14. Desafortunadamente, existen limitaciones con estas modificaciones en la técnica OG, incluyendo la incompatibilidad con medicamentos insolubles en agua, un tiempo de preparación más largo para el tratamiento15, la palatabilidad y estabilidad del medicamento15, y la familiarización del animal con el alimento. Además, existe la posibilidad de que la dosificación sea menos precisa cuando los animales se alimentan ad libitum.

Scarborough et al.7 desarrollaron previamente un método alternativo de tratamiento oral en ratones, al que denominaron administración de fármacos guiada por micropipetas (MDA). Este método de administración se basa en una solución de leche condensada azucarada como vehículo de sustancias farmacológicas, lo que motiva a los animales de estudio a consumir fácilmente el vehículo preparado y/o las soluciones farmacológicas mediante la dispensación de la solución con una pipeta monocanal y una punta de pipeta. Para introducir esta técnica, los roedores se someten a una sesión de entrenamiento (mínimo 2 días) para acortar los tiempos de manipulación y permitir que el animal de estudio se familiarice con la bebida de la punta de la pipeta4. Los estudios iniciales de validación realizados por Scarborough et al.7 y Schalbetter et al.16 sugieren que el procedimiento MDA es fácil de implementar, rentable, mínimamente invasivo y menos estresante para los animales que los métodos convencionales de sonda nasogástrica oral. Scarborough et al. introdujeron el uso de la técnica MDA en un modelo murino de activación inmune materna (MIA) de trastornos del neurodesarrollo7. Este estudio demostró que los perfiles farmacocinéticos de los ratones tratados con el fármaco antipsicótico risperidona mediante MDA eran comparables al uso de OG. Además, el MDA no indujo un aumento en los niveles de corticosterona (una hormona del estrés) en los ratones, y el tratamiento crónico con risperidona utilizando la técnica de MDA condujo a una disminución dependiente de la dosis en los déficits de interacción social inducidos por MIA y la hipersensibilidad a las anfetaminas7. Estudios adicionales han explorado la eficacia de MDA frente a OG en modelos de ratón17 y rata18 . El MDA también se ha comparado con la inyección intraperitoneal y se ha demostrado que es igual de eficaz en la administración de N-óxido de clozapina a ratones16. Debido al éxito reportado de MDA en la reducción del estrés animal y la eficacia terapéutica, ahora buscamos explorar más a fondo la técnica de MDA como un método efectivo de administración de fármacos utilizando modelos murinos adicionales. Aquí, describimos la implementación del método MDA para tratar diferentes cepas de ratones, incluidas las cepas FVB/NJ y C57BL/6J inmunocompetentes y la cepa inmunocomprometida NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) con diferentes tratamientos orales, incluidas bacterias vivas, compuestos experimentales administrados en soluciones insolubles en agua (aceite de maíz) y controles de vehículos. Evaluamos la actividad y presencia de los diferentes tratamientos en suero y heces, y evaluamos las alteraciones de la microbiota intestinal central en relación con el método MDA.

Protocolo

Todos los estudios en animales se realizaron siguiendo las pautas institucionales y bajo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (IACUC, por sus siglas en inglés) M021M197 y M023M195. Las cepas de ratón utilizadas (ratones machos, de 7 semanas de edad) se describen en la Tabla de Materiales. El uso de ratones machos se debió a su uso en los estudios en curso sobre el cáncer de próstata. El método MDA ha demostrado previamente ser eficaz también en ratones hembra 7,17. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a sus respectivas jaulas/grupos de tratamiento. Los ratones fueron tratados en jaulas y sin ningún orden en particular. El experimentador que administraba los tratamientos estaba ciego al grupo de tratamiento. El número asignado a un ratón se refería a su ID y no al orden en que fueron tratados. Los datos se recogieron a lo largo de la línea de tiempo del estudio y se analizaron al final para evitar cualquier sesgo. Los ensayos experimentales se cegaron al grupo de tratamiento hasta que se recopilaron todos los datos.

NOTA: Este protocolo ha sido modificado de Scarborough et al.7.

