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Lesión iatrogénica recapitulada: técnica de electroescisión para el modelado de la estenosis uretral en ratas

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DOI:

10.3791/66864

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11 de octubre de 2024

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1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

En este artículo

Resumen

En este estudio, presentamos un modelo novedoso, eficiente y estable de estenosis uretral en ratas creado a través de la electroescisión de la uretra de rata, que simula eficazmente la lesión iatrogénica observada en entornos clínicos.

Resumen

La estenosis uretral (US) es una afección clínica común en urología, caracterizada por una alta prevalencia y morbilidad en todas las edades. Los tratamientos actuales para la ecografía, como la dilatación uretral y la uretrotomía interna, no resuelven completamente la afección y se asocian con altas tasas de recurrencia y complicaciones.

Además, la patogenia de la ecografía no se conoce bien. Para explorar la patogenia de la ecografía y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es crucial establecer un modelo estandarizado en ratas que refleje con precisión las manifestaciones clínicas. Este estudio describe un método sencillo y repetible para inducir US en ratas utilizando un cuchillo eléctrico de alta frecuencia. El método consiste en realizar una incisión longitudinal con el bisturí eléctrico ajustado a un modo de corte mixto unipolar a 4 W, lo que inflige un daño uretral significativo. El análisis histopatológico muestra engrosamiento del urotelio, infiltración inflamatoria y fibras de colágeno desorganizadas. Este modelo replica eficazmente la lesión iatrogénica a través de la electroescisión en la uretra de la rata. En resumen, este estudio establece con éxito un modelo nuevo, eficiente y estable de US en ratas que imita de cerca el escenario clínico, proporcionando una herramienta valiosa para futuras investigaciones sobre los mecanismos y tratamientos novedosos para la US.

Introducción

La estenosis uretral (US) es una de las afecciones urológicas más antiguas y sigue siendo ampliamente prevalente. Datos recientes sugieren que hay entre 229 y 627 casos de US por cada 100.000 hombres1. Aquellos que sufren de US experimentan una variedad de síntomas que incluyen síntomas del tracto urinario inferior2, dolor3 y disfunción sexual4. Existen varios tratamientos médicos, como la uretrotomía, la uretroplastia y la dilatación5. Sin embargo, estos tratamientos a menudo se complican por problemas como sangrado, infección e incontinencia, lo que contribuye a la carga de enfermedad y presenta tasas variables de recurrencia 6,7. En consecuencia, la identificación de los enfoques terapéuticos más eficaces sigue siendo un reto crítico que involucra a investigadores y clínicos.

La ecografía se caracteriza generalmente por un estrechamiento de la uretra anterior causado por fibrosis y cicatrización de la mucosa uretral y del tejido esponjoso circundante8. A pesar de su prevalencia, las causas y los mecanismos subyacentes a la ecografía son poco conocidos, y hay una falta de modelos animales adecuados para un estudio en profundidad. La lesión iatrogénica, principalmente por cirugía transuretral, es actualmente la principal causa de US, representando el 41% de los casos9. Por lo tanto, un modelo animal ideal para la investigación en EE. UU. debe replicar con precisión las lesiones clínicas comunes, exhibir similitudes genómicas y proteómicas cercanas con los humanos y demostrar eficiencia y estabilidad. Un modelo de este tipo facilitaría en gran medida investigaciones más profundas sobre la patogénesis de la ecografía y el desarrollo de tratamientos más eficaces.

Para investigar el proceso patogénico y el mecanismo de los tipos clínicos comunes, se han desarrollado varios modelos animales utilizando animales grandes como conejos 10,11, perros12 y cerdos13,14 empleando técnicas como la electrocoagulación, la electrorresección15 y las inyecciones de bleomicina16. Sin embargo, estos modelos a menudo enfrentan desafíos debido a las limitaciones del tamaño de la muestra y las diferencias genéticas con los humanos. Además, se debe considerar la rentabilidad del uso de animales grandes; A pesar de los altos costos asociados con el cuidado diario, los animales grandes también conllevan riesgos significativos de infección, lo que requiere cuidados postoperatorios extensos y gastos considerables. Está bien documentado que los roedores comparten características fisiológicas y patológicas con los humanos en muchos sistemas de órganos. Un estudio reciente ha demostrado homología entre las células del tracto urinario de animales roedores y humanos17. Además, los costos de compra, alojamiento y cuidados postoperatorios de las ratas son significativamente más bajos que los de los animales grandes18. En consecuencia, se considera adecuado un modelo de rata de los EE. UU.; Sin embargo, el desarrollo de tales modelos en ratas no ha sido descrito adecuadamente.

