Métodos para permitir la transcriptómica espacial de los tejidos óseos

Resumen

En este trabajo describimos un método que permite la descalcificación de los tejidos óseos recién obtenidos y la conservación de ARN de alta calidad. También se ilustra un método para seccionar muestras de huesos no desmineralizados con formalina fija (FFPE) para obtener resultados de buena calidad si no se dispone de tejidos frescos o no se pueden recolectar.

Resumen

Comprender la relación entre las células y su ubicación dentro de cada tejido es fundamental para descubrir los procesos biológicos asociados con el desarrollo normal y la patología de la enfermedad. La transcriptómica espacial es un método potente que permite el análisis de todo el transcriptoma dentro de muestras de tejido, proporcionando así información sobre la expresión génica celular y el contexto histológico en el que residen las células. Si bien este método se ha utilizado ampliamente para muchos tejidos blandos, su aplicación para los análisis de tejidos duros como el hueso ha sido un desafío. El principal desafío reside en la incapacidad de preservar el ARN de buena calidad y la morfología del tejido mientras se procesan las muestras de tejido duro para el corte. Por lo tanto, aquí se describe un método para procesar muestras de tejido óseo recién obtenidas para generar de manera efectiva datos transcriptómicos espaciales. El método permite la descalcificación de las muestras, otorgando secciones de tejido exitosas con detalles morfológicos preservados y evitando la degradación del ARN. Además, se proporcionan directrices detalladas para las muestras que anteriormente estaban incrustadas en parafina, sin desmineralización, como las muestras recogidas de los bancos de tejidos. Con estas directrices, se muestran datos transcriptómicos espaciales de alta calidad generados a partir de muestras de bancos de tejidos de tumor primario y metástasis pulmonares de osteosarcoma óseo.

Introducción

El hueso es un tejido conectivo especializado compuesto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 y sales inorgánicas¹. Como resultado, el hueso es increíblemente fuerte y rígido y, al mismo tiempo, ligero y resistente a los traumatismos. La gran resistencia del hueso deriva de su contenido mineral. De hecho, para cualquier aumento dado en el porcentaje de contenido de minerales, la rigidez aumenta cinco veces². En consecuencia, los investigadores se enfrentan a importantes problemas cuando analizan, mediante cortes histológicos, la biología de un espécimen óseo.

La histología ósea no descalcificada es factible y, a veces, necesaria, dependiendo del tipo de investigación (p. ej., para estudiar la microarquitectura del hueso); Sin embargo, es muy desafiante, especialmente si los especímenes son grandes. En estos casos, el procesamiento de tejidos con fines histológicos requiere varias modificaciones de los protocolos y técnicas estándar³. En general, para realizar evaluaciones histológicas comunes, los tejidos óseos se descalcifican inmediatamente después de la fijación, un proceso que puede requerir de unos pocos días a varias semanas, dependiendo del tamaño del tejido y del agente descalcificante utilizado⁴. Las secciones descalcificadas se utilizan a menudo para el examen de la médula ósea, el diagnóstico de tumores, etcétera. Existen tres tipos principales de agentes descalcificantes: ácidos fuertes (por ejemplo, ácido nítrico, ácido clorhídrico), ácidos débiles (por ejemplo, ácido fórmico) y agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiaminotrazético o EDTA)⁵. Los ácidos fuertes pueden descalcificar el hueso muy rápidamente, pero pueden dañar los tejidos; Los ácidos débiles son muy comunes y adecuados para los procedimientos de diagnóstico; Los agentes quelantes son, con mucho, los más utilizados y apropiados para la aplicación en investigación, ya que, en este caso, el proceso de desmineralización es lento y suave, lo que permite la retención de una morfología de alta calidad y la preservación de la información de genes y proteínas, como lo requieren muchos procedimientos (por ejemplo, hibridación in situ , inmunotinción). Sin embargo, cuando es necesario preservar todo el transcriptoma, como en el caso de los análisis de expresión génica, incluso una desmineralización lenta y suave puede ser perjudicial. Por lo tanto, se necesitan mejores enfoques y métodos cuando el análisis morfológico de los tejidos debe combinarse con análisis de expresión génica de las células.

