Métodos para permitir la transcriptómica espacial de los tejidos óseos

Resumen

En este trabajo describimos un método que permite la descalcificación de los tejidos óseos recién obtenidos y la conservación de ARN de alta calidad. También se ilustra un método para seccionar muestras de huesos no desmineralizados con formalina fija (FFPE) para obtener resultados de buena calidad si no se dispone de tejidos frescos o no se pueden recolectar.

Resumen

Comprender la relación entre las células y su ubicación dentro de cada tejido es fundamental para descubrir los procesos biológicos asociados con el desarrollo normal y la patología de la enfermedad. La transcriptómica espacial es un método potente que permite el análisis de todo el transcriptoma dentro de muestras de tejido, proporcionando así información sobre la expresión génica celular y el contexto histológico en el que residen las células. Si bien este método se ha utilizado ampliamente para muchos tejidos blandos, su aplicación para los análisis de tejidos duros como el hueso ha sido un desafío. El principal desafío reside en la incapacidad de preservar el ARN de buena calidad y la morfología del tejido mientras se procesan las muestras de tejido duro para el corte. Por lo tanto, aquí se describe un método para procesar muestras de tejido óseo recién obtenidas para generar de manera efectiva datos transcriptómicos espaciales. El método permite la descalcificación de las muestras, otorgando secciones de tejido exitosas con detalles morfológicos preservados y evitando la degradación del ARN. Además, se proporcionan directrices detalladas para las muestras que anteriormente estaban incrustadas en parafina, sin desmineralización, como las muestras recogidas de los bancos de tejidos. Con estas directrices, se muestran datos transcriptómicos espaciales de alta calidad generados a partir de muestras de bancos de tejidos de tumor primario y metástasis pulmonares de osteosarcoma óseo.

Introducción

El hueso es un tejido conectivo especializado compuesto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 y sales inorgánicas¹. Como resultado, el hueso es increíblemente fuerte y rígido y, al mismo tiempo, ligero y resistente a los traumatismos. La gran resistencia del hueso deriva de su contenido mineral. De hecho, para cualquier aumento dado en el porcentaje de contenido de minerales, la rigidez aumenta cinco veces². En consecuencia, los investigadores se enfrentan a importantes problemas cuando analizan, mediante cortes histológicos, la biología de un espécimen óseo.

La histología ósea no desca....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales que se describen a continuación fueron aprobados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina Dental de la Universidad de Pittsburgh.

1. Método para preparar bloques de FFPE de muestras de tejido óseo que requieren desmineralización

1. Preparación de reactivos y materiales
   1. Prepare EDTA 20% pH 8.0. Para 1 L, disuelva 200 g de EDTA en 800 mL de agua ultrapura, ajuste el pH a 8.0 con hidróxido de sodio 10 N y finalmente lleve el volumen a 1L con agua ultrapura. Almacene a temperatura ambiente.
      NOTA: Utilice siempre ....

Resultados

El método presentado aquí describe cómo procesar huesos recién aislados para obtener muestras de FFPE desmineralizadas que se pueden seccionar fácilmente con un micrótomo mientras se preserva la integridad del ARN (Figura 1). El método se ha empleado con éxito en fémures murinos, pero se puede seguir para otras muestras de tejido óseo de dimensiones similares, o se puede adaptar para muestras óseas más grandes (por ejemplo, muestras humanas) aumentando todos los parámetros (tiempo, volúmenes.......

Discusión

Aquí, se proporciona un método detallado para preparar bloques de FFPE de huesos descalcificados y preservar la integridad del ARN para la secuenciación (es decir, secuenciación de próxima generación (NGS)) o para otras técnicas relacionadas con el ARN (es decir, hibridación in situ , reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), etcétera).

El método utiliza EDTA para descalcificar muestras de tejido óseo; la incubación con EDTA permite una desm.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agitador orbital avanzado	VWR	76683-470	Utilícelo para mantener los tejidos bajo agitación durante la incubación, tal y como se indica en las instrucciones del método.
Cepillos de pelo de camello	Ted Pella	11859	Úselo para manejar secciones de FFPE como se informa en las pautas.
Kit de Índice Dual TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Utilícelo para realizar transcriptómica espacial.
Etanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Úselo para realizar la deshidratación de tejidos como se informa en las instrucciones del método.
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Úselo para preparar EDTA 20% pH 8.0.
Pinzas de uso general curvadas de punta media curvas	Fisherbrand Fisher Scientific	16-100-110	Úselo para manipular secciones de FFPE según lo informado en las pautas.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Úselo para manejar secciones de FFPE como se informa en las pautas.
Fisherbrand  Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Úselo para adjuntar rollos seccionados como se indica en las pautas.
Hojas de micrótomo de diamante de alto perfil	CL Sturkey	D554DD	Úselo para seccionar bloques FFPE como se informa en las pautas.
Secuenciador Novaseq 150PE	Novogene	N/A	.
Paraformaldehído (PFA) 32% Solución acuosa	Grado EM Microscopía Electrónica Sciences	15714-S	Diluir hasta una concentración final del 4% con 1x PBS  para realizar la fijación de tejidos.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Listo para usar. Úselo para diluir PFA y realizar lavados como se indica en las instrucciones del método.
Baño flotante de tejido Premiere	Fisher Scientific	A84600061	Úselo para eliminar las arrugas de las secciones de FFPE como se informa en las pautas.
RNase AWAY Descontaminante	de superficies Thermo Fisher Scientific	7002	Úselo para limpiar todas las superficies como se indica en las instrucciones del método.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Úselo para aislar el ARN de las secciones de FFPE una vez que se hayan generado, según lo informado en las guías.
Microtomo rotativo semiautomatizado	Leica Biosystems	RM2245	Utilícelo para seccionar bloques FFPE como se indica en las directrices.
Hidróxido de sodio	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare la solución de 10 N disolviendo lentamente 400 g en 1 litro de agua Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Uso para procesar la salida de datos de secuenciación .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Úselo para realizar la inflación e inclusión de tejidos como se informa en las instrucciones del método.
Kit de accesorios Visium	10X Genomics	PN-1000194	Úselo para realizar experimentos transcriptómicos espaciales.
Kit de sonda de transcriptoma humano Visium Small	10X Genomics	PN-1000363	Úselo para realizar experimentos transcriptómicos espaciales.
Kit de diapositivas de expresión génica espacial Visium 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Se utiliza para colocar las secciones si se realizan experimentos transcriptómicos espaciales.
Xileno	Leica Biosystems	3803665	Úselo para realizar la limpieza de tejidos como se informa en las instrucciones del método.

de EM