Estudios previos han utilizado herramientas quirúrgicas como cuchillas o agujas para inducir ecografía en modelos de ratas19. Este enfoque se ha asociado con riesgos como dañar los vasos sanguíneos periuretrales, lo que provoca una hemorragia significativa. La naturaleza subjetiva de estos procedimientos quirúrgicos también puede dar lugar a variabilidad en el grado de la lesión mecánica, careciendo de criterios cuantitativos para el modelado, lo que puede afectar la evaluación de los resultados de la reparación uretral en estudios terapéuticos posteriores.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, existe una clara necesidad de desarrollar un modelo adicional de ratas en los Estados Unidos. Para establecer un modelo de US eficiente, rentable y estable en ratas, empleamos una máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia en nuestra investigación. Este modelo facilitará nuevas investigaciones sobre los mecanismos de la ecografía y la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos antes de proceder a los ensayos clínicos.

Protocolo

En esta investigación, se emplearon veinte ratas Sprague-Dawley macho de 6 meses de edad, cada una con un peso de 400 a 500 g. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Quinto Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen (Número de aprobación: 00349). Los animales fueron alojados en una instalación con condiciones controladas de temperatura e iluminación. Una característica fundamental de la estenosis uretral es el desarrollo de cicatrices dentro de la uretra. Con base en la línea de tiempo establecida para la formación de la cicatriz, que generalmente ocurre dentro de las 4 semanas posteriores a la lesión, designamos la presencia de tejido cicatricial discernible en la uretra a las 4 semanas postoperatorias como criterio de valoración experimental.

1. Preparación de instrumental quirúrgico

  1. Prepare los siguientes materiales quirúrgicos: catéter recubierto de teflón (0,6 x 1 mm), suturas reabsorbibles (6-0), tijeras de sutura, pinzas de tejido, alicates de sujeción de agujas, pinzas lisas, unidad electroquirúrgica de alta frecuencia (Figura 1), incluido el panel del bisturí eléctrico de alta frecuencia, electrodo quirúrgico, bisturí electroquirúrgico de alta frecuencia y la varilla conductora anal (ver Tabla de materiales).
  2. Limpie el área quirúrgica con toallitas con alcohol que contengan un 75% de etanol.
  3. Preparación para el uso de una cuchilla eléctrica de alta frecuencia en modo de corte eléctrico unipolar.
    1. Conecte la cuchilla eléctrica de alta frecuencia a la fuente de alimentación principal de 220 V conectada a tierra mediante un cable de alimentación.
    2. Inserte el mango de la cuchilla esterilizada controlada a mano y la varilla conductora en sus respectivos zócalos (Figura 1C).
      NOTA: Asegúrese de que todos los cables de alimentación estén bien conectados para mantener la seguridad de la cirugía.

2. Preparación del animal

  1. Extraer el pentobarbital sódico (60 mg/kg) en una jeringa.
  2. Asegure a la rata agarrando su cola con la mano dominante y sosteniendo la piel de sus orejas y cuello con la mano no dominante para asegurarse de que esté firmemente fijada.
  3. Exponga la parte inferior del abdomen de la rata y desinfecte el área con bolas de algodón empapadas en etanol al 75%.
  4. Inserte la aguja de la jeringa aproximadamente 1-2 mm al lado de la línea media abdominal en la parte inferior del abdomen, dirigiéndola hacia la cavidad abdominal en un ángulo de 45°.
    NOTA: Sentirá una pérdida de resistencia cuando la aguja penetre en el peritoneo.
  5. Tire suavemente del émbolo de la jeringa para asegurarse de que no haya sangre ni líquido en la jeringa.
  6. Inyecte lentamente el pentobarbital sódico. Retire la aguja, completando la inyección, y vuelva a desinfectar el sitio con bolas de algodón empapadas en etanol al 75%.
  7. Controla el ritmo respiratorio de la rata y pellizca su pata trasera para comprobar si tiene reflejos.
    NOTA: Confirme que la respiración de la rata es constante y que no muestra reflejos antes de proceder con la cirugía.
  8. Exprima el ungüento de eritromicina y sumerja un hisopo de algodón en el ungüento. Aplique el ungüento con el hisopo de algodón en las córneas de ambos ojos para evitar que la córnea se seque durante el procedimiento.
  9. Use una afeitadora eléctrica para afeitar la parte inferior del abdomen y el perineo después de que se confirme la anestesia.
  10. Limpie el cabello suelto de la zona afeitada con un pañuelo humedecido con solución salina.
  11. Desinfecte el área limpiándola dos veces con una esponja de gasa empapada en yodoforo para minimizar la irritación de la piel.
  12. Coloque la rata profundamente anestesiada en una almohadilla térmica a 37 ° C en posición supina. Asegurar la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos mediante el uso de guantes médicos.