1. Preparación de los tratamientos

  1. Prepare una solución de leche condensada azucarada (ingredientes: leche y azúcar) y agua de grado de biología molecular usando una proporción de 3:10 de leche a agua. Mida la leche condensada azucarada con un tubo cónico de 15 mL debido a la viscosidad de la leche.
  2. Usando un tubo cónico de 50 mL, mezcle agua de grado de biología molecular con la leche condensada azucarada mezclando lentamente 5 mL de agua a la vez con la leche.
    NOTA: Este paso se realiza en condiciones estériles utilizando una cabina de bioseguridad.
  3. Preparar las alícuotas de la solución láctea (almacenadas en 500 μL de alícuotas) y almacenar las alícuotas a 4 °C hasta que se combinen con el tratamiento de interés.
  4. Vuelva a suspender los tratamientos en sus respectivos vehículos a la concentración correcta en función del peso corporal del animal antes de combinarlos con la solución de leche condensada/agua azucarada.

2. Sesión de formación MDA

NOTA: En esta sección se describen los modelos de ratón; sin embargo, la técnica MDA podría ampliarse según sea necesario con volúmenes/puntas de pipeta más grandes para modelos de roedores más grandes.

  1. OPCIONAL: Sujete suavemente al animal de estudio sosteniendo el pescuezo con una mano.
  2. Ofrecer al animal de estudio 100 μL de solución de agua y leche condensada azucarada únicamente (sin la adición del tratamiento experimental) utilizando una pipeta monocanal y una punta de pipeta de 200 μL que se guía hasta la boca.
  3. Dispense la solución de leche/agua lentamente para evitar que no llegue a la boca del animal. Asegúrese de que el animal consuma fácilmente la solución láctea entre 5 y 15 s.
    NOTA: Este entrenamiento se realiza durante un mínimo de 2 días consecutivos (una sesión de entrenamiento por día), sin cambios en el volumen administrado. Se necesitó una sujeción suave por el pescuezo para las sesiones de entrenamiento de MDA. Scarborough et al.7 recomiendan la sujeción total del animal el primer día de entrenamiento de MDA y luego la sujeción por la cola el segundo día. El método de sujeción puede diferir para los modelos de roedores más grandes. Por el contrario, Vanhecke et al.17 solo sujetaron a los ratones ligeramente por la cola durante el entrenamiento.

3. Tratamientos con ratones mediante el método MDA

  1. Combine el tratamiento del estudio con la solución de leche condensada azucarada/agua (véanse ejemplos con experimentos de validación [sección 4 y sección 5] a continuación).
  2. OPCIONAL: Sujete suavemente al animal de estudio sosteniendo el pescuezo con una mano.
    NOTA: Scarborough et al.7 informan que los ratones ya no requieren restricción más allá del período de entrenamiento y beberán fácilmente de la punta de la pipeta. En contraste, Vanhecke et al.17 informan que para algunos tratamientos (por ejemplo, tamoxifeno) que podrían tener una leve aversión al sabor, la MDA se realiza mejor sujetando suavemente a los ratones mediante un pescuezo durante todos los tratamientos. Este estudio también determinó que colocar al animal boca arriba con un pescuezo suave mejora el tiempo y la eficacia del consumo del tratamiento.
  3. Administrar 100 μL de tratamiento utilizando una pipeta monocanal y una punta de pipeta de 200 μL guiada hasta la boca del animal, tal y como se realiza durante las sesiones de entrenamiento.
  4. Trata a un solo animal a la vez.
  5. Vuelva a colocar a cada animal en su jaula respectiva después del tratamiento.
    NOTA: Los tratamientos con el método MDA pueden administrarse diariamente o de forma repetida 7,17.

4. Experimento de validación #1 - administración oral de bacterias intestinales a ratones usando MDA

NOTA: Esta sección describe el uso del método MDA para administrar bacterias vivas por vía oral para estudios de colonización intestinal en ratones. En este experimento piloto representativo, la bacteria grampositiva Clostridium scindens se administra a ratones C57BL/6J. Los ratones fueron tratados con antibióticos (cefoxitina) durante dos días consecutivos en el agua potable antes de la inoculación bacteriana con MDA.