Gracias a las recientes mejoras en la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) y la transcriptómica espacial, ahora es posible estudiar la expresión génica de una muestra de tejido incluso cuando se utilizó la inclusión de parafina de fijación de formalina (FFPE) para almacenar las muestras de tejido ^6,7,8. Esta oportunidad ha desbloqueado el acceso a un mayor número de muestras, como las almacenadas en los bancos de tejidos de todo el mundo. Si se va a emplear scRNA-seq, la integridad del ARN es el requisito más importante; sin embargo, en el caso de la transcriptómica espacial de muestras FFPE, tanto las secciones de tejido de alta calidad como el ARN de alta calidad son necesarias para visualizar la expresión génica dentro del contexto histológico de cada sección de tejido. Si bien esto se ha logrado fácilmente con los tejidos blandos, no se puede decir lo mismo de los tejidos duros como el hueso. De hecho, hasta donde sabemos, nunca se ha realizado ningún estudio utilizando transcriptómica espacial en muestras óseas de FFPE. Esto se debe a la falta de protocolos que puedan procesar eficazmente los tejidos óseos FFPE preservando su contenido de ARN. Aquí, primero se proporciona un método para procesar y descalcificar muestras de tejido óseo recién obtenidas evitando la degradación del ARN. Luego, reconociendo la necesidad de un análisis transcriptómico de las muestras de FFPE recolectadas en bancos de tejidos de todo el mundo, también se presentan pautas desarrolladas para manejar adecuadamente las muestras de FFPE de huesos no desmineralizados.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales que se describen a continuación fueron aprobados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina Dental de la Universidad de Pittsburgh.