3. Cateterismo uretral y procedimiento de lesión

  1. Inserte la varilla conductora en el ano de la rata para establecer un circuito cerrado efectivo para la máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia (Figura 2A).
  2. Cateterizar la uretra de la rata para ayudar en el posicionamiento y proporcionar apoyo durante los pasos posteriores al procesamiento de la cirugía.
    1. Lubrique el catéter urinario con aceite de parafina.
    2. Exponga el pene apretando la piel a su alrededor para que sobresalga del abdomen.
    3. Desinfecta el pene de la rata con una esponja de gasa empapada en yodoforo.
    4. Abra suavemente el orificio uretral con pinzas lisas e inserte el catéter lubricado en la uretra.
    5. Inserte con cuidado el catéter recubierto de teflón en la uretra con el ritmo de la contracción uretral; evite cualquier inserción forzada (Figura 2B).
    6. Si se encuentra resistencia, tire suavemente del pene hacia el lado ventral para ajustar el ángulo de flexión del pene y continúe avanzando el catéter hacia la vejiga hasta que la orina fluya (Figura 2C).
    7. Confirme el éxito del cateterismo asegurándose de que el pene forme un ángulo aproximado de 45° con el abdomen (Figura 2D).
  3. Encienda la máquina de cuchillas eléctrica de alta frecuencia, haga clic en los botones del panel de cuchillas de alta frecuencia para seleccionar el modo de corte mixto unipolar y ajuste la potencia a 4 W para los siguientes pasos de electroextirpación del pene capa por capa.
  4. Alinee la incisión con el catéter. Presione el botón amarillo en el mango del bisturí electroquirúrgico y haga una incisión a lo largo de la línea de marcado del catéter desde la piel del pene hasta la capa externa de la uretra con el bisturí eléctrico hasta que la uretra quede expuesta (Figura 3A, B).
    NOTA: Asegúrese de presionar el botón amarillo para la electroescisión, no el botón azul para la electrocoagulación.
  5. Continuar realizando una incisión longitudinal de 0,5 cm en la uretra con el bisturí eléctrico, asegurando un diámetro transversal de 0,1 cm, hasta que el catéter sea visible (Figura 3C).
  6. Suturar la herida y la piel superficial capa por capa utilizando suturas reabsorbibles (6-0) con puntos continuos o interrumpidos (Figura 3D,E).
  7. Retire el catéter de la uretra y vuelva a colocar el pene (Figura 3F).
  8. Apague el cuchillo eléctrico de alta frecuencia y retire la varilla conductora del ano de la rata.
  9. Limpie los materiales quirúrgicos con toallitas con alcohol (etanol al 75%).

4. Cuidados postoperatorios

  1. Coloque la rata sobre una almohadilla caliente (37 °C) y controle de cerca su recuperación de la anestesia. Presta mucha atención a la condición física de la rata, incluido el ritmo respiratorio, la temperatura corporal y el nivel de conciencia.
    NOTA: No devuelva la rata a su jaula hasta que se observe una recuperación completa.
  2. Aloje a las ratas en una jaula limpia y llene la botella de agua con agua enriquecida con morfina (0,4 mg/kg) para el manejo diario del dolor después de la recuperación.
  3. Administrar antiinflamatorios no esteroideos (como carprofeno, 0,5 mg/kg, inyección subcutánea) para la recuperación completa del dolor postoperatorio en las ratas.