  1. Cultivo bacteriano
    1. Cultivo de la cepa ATCC 35704 de C. scindens en caldo clostridial reforzado (RCB) utilizando un caldo de glicerol congelado para inocular 500 μL de bacterias en un tubo RCB de 7 mL. Crece anaeróbicamente durante la noche a 37 °C.
    2. Utilice 500 μL del cultivo de bacterias durante la noche para inocular un nuevo tubo RCB e incube anaeróbicamente durante 24 h. Retire este tubo de la cámara anaeróbica y utilícelo para preparar el tratamiento bacteriano para la MDA. Utilice este mismo tubo para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL).
  2. Cálculo de C . scindens UFC/mL
    1. Cree una dilución 1:3 del cultivo de C. scindens utilizando 3,5 mL del cultivo inoculado en 7 mL de medio RCB. Utilice una muestra de esta dilución para hacer un caldo de glicerol al 20% 1 mL (1:1) que se almacena a -80 °C.
    2. Placa de 100 μL de la dilución 1:3 en placas de agar clostridial reforzado (RCA). Utilice la primera dilución para luego hacer diluciones en serie posteriores y emplatar un total de tres veces más.
    3. Después de la incubación de las placas RCA, cuente las colonias y calcule la UFC. Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración de células bacterianas en las muestras diluidas y originales:
      UFC en muestra diluida (células/mL) = (número de colonias contadas en la placa RCA)/(cantidad de muestra diluida añadida a la placa RCA en mL)
      UFC en la muestra original (células/mL) = (UFC en la muestra diluida)/(dilución de la placa RCA)
  3. Preparación del tratamiento de C. scindens para la MDA
    1. Combine una solución de 50 μL (1.265 x 106 UFC/mL en este ejemplo) de C. scindens + 50 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada.
      NOTA: Si se necesita una UFC específica, se puede utilizar un método alternativo de cuantificación de células bacterianas, como la creación de una curva estándar con mediciones de densidad óptica (OD) a 600 nm.
  4. Tratamiento oral de ratones con C. scindens mediante MDA
    1. En los días 1-3, familiarice a los ratones con la solución láctea como se describe en la sección 2 (sesión de entrenamiento MDA).
    2. El día 4, administre 100 μL de C. scindens + solución de leche o PBS (control) + solución de leche a través de MDA a ratones C57BL/6J. Trate a los ratones una vez durante la duración del estudio.
  5. Recogida de muestras fecales
    1. Sujete al ratón por un pescuezo suave y espere a que descargue una bolita fecal. Recoja los gránulos fecales directamente del recto en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Almacene las muestras a -80 °C hasta su uso.
  6. PCR cuantitativa de C. scindens (qPCR)
    1. Realizar la extracción de ADN fecal utilizando un protocolo previamente publicado19,20.
    2. Determine la concentración de ADN utilizando un fluorómetro de ADN para la detección de alta sensibilidad. Normalice las muestras de ADN a 10 ng/μL y almacene a -20 °C hasta su uso.
    3. Utilice la qPCR para investigar la abundancia de: (i) bacterias C. scindens utilizando cebadores conservados contra el gen desA de la cepa ATCC 35704 de C. scindens, (ii) bacterias totales utilizando cebadores diseñados contra la región hipervariable V6 del gen bacteriano 16S rRNA como se ha descrito anteriormente20,21.
      NOTA: Las condiciones de qPCR y los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. Se utilizó una curva estándar utilizando el ADN de la cepa ATCC 35704 de C. scindens para estimar las copias de la bacteria desA+.

5. Experimento de validación #2 - administración experimental de fármacos a ratones utilizando MDA

NOTA: Esta sección describe el uso del método MDA para administrar un compuesto experimental a ratones. En este experimento piloto representativo, el metabolito de soja equol (S-equol) se administra a ratones NSG y FVB/NJ.