1. Método para preparar bloques de FFPE de muestras de tejido óseo que requieren desmineralización

1. Preparación de reactivos y materiales
   1. Prepare EDTA 20% pH 8.0. Para 1 L, disuelva 200 g de EDTA en 800 mL de agua ultrapura, ajuste el pH a 8.0 con hidróxido de sodio 10 N y finalmente lleve el volumen a 1L con agua ultrapura. Almacene a temperatura ambiente.
      NOTA: Utilice siempre EDTA 20% pH 8.0 recién preparado. El hidróxido de sodio (NaOH) 10 N se prepara disolviendo 400 g de NaOH en 1 L de agua ultrapura.
   2. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% en una campana extractora utilizando 1x PBS sin calcio ni magnesio.
      NOTA: Designe un área en una campana extractora para trabajar con soluciones concentradas de paraformaldehído, o sólidos de paraformaldehído, y etiquétela como tal. Para evitar la exposición, mantenga los recipientes cerrados tanto como sea posible. Úselo en las cantidades prácticas más pequeñas necesarias para el experimento que se está realizando. Si el pesaje de polvo de paraformaldehído y la báscula de pesaje no se pueden usar en una campana extractora, primero tome un recipiente, luego agregue polvo de PFA en la campana y cúbrala antes de regresar a la báscula para pesar el polvo. Utilice siempre PFA al 4% recién preparado.
   3. Utilice un recipiente adecuado para cada espécimen.
      NOTA: Por ejemplo, para 1 mg de tejido óseo, use un recipiente que permita que al menos 1 mL de cualquier solución esté en contacto con el hueso.
   4. Esterilizar todo el equipo quirúrgico necesario para la disección.
   5. Limpie todas las áreas con una solución descontaminante para eliminar las RNasas.
   6. Recoja los materiales experimentales restantes, incluidos contenedores de hielo, aerosol de etanol al 70% y tenga acceso a un agitador orbital.
2. Aislamiento de muestras de tejido óseo de ratones
   1. Eutanasiar al ratón por exposición al CO₂ , luego realizar la dislocación cervical y colocarlo boca arriba. Rocíe la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Con tijeras de disección estériles, abra la piel y exponga el músculo de la pierna. Corte el músculo a lo largo de la pierna para obtener una visión clara de la posición del hueso y desarticule suavemente el hueso para eliminarlo sin dañarlo.
      NOTA: No es necesario extirpar por completo todo el músculo adherido al hueso. Trate de ser lo más rápido posible para limitar la degradación del ARN.
   3. Coloque inmediatamente la muestra de hueso en un tubo que contenga un 4% de PFA y coloque el tubo en hielo.
   4. Repita el procedimiento para recolectar otras muestras óseas según lo desee.
   5. Agitar muestras con PFA al 4% en un agitador orbital a 140 rpm a 4 °C durante al menos 24 h para permitir una fijación adecuada.
3. Descalcificación de muestras de tejido óseo
   1. Recuperar el tejido óseo del agitador orbital después de la fijación.
   2. Lave el tejido óseo 2 veces con 1x PBS durante 3 minutos en un agitador orbital a 140 rpm para eliminar cualquier PFA restante.
   3. Con unas tijeras de disección estériles, retira los músculos restantes que aún estén adheridos al hueso.
   4. Lave el tejido óseo una vez más con 1x PBS durante 3 min.
   5. Coloque el tejido óseo en un recipiente nuevo con un 20% de EDTA pH 8.0. A continuación, coloque el recipiente en un agitador orbital a 140 rpm durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
   6. Deseche la solución, agregue EDTA fresco al 20% pH 8.0 en el recipiente y colóquela en un agitador orbital a 140 rpm durante 30 min en RT.
   7. Repita el paso 1.3.6 10 veces.
   8. Deseche la solución, agregue EDTA fresco al 20% pH 8.0 en el recipiente y colóquela a 4 °C en una cámara frigorífica en un agitador orbital a 140 rpm durante la noche.
4. Deshidratación de muestras de tejido óseo
   1. Recupere la muestra de tejido óseo del recipiente.
   2. Inspeccione el tejido y verifique la eficiencia de la descalcificación girando y retorciendo suavemente el hueso. Alternativamente, realice una radiografía del hueso con una máquina de rayos X.
      NOTA: Si la muestra se flexiona fácilmente, se ha logrado un buen grado de descalcificación. De lo contrario, se deben aumentar los parámetros de descalcificación (tiempo, velocidad de agitación, volumen de 20% EDTA pH 8.0. utilizado, etcétera).
   3. Lave el tejido óseo 2 veces con 1x PBS durante 3 minutos para eliminar los residuos de EDTA.
   4. Coloque el tejido óseo en un recipiente nuevo e inicie la deshidratación con etanol al 70%. Incubar durante 15 min a 140 rpm.
   5. Deseche la solución de etanol al 70%, coloque la muestra en una solución de etanol al 90% e incube durante 15 minutos a 140 rpm.
   6. Deseche la solución de etanol al 90%, coloque la muestra en etanol al 100% e incube durante 15 minutos a 140 rpm.
   7. Deseche el etanol al 100%, coloque la muestra en etanol 100% nuevo e incube durante 15 minutos a 140 rpm.
   8. Deseche el etanol al 100%, coloque la muestra en etanol 100% nuevo e incube durante 15 minutos a 140 rpm.
   9. Deseche el etanol al 100%, coloque la muestra en etanol 100% nuevo e incube durante 30 minutos a 140 rpm.
   10. Deseche el etanol al 100%, coloque la muestra en etanol al 100% nuevo e incube durante 45 minutos a 140 rpm.
       NOTA: La deshidratación también se puede realizar utilizando un procesador automático. En este caso, configure el programa con las mismas condiciones informadas para la deshidratación manual. Las condiciones reportadas son para especímenes de no más de 4 mm de grosor (es decir, muestras de tejido óseo obtenidas de ratones). Para muestras de más de 4 mm de grosor, el tiempo de deshidratación debe determinarse experimentalmente.
5. Limpieza de muestras de tejido óseo
   1. Coloque la muestra de tejido óseo en un recipiente nuevo e inicie el proceso de limpieza con xileno. Incubar durante 20 min a 140 rpm.
   2. Deseche el xileno usado, agregue xileno nuevo e incube durante 20 minutos adicionales a 140 rpm.
   3. Deseche el xileno usado, agregue xileno nuevo e incube durante 45 minutos a 140 rpm.
      NOTA: La limpieza también se puede realizar utilizando un procesador automático. En este caso, configure el programa con las mismas condiciones informadas para el borrado manual. Las condiciones reportadas son para especímenes de no más de 4 mm de grosor (es decir, muestras de tejido óseo obtenidas de ratones). Para muestras de más de 4 mm de grosor, el tiempo debe determinarse experimentalmente.
6. Infiltración e inclusión de muestras de tejido óseo
   1. Recupere la muestra de tejido óseo del agitador orbital/procesador automático después de la limpieza.
   2. Coloque la muestra de tejido óseo en un casete de inclusión e inicie la infiltración con cera (consulte la tabla de materiales). Incubar durante 30 min a 60 °C.
   3. Deseche la cera usada, agregue cera nueva e incube durante 30 minutos a 60 °C.
   4. Deseche la cera usada, agregue cera nueva e incube durante 45 min a 60 °C.
   5. Coloque con cuidado la muestra de tejido óseo en un molde con la orientación deseada.
   6. Deje que el bloque de muestras se solidifique sobre una superficie fría.
   7. Guarde el FFPE obtenido a 4 °C hasta que esté listo para comenzar el corte.
      NOTA: El bloque FFPE se puede almacenar durante muchos años antes de realizar el seccionamiento.