5. Evaluación histológica

  1. Cuatro semanas después de la cirugía, induzca el reflejo miccional levantando la cola de las ratas. Coloque la rata en una caja de eutanasia, abra la válvula de la tubería de transmisión deCO2 y eutanasique humanamente a las ratas con una sobredosis de CO2.
  2. Cierre la válvula después de confirmar que la rata está inmóvil y no respira y observar que la pupila está dilatada. Continúe observando la condición física de la rata durante 2 minutos para confirmar que la eutanasia es exitosa.
  3. Saca la rata de la caja de eutanasia.
  4. Limpie el área quirúrgica y los materiales quirúrgicos con toallitas empapadas en etanol al 75%.
  5. Diseccionar el abdomen para observar el estado de llenado de la vejiga y extraer toda la uretra.
  6. Después de recolectar la uretra, coloque la rata en una bolsa sellada y guárdela en un refrigerador a 4 °C para que la procesen los técnicos de laboratorio.
  7. Evaluar morfológicamente la ecografía en busca de patología macroscópica, centrándose en el color y la suavidad del tejido.
  8. Tiñe el tejido de la uretra con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar la estructura de la herida y la capa de células uroteliales.
    1. Sumerja los portaobjetos en xileno para desparafinarlos (2 x 5 min).
    2. Rehidrate los portaobjetos en etanol en orden (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 min).
    4. Teñir los portaobjetos con hematoxilina (10 min).
    5. Lave los portaobjetos en agua desionizada (5 min).
    6. Diferenciar las muestras con solución de diferenciación (40 s).
    7. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 x 3 min).
    8. Teñir los portaobjetos con eosina (2 min).
    9. Rehidratar los portaobjetos en etanol en un pedido (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
    10. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% (1 min) y transparente los portaobjetos con xileno (2 x 1 min).
    11. Agregue el bálsamo neutro y selle con el cubreobjetos.
  9. Aplique la tinción tricrómica de Masson en el tejido de la uretra para resaltar la estructura de la fibra de colágeno.
    1. Sumerja los portaobjetos en xileno para desparafinarlos (2 x 5 min).
    2. Rehidrate los portaobjetos en etanol en orden (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 min).
    4. Tiñe los portaobjetos con la solución de hematoxilina de hierro de Weigert (5 min).
    5. Lave los portaobjetos en agua desionizada (5 min).
    6. Tiñe los portaobjetos con Fucshin de ácido escarlata de Biebrich (5 min).
    7. Lave los portaobjetos en agua desionizada (2 x 3 min).
    8. Tiñir los portaobjetos con una solución de ácido fosfomolíbdico (5 min).
    9. Coloque los portaobjetos en la solución de azul de anilina (5 min). Deseche la solución.
    10. Enjuague los portaobjetos, deshidréguelos con alcohol y séjelos con xileno.
    11. Agregue el bálsamo neutro y selle con el cubreobjetos.
  10. Realizar la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo TGF-β para evaluar la capa de células uroteliales.
    1. Agregue el tampón de recuperación de antígeno apropiado a la olla a presión. Coloque la olla a presión en la placa calefactora y enciéndala a máxima potencia.
    2. Una vez que hierva, transfiera los portaobjetos del agua del grifo a la olla a presión. Deje correr agua fría sobre la olla y caliente los portaobjetos durante 10 minutos.
    3. Apague la olla a presión y retire las correderas. Enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente.
    4. Lave los portaobjetos con una solución de PBS.
    5. Marque los márgenes de las muestras con un rotulador de líquidos.
    6. Sumerja los portaobjetos en PBS más Triton X-100 al 0,3% durante 30 minutos.
    7. Lave los portaobjetos en PBS con agitación suave (2 x 5 min).
    8. Bloquear en suero de cabra al 10% en PBS a temperatura ambiente (60 min).
    9. Aspirar el tampón de bloqueo e incubar con el anticuerpo primario a 4 °C durante toda la noche.
    10. Lave los portaobjetos con 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incubar con anticuerpo secundario marcado con fluorocromo diluido en tampón de dilución de anticuerpos.
    12. Lave los portaobjetos con 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Monte y selle las correderas.
  11. Escanee digitalmente los portaobjetos manchados con un objetivo de 40x en un escáner de portaobjetos.
  12. Analice las imágenes y mida el espesor del urotelio utilizando el software de referencia (Tabla de Materiales).
    1. Abra el software.
    2. Haga clic en Equipo local para seleccionar las imágenes de diapositivas manchadas.
    3. Haga clic en Medir distancia para medir el grosor del urotelio.
    4. Registre los datos sobre el espesor del urotelio.