  1. Preparación del tratamiento con S-equol
    NOTA: Tanto el S-equol como el dimetilsulfóxido (DMSO) se alícutras y se almacenan a -20 °C hasta su uso.
    1. Reconstituir S-equol en DMSO combinado con aceite de maíz (90%). Mezcle S-equol alícuota en aceite de maíz (220 μL) con 480 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada. Combine y mezcle esta solución en la habitación del animal para evitar la separación del aceite de la leche.
      NOTA: Si se observa la separación de la solución, mezcle la solución antes del tratamiento. La dosis de S-equol administrada es de 25 mg/kg/día. Los ratones utilizados en este estudio tenían un peso similar, por lo que recibieron la misma dosis. Es posible que sea necesario ajustar la dosis del tratamiento y convertirla en múltiples preparaciones en función del peso de los animales del estudio.
    2. Combine el vehículo DMSO con aceite de maíz (90%). Mezcle DMSO alícuota en aceite de maíz (220 μL) con 480 μL de la solución de leche condensada/agua azucarada. Combine y mezcle esta solución en la habitación del animal para evitar la separación del aceite de la leche.
      NOTA: Si se observa la separación de la solución, mezcle la solución antes del tratamiento.
  2. Tratamiento oral de ratones con S-equol mediante MDA
    1. En los días 1 y 2, familiarice a los ratones con la solución láctea como se describe en la sección 2 (sesión de entrenamiento MDA).
      NOTA: Para el experimento de validación #1, se siguió el tiempo de entrenamiento descrito en Scarborough et al., lo que sugirió un tiempo de aclimatación de 3 días. En este experimento, se probó un tiempo de entrenamiento más corto (2 días), y se encontró que no alteraba la administración de los tratamientos de interés.
    2. En los días 3 a 43, trate a los ratones con (i) control de PBS, (ii) vehículo DMSO o (iii) S-equol, todo combinado con la solución de leche condensada/agua azucarada. Hacer una mezcla maestra de la solución para entregar una solución homogénea de los tratamientos a todos los animales de estudio. Administrar un volumen total de 100 μL a cada ratón una vez al día, 5 días a la semana, durante un total de 43 días.
  3. Extracción de sangre
    1. Recolectar sangre después de la eutanasia (sobredosis de dióxido de carbono) a través de una punción cardíaca. Transfiera la sangre a un tubo separador de suero microtainer, mezcle y almacene a temperatura ambiente (RT) hasta su posterior procesamiento.
    2. Centrifugar la muestra de sangre hasta completar la separación a 254 x g durante 5 min. Recoja el suero (capa superior de separación) y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
  4. Cromatografía líquida S-equol con ensayo de espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS)
    1. Consulte el archivo de la Tabla de Materiales para conocer los productos químicos y reactivos utilizados para este experimento.
    2. Patrones de calibración y control de calidad: Preparar soluciones madre de S-equol y patrón interno (equol racémico-d4) en DMSO a concentraciones de 1 mg/mL y almacenar a -20 °C.
    3. Diluir las soluciones patrón madre con acetonitrilo:agua (50:50) para preparar una solución de trabajo mixta con diferentes concentraciones. Prepare el patrón interno en acetato de etilo como solución de extracción a una concentración de 100 ng/mL. Almacene el caldo y las soluciones de trabajo a 4 °C y utilícelo a diario, diluido o directamente.
    4. Extracción de muestras
      1. Preparar la muestra utilizando precipitación de proteínas por solución de extracción (acetato de etilo más patrón interno, ver sección 5.4.3), seguida de centrifugación y evaporación del sobrenadante bajo nitrógeno seco (50 °C).
      2. Reconstituya la muestra en 100 μL de acetonitrilo al 50% y transfiérala a viales de muestreador automático para el análisis LC/MS/MS.
    5. Separación de muestras
      1. Logre la separación con una columna C18, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Utilice ácido fórmico al 0,1% como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo fase móvil B.
      2. Utilice un gradiente y mantenga la fase móvil B al 40% con un caudal de 0,3 mL/min durante 0,5 min. Luego, aumente el caudal al 100% durante 1 minuto, manténgalo allí durante 2 minutos y luego vuelva al 40% B durante 1 minuto.
      3. Monitoree el efluente de la columna usando un detector de espectrometría de masas que usa ionización por electrospray, que está operando en modo negativo. Programe el espectrómetro para monitorear las siguientes transiciones de monitoreo de reacción múltiple (MRM): 241 → 119.1 para S-equol y 245 → 123 para el estándar interno, equol-d4.
      4. Calcule la curva de calibración para S-equol utilizando el pico de la relación de área del análisis con el estándar interno utilizando una ecuación cuadrática con una función de ponderación de 1/x2 utilizando los rangos de calibración de 5-500 ng/mL.

6. Medición del efecto del tratamiento con MDA en la microbiota intestinal central

NOTA: En esta sección se describe el uso de la qPCR para medir los niveles de microbiota intestinal central después del tratamiento con MDA.

  1. Realice la recolección de muestras fecales y la extracción de ADN como se describe en los pasos 4.5.1 y 4.6.1.
  2. Determine la concentración de ADN utilizando un fluorómetro de ADN para la detección de alta sensibilidad. Normalice las muestras de ADN a 10 ng/μL y almacene a -20 °C hasta su uso.
  3. Utilice la qPCR para investigar la abundancia de miembros de la microbiota intestinal: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. y (v) bacterias totales utilizando cebadores diseñados contra la región hipervariable V6 del gen de ARNr bacteriano 16S descrito anteriormente 20,21,22.
    NOTA: Las condiciones de qPCR y los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 2.