2. Directrices para el seccionamiento de muestras de FFPE no desmineralizadas

NOTA: Las siguientes pautas proporcionan valiosos consejos e instrucciones útiles para mejorar en gran medida la calidad de las secciones de tejido y evitar la degradación del ARN, especialmente en casos de pequeñas muestras óseas no descalcificadas. Estas pautas también se pueden aplicar a muestras de hueso descalcificado cuando estén disponibles. Para muestras de tejido óseo más grandes, se debe realizar la desmineralización para obtener secciones de mejor calidad; En tales casos, se debe seguir el método informado anteriormente y los parámetros (tiempo, volúmenes de soluciones, etcétera) deben ajustarse en consecuencia. Las siguientes pautas son adecuadas cuando los tejidos óseos FFPE ya se han procesado (por ejemplo, bloque FFPE recolectado de bancos de tejidos u otros laboratorios) o cuando las secciones recolectadas se utilizarán para realizar cualquier tipo de análisis que requiera ARN de buena calidad, secciones de tejido de alta calidad o ambos.

1. Preparación del equipo
   1. Rocíe todas las superficies de trabajo e instrumentos con soluciones descontaminantes para eliminar las RNasas.
   2. Prepare un baño de agua con agua bidestilada y ajuste la temperatura a 42 °C.
   3. Tome una cuchilla de micrótomo, rocíela con etanol al 70% para eliminar los residuos de aceite, luego rocíela con soluciones descontaminantes para eliminar las RNasas.
   4. Asegure la cuchilla en el micrótomo. Asegúrese de que el ángulo de incidencia esté ajustado a 10°.
      NOTA: Utilice siempre cuchillas nuevas para seccionar.
   5. Prepara dos cubos de hielo.
   6. Consigue pinzas, cepillos y sondas, rocíalos con soluciones descontaminantes para eliminar las RNasas y colócalos en una de las dos cubetas de hielo.
   7. Prepara un baño de hielo añadiendo agua destilada doble a la otra cubeta de hielo.
      NOTA: el bloque FFPE no debe flotar en el agua añadida; Por lo tanto, la cantidad de agua añadida a la cubeta de hielo debe ser suficiente para permitir que la muestra esté húmeda sin flotar.
2. Seccionamiento
   1. Recupere el bloque FFPE del almacenamiento a 4 °C y colóquelo en el micrótomo. Establezca el comando en Recortar o en 14 μm de grosor de desplazamiento y comience a recortar la muestra hasta que el tejido quede expuesto.
      NOTA: Si el bloque FFPE ya se ha recortado y el tejido ya está expuesto, omita el paso 2.2.1. Verifica que el bloque no tenga agujeros ni grietas. Si es así, vaya directamente al paso 2.2.2. De lo contrario, corte algunas secciones para aplanar la superficie y evitar los agujeros y grietas, y luego continúe con el paso 2.2.2.
   2. Coloque el bloque FFPE en el baño de hielo para hidratar la muestra. El tiempo de hidratación debe determinarse experimentalmente.
      1. Comience con 2 min y aumente el tiempo si la hidratación no es suficiente. No exceda los 10 min. La hidratación expandirá el tejido y reducirá la formación de "persianas venecianas" y líneas. Los tiempos de hidratación más largos podrían causar grietas en el bloque de parafina y, posiblemente, desprendimiento de tejido.
      2. Si 10 minutos son insuficientes para hidratar la muestra, realice ciclos de hidratación de no más de 10 minutos e intente seccionar nuevamente.
      3. Si la superficie del bloque no es lisa y limpia debido a grietas o cortes, considere volver a incrustar la muestra. La calidad del ARN no se verá afectada por el proceso de reincrustación.
   3. Coloque la muestra en la pinza de muestra del micrótomo, alinéela con la cuchilla y comience a seccionar. Ajuste el grosor del desplazamiento a 5 μm.
   4. Recoja la sección y colóquela en el baño de agua a 42 °C con pinzas frías y cepillos.
      NOTA: Alternativamente, si se va a realizar el aislamiento de ARN de secciones de tejido, recoja las secciones en un tubo de centrífuga y siga las especificaciones de fabricación para la preparación de ARN (consulte la Tabla de materiales).
   5. Incubar la sección en el baño de agua para estirar el tejido y eliminar las arrugas y pliegues residuales.
      NOTA: El tiempo de flotación en el baño de agua para cada sección debe determinarse experimentalmente. Considere dejar las secciones óseas un minuto más si se producen problemas de desprendimiento de tejido. No deje la sección flotando demasiado tiempo, ya que los tiempos de flotación prolongados podrían dañar el tejido.
   6. Coloque la sección en un portaobjetos de vidrio, luego incube durante 3 h a 42 ° C.
   7. Coloque el portaobjetos de vidrio en un desecador o en un horno durante la noche a temperatura media para un secado adecuado.
   8. Guarde el portaobjetos de vidrio con la sección adjunta en RT en una caja de portaobjetos.
      NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar durante muchos años en RT. Si se va a realizar la transcriptómica espacial, en lugar de un portaobjetos de vidrio, coloque la sección en el portaobjetos de expresión génica espacial proporcionado por el fabricante y siga las recomendaciones informadas (consulte la Tabla de materiales).