Resultados

El protocolo descrito en este estudio estableció con éxito la estenosis uretral estable en ratas y demostró una alta reproducibilidad. La duración media de las operaciones fue de 20 minutos y no surgieron problemas técnicos durante los procedimientos. Las muestras uretrales se recolectaron con éxito 4 semanas después del procedimiento.

En el grupo experimental, las vejigas de las ratas mostraron signos de sobredistensión, en contraste con el grupo control donde las vejigas estaban vacías (Figura 4). Estas observaciones indican un deterioro significativo en la función miccional de las ratas después del modelo experimental.

Cuatro semanas después de la cirugía, los sitios de la herida se habían convertido en tejido cicatricial blanco ceroso que sobresalía de la superficie de la uretra (Figura 5B), mientras que las secciones uretrales en el grupo de control parecían lisas y de color rojo pálido (Figura 5A).

El examen histológico con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de la sección uretral reveló un engrosamiento significativo del urotelio y la agregación de linfocitos. Además, la tinción de Masson identificó un área rojiza pronunciada de tejido epitelial uretral hiperplásico y metaplásico, acompañada de fibras de colágeno desordenadas (ver Figura Suplementaria S1 para imágenes detalladas de la tinción de Masson), lo que indica anormalidades en la estructura del músculo liso y las fibras de colágeno (Figura 6).

El análisis de inmunofluorescencia de las criosecciones mostró un aumento del TGF-β en el tejido uretral después de la cirugía (Figura 7), lo que sugiere que la formación de la estructura uretral se asocia con una expresión elevada de TGF-β.

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Figura 1: Principales instrumentos utilizados para establecer el modelo estadounidense. (A) Catéter recubierto de teflón (0,6 x 1 mm); (B) suturas reabsorbibles (6-0), pinzas de tejido, alicates para sujetar agujas y pinzas lisas (de izquierda a derecha); (C) pluma electroquirúrgica de alta frecuencia y varilla conductora anal; (D) el panel de la cuchilla eléctrica de alta frecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparativos para la cirugía. (A) Afeitar la mitad inferior del abdomen de la rata y conectar la varilla conductora anal. (B-D) Ilustrar la colocación del catéter uretral dentro de la uretra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El proceso de electrorresección. (A) Muestra la creación de una incisión longitudinal en la piel del pene que mide 0,8 cm; (B) exposición de la uretra; (C) detalla la electrosección a través de todas las capas de la pared uretral hasta que el catéter dentro de la uretra sea visible. (D,E) Representa la extracción del catéter uretral y la reposición del pene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Estado de llenado de la vejiga en ratas en condiciones anatómicas. (A) Presenta una vejiga vacía de ratas en el grupo de control; (B) muestra una vejiga sobrellena de ratas en el grupo experimental. Las vejigas están dentro del contorno rojo discontinuo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Hallazgos macroscópicos de las muestras uretrales resecadas. (A) El tejido uretral normal. (B) El tejido cicatricial uretral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Resultados de la histología de las muestras uretrales. (A) Tejido uretral del grupo control teñido con H&E (aumento original, 100x). (B) Tinción tricrómica de Masson de una masa uretral con un aumento original de 100x. (C) Ampliación y los datos de medición del espesor del urotelio normal, que es de 85,9 μm. Barra de escala = 20 μm. (D) Muestra la tinción H&E del tejido uretral del grupo experimental con un aumento original de 100x. (E) Representa la tinción tricrómica de Masson del tejido uretral del grupo experimental, también con un aumento original de 100x. Barras de escala = 100 μm. (F) Aumento de la cicatriz de la uretra y los datos de medición de urotelio espesado-231,2 μm. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Hallazgos inmunohistoquímicos en muestras uretrales extirpadas. El marcaje de anticuerpos TGF-β destaca las células uroteliales; Se emite una fluorescencia verde al unirse el anticuerpo a las células. (A-C) Muestran una menor intensidad de señal en las células uroteliales del grupo control en comparación con la mayor intensidad de señal (D-F) en las células uroteliales del grupo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: La imagen completa de la tinción de Masson de muestras de uretra. (A) Tinción de Masson del grupo control; (B) Tinción de Masson del grupo experimental. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los EE.UU. suponen una importante carga sanitaria con un impacto económico sustancial, que afecta negativamente al bienestar psicológico y físico20. Todavía existe la necesidad de un tratamiento que no solo cure completamente la ecografía, sino que también prevenga eficazmente su recurrencia.