Resultados

El MDA se puede utilizar en la administración oral de cepas bacterianas en modelos de ratón. Los ratones C57BL/6J fueron tratados con antibióticos (cefoxitina en el agua potable) durante 2 días para eliminar las comunidades microbianas comensales antes de comenzar la sesión de entrenamiento de MDA. La solución de leche condensada/agua azucarada se administró una vez al día consecutivamente durante 3 días antes de la administración del tratamiento. Los ratones fueron inmovilizados brevemente por un suave pescuezo durante la administración del tratamiento con MDA. En el día 4, los ratones fueron tratados una vez con PBS (control negativo, n = 4) o un cultivo anaeróbico de C. scindens (bacteria desA+, n = 4) que previamente se resuspendió en la solución de leche condensada/agua azucarada. Por lo general, todos los ratones tomaron los tratamientos en cuestión de segundos y bebieron la dosis completa (100 μL). Para validar la administración y presencia de las bacterias anaerobias, comparamos las muestras fecales recolectadas después del tratamiento con antibióticos con las muestras fecales recolectadas 24 h después del tratamiento con PBS o C. scindens (Figura 1). El ADN fecal se aisló, cuantificó y normalizó a 10 ng/μL para realizar qPCR utilizando cebadores específicos del gen desA ATCC 35704 de C. scindens (Tabla 1). Observamos que los ratones tratados con antibióticos tenían una cantidad mínima o ninguna bacteria desA+. Como era de esperar, observamos una cantidad sustancialmente mayor de bacterias desA+ en los ratones tratados con C. scindens, que fue significativamente diferente de los del grupo control PBS (p = 0,0286, Figura 1).

Entrega de un compuesto experimental (S-equol) utilizando el método MDA. Los ratones NSG (n = 15) y FVB/NJ (n = 18) se sometieron a entrenamiento con la solución de leche condensada/agua azucarada dos días antes de la administración del tratamiento. Los ratones NSG se sometieron a un tratamiento con antibióticos (cefoxitina en el agua potable) para eliminar las bacterias intestinales productoras de equol y, por lo tanto, la producción endógena de equol. Los ratones FVB/NJ fueron alimentados con una dieta libre de soja para eliminar la producción endógena de equol. Todos los ratones fueron inmovilizados brevemente por un suave pescuezo para administrar los tratamientos. El grupo de control recibió la solución de leche condensada/agua azucarada en combinación con aceite de maíz, el grupo DMSO (control de vehículo para S-equol) recibió la solución de leche condensada/agua azucarada y DMSO en aceite de maíz, y el grupo equol recibió leche condensada/solución de agua azucarada y equol en aceite de maíz. Los ratones fueron tratados cinco días a la semana con la técnica MDA durante un total de 43 días. Por lo general, los ratones tomaron los tratamientos en cuestión de segundos y bebieron la dosis completa (100 μL). En general, todos los ratones consumieron al menos la mitad de la dosis en un día en particular (dosis parcial en un día en particular, pero dosis completa el día anterior o el día siguiente). Ninguno de los ratones rechazó el tratamiento por completo durante el transcurso del estudio. Observamos que después del desaliñado, la colocación de los ratones boca arriba mejoró el tiempo de consumo del tratamiento y aseguró que el animal tomara la dosis completa.

Los niveles de equol circulantes demuestran una administración efectiva del fármaco MDA. Se tomaron muestras de sangre de los ratones NSG después de la eutanasia al final del estudio para validar que la administración de MDA de equol condujo a niveles circulantes de equol en los animales del estudio. No recuperamos suficiente sangre de uno de los ratones tratados con equol para realizar el ensayo LC/MS/MS. Los niveles séricos de equol se midieron por LC/MS/MS en el Recurso Compartido de Farmacología Analítica de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. No observamos equol circulante en los grupos control y DMSO (vehículo de equol), mientras que los ratones tratados con equol tenían equol circulante detectable (Figura 2). Es importante destacar que esperamos alguna variación en los niveles circulantes de equol en los ratones tratados con equol debido a las diferentes fechas y horas de sacrificio de animales en este experimento.