Resultados

El método presentado aquí describe cómo procesar huesos recién aislados para obtener muestras de FFPE desmineralizadas que se pueden seccionar fácilmente con un micrótomo mientras se preserva la integridad del ARN (Figura 1). El método se ha empleado con éxito en fémures murinos, pero se puede seguir para otras muestras de tejido óseo de dimensiones similares, o se puede adaptar para muestras óseas más grandes (por ejemplo, muestras humanas) aumentando todos los parámetros (tiempo, volúmenes...

Discusión

Aquí, se proporciona un método detallado para preparar bloques de FFPE de huesos descalcificados y preservar la integridad del ARN para la secuenciación (es decir, secuenciación de próxima generación (NGS)) o para otras técnicas relacionadas con el ARN (es decir, hibridación in situ , reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), etcétera).

El método utiliza EDTA para descalcificar muestras de tejido óseo; la incubación con EDTA permite una desm...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agitador orbital avanzado	VWR	76683-470	Utilícelo para mantener los tejidos bajo agitación durante la incubación, tal y como se indica en las instrucciones del método.
Cepillos de pelo de camello	Ted Pella	11859	Úselo para manejar secciones de FFPE como se informa en las pautas.
Kit de Índice Dual TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Utilícelo para realizar transcriptómica espacial.
Etanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Úselo para realizar la deshidratación de tejidos como se informa en las instrucciones del método.
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Úselo para preparar EDTA 20% pH 8.0.
Pinzas de uso general curvadas de punta media curvas	Fisherbrand Fisher Scientific	16-100-110	Úselo para manipular secciones de FFPE según lo informado en las pautas.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Úselo para manejar secciones de FFPE como se informa en las pautas.
Fisherbrand  Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Úselo para adjuntar rollos seccionados como se indica en las pautas.
Hojas de micrótomo de diamante de alto perfil	CL Sturkey	D554DD	Úselo para seccionar bloques FFPE como se informa en las pautas.
Secuenciador Novaseq 150PE	Novogene	N/A	.
Paraformaldehído (PFA) 32% Solución acuosa	Grado EM Microscopía Electrónica Sciences	15714-S	Diluir hasta una concentración final del 4% con 1x PBS  para realizar la fijación de tejidos.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Listo para usar. Úselo para diluir PFA y realizar lavados como se indica en las instrucciones del método.
Baño flotante de tejido Premiere	Fisher Scientific	A84600061	Úselo para eliminar las arrugas de las secciones de FFPE como se informa en las pautas.
RNase AWAY Descontaminante	de superficies Thermo Fisher Scientific	7002	Úselo para limpiar todas las superficies como se indica en las instrucciones del método.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Úselo para aislar el ARN de las secciones de FFPE una vez que se hayan generado, según lo informado en las guías.
Microtomo rotativo semiautomatizado	Leica Biosystems	RM2245	Utilícelo para seccionar bloques FFPE como se indica en las directrices.
Hidróxido de sodio	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare la solución de 10 N disolviendo lentamente 400 g en 1 litro de agua Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Uso para procesar la salida de datos de secuenciación .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Úselo para realizar la inflación e inclusión de tejidos como se informa en las instrucciones del método.
Kit de accesorios Visium	10X Genomics	PN-1000194	Úselo para realizar experimentos transcriptómicos espaciales.
Kit de sonda de transcriptoma humano Visium Small	10X Genomics	PN-1000363	Úselo para realizar experimentos transcriptómicos espaciales.
Kit de diapositivas de expresión génica espacial Visium 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Se utiliza para colocar las secciones si se realizan experimentos transcriptómicos espaciales.
Xileno	Leica Biosystems	3803665	Úselo para realizar la limpieza de tejidos como se informa en las instrucciones del método.

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