En este estudio, utilizamos un modelo de rata para desarrollar un método sencillo y reproducible para imitar la lesión uretral en los pacientes, a la que siguió una lesión uretral inducida por cirugía transuretral. Las ratas son las preferidas como modelos animales porque son rentables, fáciles de manejar, ofrecen repetibilidad y proporcionan datos fiables. El modelo de rata utilizado en este estudio tiene varias ventajas sobre otros modelos: se utiliza habitualmente en varios análisis ómicos y es fácil de manejar. Además, la similitud en la expresión génica de las células epiteliales del tracto urinario entre roedores y humanos hace que el modelo de EE.UU. en ratas sea particularmente adecuado para investigaciones más profundas21.

Como se puede observar en la Figura 7, el TGF-β se expresó en todo el círculo de la uretra tanto en el grupo control como en el experimental, y la expresión de TGF-β en el grupo experimental fue marcadamente superior a la del grupo control. Trabajos previos han documentado que las células de urotelio residentes prácticamente experimentan un cambio fenotípico a miofibroblastos después de la lesión, cuyo proceso es impulsado principalmente por el TGF-β, que ejerce efectos significativos sobre la formación de cicatrices al regular la producción de ECM (matriz extracelular), la modulación inmune, la proliferación celular, la migración y la diferenciación22,23. Nuestro hallazgo sugiere que la sobreexpresión de TGF-β puede promover la formación de cicatrices uretrales, y la secreción de TGF-β no se limita a las células residentes en la superficie de la herida, sino que requiere la participación de toda la uretra.

El pequeño diámetro y la curvatura de la uretra de la rata macho presentan desafíos para detectar cambios en la urodinámica después del modelado. Existe una escasez de investigación sobre métodos para evaluar la función urinaria en ratas macho. En este estudio, utilizamos métodos indirectos para observar cambios en la función urinaria mediante la evaluación del estado de llenado de la vejiga 4 semanas después de la cirugía. Al estimular el reflejo miccional, la observación del abdomen de rata disecado mostró que el grupo experimental exhibió una plenitud vesical persistente, lo que indica un deterioro significativo en la función miccional después del modelado. Estos hallazgos son consistentes con los síntomas clínicos de dificultad para orinar experimentados por pacientes con estenosis uretral24. Sin embargo, el desarrollo de métodos para realizar estudios fisiológicos sobre los parámetros urinarios en ratas macho, como la frecuencia miccional, el volumen miccional promedio y la eficiencia miccional, sigue siendo un desafío.

La elección de los modos y los ajustes de potencia de los cuchillos eléctricos de alta frecuencia influye críticamente en el alcance de la lesión en los procedimientos quirúrgicos. En este estudio se presenta una técnica quirúrgica que asegura un nivel adecuado de lesión, y un grado adecuado del bisturí eléctrico de alta frecuencia que es de 4 W para desarrollar un modelo de US en ratas. El método más común en los modelos de ratas consiste en realizar incisiones con una aguja o un bisturí25. Sin embargo, el uso de un bisturí tiende a aumentar la probabilidad de sangrado continuo debido a la superficie lisa y el pequeño diámetro de la uretra de la rata, que puede dañar inadvertidamente los vasos sanguíneos circundantes.

El bisturí de alta frecuencia ofrece una ventaja significativa al proporcionar hemostasia simultánea mediante la aplicación de una corriente eléctrica estable y ajustable a los tejidos, lo que mejora la estabilidad y la comodidad del procedimiento. Además, la capacidad de control de la configuración de potencia permite una evaluación cuantificable del daño infligido.