Las comunidades microbianas intestinales permanecen inalteradas después del tratamiento con MDA. Se evaluó el efecto de la solución láctea de MDA (con y sin equol) sobre la microbiota intestinal con ratones FVB/NJ. Se cuantificó la composición microbiana de las muestras tomadas al inicio del estudio (sin tratamientos/sin MDA) y las muestras tomadas 7 días después del inicio del tratamiento (9 días después del inicio del MDA, incluidos los días de entrenamiento). No observamos cambios significativos en la carga bacteriana total ni en la composición microbiana global de la microbiota intestinal central (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) evaluados mediante análisis de qPCR específicos de cada especie (Figura 3) como se ha descrito anteriormente21,22. Una jaula mostró una diferencia significativa en Lactobacillus entre el inicio y después del tratamiento con MDA; sin embargo, este hallazgo se observó en el control de vehículos DMSO y no fue consistente en todas las jaulas.

figure-results-1
Figura 1: La MDA suministra bacterias anaeróbicas al intestino del ratón que se pueden cuantificar mediante qPCR fecal. Los ratones C57BL/6J fueron tratados con antibióticos durante dos días consecutivos en el agua potable. A continuación, los ratones fueron tratados con la bacteria anaerobia C. scindens utilizando el método MDA. La carga bacteriana fecal de C. scindens (desA+) se midió mediante qPCR para el gen desA tanto después del tratamiento con antibióticos como 24 h después del tratamiento con MDA (PBS o C. scindens). (A) Se muestra la cuantificación del gen desA específico de C. scindens entre ratones tratados con PBS y C. scindens después del tratamiento con antibióticos y 24 h después del tratamiento con MDA. (B) Los mismos datos que se muestran para 24 horas después de la MDA en (A) se muestran como un gráfico de columnas. La significación estadística se determinó mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney. (*) p = 0.0286, barras de error = SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análisis de los niveles de equol circulante en ratones NSG tratados con equol mediante la técnica MDA. Los niveles séricos de equol se cuantificaron mediante LC/MS/MS en ratones tratados con control (n = 5), DMSO (vehículo, n = 5) y equol (n = 4). No se recuperó suficiente sangre de uno de los ratones tratados con equol para realizar LC/MS/MS. Estos tratamientos se administraron utilizando el método MDA. El equol sérico solo fue detectable en el grupo tratado con equol. Límite de cuantificación < 5 ng/mL. La significación estadística se determinó mediante un ANOVA unidireccional no paramétrico con comparaciones múltiples (corrección de Dunn). (**) p = 0.0053, barras de error = SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Las bacterias intestinales centrales y los niveles de carga bacteriana total no han cambiado en los ratones FVB/NJ después del tratamiento con MDA. No se observaron cambios significativos en los valores de Cq de qPCR para las comunidades microbianas objetivo antes y después de la administración del tratamiento mediante el método MDA. Lactobacillus mostró una diferencia significativa (*, p = 0,0321) solo en la jaula 3 entre el tratamiento basal y el tratamiento con MDA. Este hallazgo no fue consistente entre las jaulas. Los números de jaula están marcados como C1-C4. La significación estadística se determinó mediante un ANOVA de un factor con comparaciones múltiples (corrección de Tukey). Barras de error = SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre del cebadorSecuencias de cebadoresCondiciones de PCR
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93 °C 3 min, 34 ciclos (95 °C 30 s, 54 °C 30 s)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCGTTTCTG-3'

Tabla 1: Cebers y condiciones de qPCR para la bacteria desA+ (C. scindens).

Nombre del cebadorSecuencias de cebadoresCondiciones de PCR
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 min
36 ciclos
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 ciclos
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95 °C, 3 min
36 ciclos
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5'-CACGCCATGGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 min
44 ciclos
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 ciclos
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

Tabla 2: Cebadores y condiciones de qPCR utilizadas para medir el efecto del MDA en la microbiota intestinal central.

Discusión

La OG puede ser una fuente significativa de estrés en animales de investigación que puede crear una variable de confusión, como se evaluó previamente en múltiples estudios 7,9,11,12,13,14,15,23. Debido a la invasividad de la OG, se han empleado técnicas alternativas para minimizar los desafíos asociados con OG 9,10,12,13,14,15. La administración de fármacos guiada por micropipetas (MDA) es una técnica novedosa que permite la administración de fármacos de una manera menos invasiva utilizando una pipeta de un solo canal y una mezcla del fármaco de interés con una solución de leche condensada azucarada7. Un paso crítico para esta técnica es la sesión de entrenamiento (mínimo 2 días) que permite que el animal se familiarice más con la punta de la pipeta y el sabor de la leche condensada azucarada, y en general acorta los tiempos de manejo y la angustia. Esta sesión de entrenamiento también permite a los ratones consumir fácilmente los medicamentos incorporados en la solución de leche condensada azucarada mucho más rápido que otras técnicas y con una dosis precisa.

