Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Elizabeth Abraham; Mikel Zubillaga; Thomas Roule; Eleonora Stronati; Naiara Akizu; Conchi Estaras

doi:10.3791/66866

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Artículo de método

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

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DOI:

10.3791/66866

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14 de junio de 2024

Elizabeth Abraham¹ , Mikel Zubillaga¹ , Thomas Roule² , Eleonora Stronati³ , Naiara Akizu² , Conchi Estaras¹

¹Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, ²Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, ³Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

En este artículo

Resumen

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Resumen

Durante la última década, los enfoques unicelulares se han convertido en el estándar de oro para estudiar la dinámica de la expresión génica, la heterogeneidad celular y los estados celulares dentro de las muestras. Antes de los avances de una sola célula, la viabilidad de capturar el paisaje celular dinámico y las transiciones celulares rápidas durante el desarrollo temprano era limitada. En este trabajo, se diseñó una tubería robusta para realizar análisis de células individuales y núcleos en embriones de ratón desde el día embrionario E6.5 hasta E8, correspondiente al inicio y finalización de la gastrulación. La gastrulación es un proceso fundamental durante el desarrollo que establece las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo y endodermo, que son esenciales para la organogénesis. Se dispone de una amplia bibliografía sobre ómicas unicelulares aplicadas a embriones perigastruladores de tipo salvaje. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes de una sola célula sigue siendo escaso y, a menudo, se limita a poblaciones clasificadas por FACS. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas asociadas con la necesidad de genotipado, embarazos cronometrados, el recuento de embriones con genotipos deseados por embarazo y el número de células por embrión en estas etapas. Aquí, se presenta una metodología diseñada para superar estas limitaciones. Este método establece pautas de reproducción y embarazo cronometrado para lograr una mayor probabilidad de embarazos sincronizados con los genotipos deseados. Los pasos de optimización en el proceso de aislamiento embrionario, junto con un protocolo de genotipado en el mismo día (3 h), permiten realizar una sola célula basada en microgotas en el mismo día, lo que garantiza una alta viabilidad de las células y resultados sólidos. Este método incluye además pautas para el aislamiento óptimo de los núcleos de los embriones. Por lo tanto, estos enfoques aumentan la viabilidad de los enfoques unicelulares de embriones mutantes en la etapa de gastrulación. Anticipamos que este método facilitará el análisis de cómo las mutaciones dan forma al paisaje celular de la gástrula.

Introducción

La gastrulación es un proceso fundamental necesario para el desarrollo normal. Este proceso rápido y dinámico ocurre cuando las células pluripotentes se convierten en precursores específicos del linaje que definen cómo se forman los órganos. Durante años, la gastrulación se definió como la formación de tres poblaciones en gran medida homogéneas: mesodermo, ectodermo y endodermo. Sin embargo, las tecnologías de alta resolución y un número emergente de modelos de células madre embrionarias ^1,2 revelan una heterogeneidad sin precedentes entre las primeras capas germinales ^3,4.