Un protocolo experimental ideal produciría consistentemente heridas uretrales de tamaño y profundidad uniformes. En este estudio, se seleccionó el modo de corte mixto unipolar para inducir daño uretral. A diferencia del modo de electrocoagulación, que provoca principalmente la volatilización de los componentes líquidos, el secado, la coagulación de los tejidos y el sellado de los vasos sanguíneos sin ruptura del tejido, lo que provoca una rápida quemadura y adhesión del tejido, el modo de corte permite incisiones precisas, capa por capa, en el tejido del pene. Mientras que la electrocoagulación se ha utilizado comúnmente en modelos de conejos y requiere pasos adicionales, como separar el pene del radio y hacer incisiones con otros instrumentos quirúrgicos26, lo que aumenta los riesgos de trauma y complicaciones en los animales, el modo de corte mixto unipolar permite incisiones directas en el prepucio para exponer la uretra. Este método mejora la eficiencia operativa y minimiza el trauma de los animales de experimentación.

El ajuste de potencia en el estudio anterior no se especificó en detalle, ya que generalmente depende del peso de los animales de experimentación y del área de contacto entre el cuchillo electrónico y el tejido. En este estudio, los sujetos experimentales fueron ratas SD de 6 meses de edad con un peso de entre 400 g y 500 g. Para estas condiciones, se determinó que la potencia óptima estaba entre 4 y 7 W, lo que permitió un control preciso sobre el tamaño y la profundidad de la incisión. Recomendamos que los operadores comiencen con una configuración de potencia más baja cuando utilicen por primera vez la cuchilla de alta frecuencia para desarrollar el modelo de rata de EE. UU., ajustando según sea necesario para encontrar el valor más adecuado para diferentes condiciones.

Además, un paso crítico es el cateterismo de las uretras de las ratas antes de la cirugía. El éxito del cateterismo se confirma cuando el catéter se coloca correctamente en la vejiga. Aunque el catéter sirve como un andamio temporal, debe mantener la posición de la uretra y ayudar a identificar el sitio quirúrgico. La uretra de la rata macho tiene un diámetro relativamente pequeño y hay un espacio limitado entre el prepucio y el tejido del pene, lo que facilita la inserción errónea del catéter en la abertura incorrecta, lo que puede complicar los procedimientos posteriores. La colocación correcta del catéter se verifica cuando la orina fluye, lo que indica que está seguro dentro de la vejiga. Además, el pene cateterizado debe colocarse en un ángulo de 45° para mejorar la estabilidad dentro de la uretra y facilitar el procedimiento quirúrgico.

En conclusión, este estudio demuestra un método novedoso, altamente efectivo y rentable para crear un modelo de US en ratas. Este método se caracteriza por su simplicidad, alta tasa de éxito y estabilidad, ofreciendo una herramienta valiosa para investigar una amplia gama de tratamientos innovadores para la estenosis uretral.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2019A1515012116 y No.2022A1515012559).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
suturas absorbibles (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
Almohadilla de operaciones para animalesProporcionado por el Laboratorio Clave Provincial de Guangdong de Imágenes BiomédicasNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
CarprofenoSigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488-conjugado Cabra Anti-Conejo IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H& E Kit de tinciónAbcamab150669
  electrobisturí de alta frecuenciaBeijing Taktvoll Technology CompanyES-100v
Kit de tinción MassonAlicateHT15
RWD Life ScienceS15001-11
Aceite de parafinaNA
pinzas lisasRWD Life ScienceF13019-12
PentobarbitalsódicoLaboratorio Clave Provincial de Guangdong de Imágenes BiomédicasNA
Sprague – Dawley ratGuangdong Medical Laboratory Animal CenterGDMLAC-035
tijeras de suturaRWD Life ScienceS15001-11
Catéter recubierto de teflón (0,6 mm x 1 mm)DGZF nueva empresa de materialesNA
TGF Beta 1 Anticuerpo policlonalProteintech21898-1-AP
Tijeras de tejidoRWD Life ScienceS13029-14
de sujeción de agujas Merck NA

Referencias

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