Nuestros estudios siguieron de cerca las preparaciones y la administración de la solución de leche condensada azucarada/agua presentada en Scarborough et al.7. Durante el estudio, no se privó a los ratones de agua o comida antes de la dosis. Se mantuvieron en sus respectivas jaulas de alojamiento y el tiempo de los tratamientos fue de menos de 1 minuto. Una diferencia clave en nuestros estudios fue que, posiblemente debido al potencial de discapacidad visual en las cepas de ratones albinos que utilizamos y el potencial de ligera aversión al sabor con el tratamiento farmacológico, todos los ratones requirieron una breve restricción mediante un suave deslizamiento como parte del protocolo de entrenamiento y tratamiento. Esta modificación de los tratamientos con MDA es recomendada por Vanhecke et al.16. El suave pescuezo, junto con la colocación de los ratones sobre sus espaldas, animó a los ratones a consumir ansiosamente la solución láctea. Se concluye que la necesidad de un desaliño suave como parte de los pasos de entrenamiento y tratamiento es opcional y dependerá del estudio. La administración de los tratamientos (corregidos por el peso corporal del animal, según corresponda) se administró en un volumen estandarizado, y los ratones no mostraron cambios en el comportamiento. Otras ligeras modificaciones con respecto al estudio inicial7 fueron la disminución del número de sesiones de entrenamiento y de los volúmenes administrados en cada sesión. Algunas de las limitaciones que encontramos en este estudio incluyen la resistencia de algunos ratones a beber la dosis completa (100 μL) de la solución láctea el primer día de entrenamiento y en momentos durante el estudio. Esto se superó colocando a los ratones boca arriba mientras estaban sujetos. Este estudio no evaluó la interacción del fármaco con la solución de leche condensada azucarada, las diferencias en el consumo entre los sexos de ratón (aunque el MDA ha demostrado previamente ser eficaz también en ratones hembra 7,17), o la elevación de los marcadores de estrés, como los niveles de corticosterona 7,11,14, asociados a la OG.

En este estudio, nos centramos en la capacidad de la técnica MDA para administrar una dosis precisa de un tratamiento experimental y luego evaluamos los niveles fecales y/o circulantes de los tratamientos de interés en los animales del estudio. Asimismo, evaluamos si el tratamiento con MDA altera la microbiota intestinal y observamos alteraciones mínimas o nulas en la microbiota fecal central o en la carga bacteriana fecal total de los animales del estudio. Tampoco observamos lesiones en los animales debido al tratamiento con MDA. En conclusión, el MDA puede servir como un método alternativo de administración de tratamiento a corto y largo plazo en modelos de roedores. En general, el MDA puede tener un impacto positivo en el bienestar animal al reducir el riesgo de lesiones asociadas a la OG. La MDA supera algunas de las limitaciones de otras técnicas y proponemos que puede ser ampliamente utilizada en la investigación traslacional en muchos modelos diferentes de roedores24.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer el apoyo a la investigación del Premio del Programa de Investigación del Cáncer de Próstata del Departamento de Defensa W81XWH-20-1-0274 y el Premio Challenge de la Fundación del Cáncer de Próstata 16CHAL13. Nos gustaría agradecer y reconocer a la Dra. Michelle Rudek, el Dr. Noushin Rastkari, la Dra. Nicole Anders y Linping Xu del Recurso Compartido de Farmacología Analítica de Johns Hopkins por su asistencia con equol LC/MS/MS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
200 y micro; Puntas de pipetaL Mettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 detector de espectrometría de masasSciexN/A
Akkermansia muciniphila cepa muc ADN genómicoType Culture CollectionBAA-835D-5
Acetato de amonioSigma– Aldrich5.43834
ratones C57BL/6J CepaJackson Laboratories000664
C. scindens cepa 35704Colección de cultivos tipo americano35704
CefoxitinSagent NDC25021-109-10
Aceite de maízMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
etanolFisher ScientificAC611050040
Ácido fórmicoSigma– Aldrich5.33002
FVB/NJratones Jackson Laboratories Cepa# 001800
GlicerolSigma– AldrichG5516
HexanoFisher Scientific02-002-996
Agua de grado LC-MSFisher Scientific14-650-357
MetanolFisher Scientific02-003-340
Tubo separador de suero MicrotainerBecton Dickinson02-675-185
Agua de grado de biología molecularCorning46-000-CI
Ratones NSGJackson LaboratoriesStrain # 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic  equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Agar Clostridial reforzadoSistemas AnaerobiosAS-6061
Caldo Clostridial ReforzadoSistemas AnaerobiosAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
S-equol estándar de referencia para LC-MSCayman Chemical 10010173
Single pipeta de canalRainin17008652
Streptococcus salivarius ADN genómicoColección de cultivostipo americano BAA-1024D-5
Leche condensada azucaradaCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3 VSL#3B07WX1LVHL
β-glucuronidasa de Helix pomatiaSigma– AldrichG7017
American de #

Referencias

  1. Vandenberg, L. N., Welshons, W. V., Vom Saal, F. S., Toutain, P. -L., Myers, J. P. Should oral gavage be abandoned in toxicity testing of endocrine disruptors. Environ Health. 13 (1), 46(2014).
  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Gulin, J. E. N., Bisio, M., García-Bournissen, F. Refining drug administration in a murine model of acute infection with Trypanosoma cruzi. Lab Anim Res. 36, 37(2020).
  5. Bonnichsen, M., Dragsted, N., Hansen, A. K. The welfare impact of gavaging laboratory rats. Anim Welf. 14 (3), 223-227 (2005).
  6. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
  7. Scarborough, J., et al. Preclinical validation of the micropipette-guided drug administration (MDA) method in the maternal immune activation model of neurodevelopmental disorders. Brain Behav Immun. 88, 461-470 (2020).
  8. Germann, P. G., Ockert, D. Granulomatous inflammation of the oropharyngeal cavity as a possible cause for unexpected high mortality in a Fischer 344 rat carcinogenicity study. Lab Anim Sci. 44 (4), 338-343 (1994).
  9. Martins, T., et al. Comparison of gelatin flavors for oral dosing of C57BL/6J and FVB/N mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (1), 89-95 (2022).
  10. Huynh, N., Arabian, N., Lieu, D., Asatryan, L., Davies, D. L. Utilizing an orally dissolving strip for pharmacological and toxicological studies: A simple and humane alternative to oral gavage for animals. J Vis Exp. (109), e53770(2016).
  11. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49 (3), 329-334 (2010).
  12. Neto, T., Faustino-Rocha, A. I., Gilda Costa, R. M., Medeiros, R., Oliveira, P. A. A quick and low-intensity method for oral administration to large numbers of mice: A possible alternative to oral gavage. Lab Anim. 56 (2), 185-190 (2022).
  13. Küster, T., et al. Voluntary ingestion of antiparasitic drugs emulsified in honey represents an alternative to gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (2), 219-223 (2012).
  14. Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
  15. Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Lab Anim. 55 (1), 76-80 (2021).
  16. Schalbetter, S. M., et al. Oral application of clozapine-N-oxide using the micropipette-guided drug administration (MDA) method in mouse DREADD systems. Lab Anim (NY). 50 (3), 69-75 (2021).
  17. Vanhecke, D., Bugada, V., Buch, T. Refined tamoxifen administration in mice by encouraging voluntary consumption of palatable formulations). bioRxiv. , (2023).
  18. Heraudeau, M., et al. Micropipette-guided drug administration (MDA) as a non-invasive chronic oral administration method in male rats. J Neurosci Methods. 398, 109951(2023).
  19. Sfanos, K. S., et al. Compositional differences in gastrointestinal microbiota in prostate cancer patients treated with androgen axis-targeted therapies. Prostate Cancer Prostatic Dis. 21 (4), 539-548 (2018).
  20. Shrestha, E., et al. Profiling the urinary microbiome in men with positive versus negative biopsies for prostate cancer. J Urol. 199 (1), 161-171 (2018).
  21. Peiffer, L. B., et al. Composition of gastrointestinal microbiota in association with treatment response in individuals with metastatic castrate resistant prostate cancer progressing on enzalutamide and initiating treatment with anti-PD-1 (pembrolizumab). Neoplasia. 32, 100822(2022).
  22. Jones, C. B., Peiffer, L. B., Davis, C. M., Sfanos, K. S. Examining the effects of 4He exposure on the gut-brain axis. Radiat Res. 197 (3), 242-252 (2022).
  23. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  24. Miguelena Chamorro, B., Swaminathan, G., Mundt, E., Paul, S. Towards more translatable research: Exploring alternatives to gavage as the oral administration route of vaccines in rodents for improved animal welfare and human relevance. Lab Anim (NY). 52 (9), 195-197 (2023).

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