Aquí se describe un método que se puede utilizar para obtener imágenes de cinco o más parámetros fluorescentes mediante microscopía inmunofluorescente. Se describe una línea de análisis para extraer células individuales de estas imágenes y realizar análisis de células individuales a través de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, que pueden identificar subconjuntos de células en secciones de tejido.
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Artículo de método
Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de la histología para investigar la diversidad de células inmunitarias en secciones de tejido, como las derivadas del sistema nervioso central (SNC), está críticamente limitado por el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez. La mayoría de los subconjuntos de células inmunitarias se han definido mediante citometría de flujo mediante el uso de combinaciones complejas de marcadores de proteínas, que a menudo requieren cuatro o más parámetros para identificarlos de manera concluyente, lo que está más allá de las capacidades de la mayoría de los microscopios convencionales. A medida que la citometría de flujo disocia los tejidos y pierde información espacial, existe la necesidad de técnicas que puedan retener la información espacial mientras interrogan las funciones de los tipos de células complejas. Estos problemas se abordan aquí mediante la creación de un método para ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden visualizar mediante la recopilación de las señales de fluoróforos superpuestos espectralmente y el uso de la desmezcla espectral para separar las señales de cada fluoróforo individual. A continuación, estas imágenes se procesan mediante una canalización de análisis para tomar imágenes histológicas de alto parámetro y extraer células individuales de estas imágenes para que las propiedades fluorescentes únicas de cada célula se puedan analizar a nivel de una sola célula. Mediante el uso de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, las células se pueden perfilar en subconjuntos y mapear de nuevo en las secciones de histología no solo para cuantificar su abundancia, sino también para establecer cómo interactúan con el entorno tisular. En general, se demuestra la simplicidad y el potencial del uso de la citometría de histoflujo para estudiar poblaciones inmunitarias complejas en secciones de histología.
Introducción
La inflamación impulsada por las células del sistema inmunitario y las células gliales puede contribuir a trastornos crónicos del SNC en los que cada población puede promover la actividad de la otra 1,2,3. La comprensión de cómo el sistema inmunitario interactúa con estos elementos del SNC para promover la inflamación del SNC es actualmente un tema de interés importante y se ha visto facilitado en gran medida por técnicas de alto parámetro, como la secuenciación de ARN unicelular. A través de la secuenciación de ARN unicelular, hemos descubierto que existe una amplia comunicación entre las células gliales y el sistema inmunitario en varios trastornos del SNC 4,5,6. Comprender cómo estas interacciones están afectando a estos trastornos será crucial para dilucidar la biología de estas enfermedades.
Un problema con los análisis de secuenciación de una sola célula es que estas técnicas requieren que el tejido se interrumpa para obtener células individuales o núcleos, lo que resulta en una pérdida completa de información espacial. Saber dónde existe una célula en un tejido es fundamental para comprender el papel de la célula en la conducción de la inflamación. Por ejemplo, las células inmunitarias como las células B pueden concentrarse en el SNC durante la neuroinflamación; sin embargo, rara vez entran en el parénquima del SNC y en su lugar se concentran en las barreras del SNC7. Dada su localización, es poco probable que estas células contribuyan a la inflamación del SNC al interactuar físicamente con las células gliales en el parénquima del SNC, lo que sugiere que cualquier interacción que puedan tener con las células gliales ocurriría a través de factores secretados. Además, la patología que ocurre en los trastornos del SNC a menudo tiene una estructura 8,9 tal que la localización de una célula en el tejido podría determinar críticamente si está contribuyendo activamente al trastorno o es un espectador. Por lo tanto, el uso de la orientación espacial para evaluar el papel de una célula en la patología es esencial.
Por lo general, el estudio de las células en los tejidos se ha llevado a cabo mediante el uso de inmunohistoquímica o microscopía de fluorescencia inmunitaria. Un problema con estas técnicas es que, por lo general, solo pueden obtener imágenes de hasta cuatro parámetros simultáneamente. Esta es una limitación importante de estas técnicas, ya que sabemos por citometría de flujo y análisis de secuenciación de ARN unicelular que muchas poblaciones celulares requieren dos o más parámetros para su identificación; Además, el número de parámetros necesarios suele aumentar cuando se buscan subconjuntos específicos de un tipo de célula10. Por lo tanto, no es práctico utilizar técnicas de imagen estándar para estudiar cómo pueden estar interactuando subconjuntos de células dentro de un tejido.
Este problema se ha superado parcialmente a través de nuevos métodos de alto parámetro que pueden retener información espacial, como la secuenciación espacial de ARN11 y la citometría de masasde imágenes 12. Si bien estas técnicas son valiosas, tienen varios problemas, como no estar ampliamente disponibles, reducir los datos tridimensionales a dos dimensiones y requerir una experiencia considerable para su ejecución. Otra técnica conocida como tinción secuencial, en la que los tejidos se tiñen con un conjunto de anticuerpos seguido de la inactivación del conjunto anterior de anticuerpos antes de teñirse con otro conjunto de anticuerpos, puede lograr una histología de alto parámetro sin necesidad de equipo especializado o experiencia 13,14,15 . Sin embargo, la tinción secuencial puede ser extremadamente laboriosa y requiere una gran cantidad de tiempo de microscopía, lo que puede ser poco práctico para los laboratorios que no poseen un microscopio personal. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas que puedan ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez en microscopios que estén ampliamente disponibles y de manera oportuna.
Una vez que se han adquirido los datos de alto parámetro, surge otro problema: es poco probable que los métodos convencionales de análisis de imágenes analicen con éxito los datos. Técnicas como el conteo manual o el umbral solo son viables si el análisis consta de un solo parámetro o si varios marcadores tienen la misma localización donde solo se cuentan las señales superpuestas. Esta limitación hace que el análisis tradicional sea inadecuado para trabajar con conjuntos de datos de parámetros altos. El análisis exitoso de estos conjuntos de datos se ha logrado mediante la segmentación de células individuales a partir de imágenes histológicas y luego la realización de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo para identificar los tipos de células16,17. Sin embargo, otro problema que afecta a estos análisis es que solo funcionan para conjuntos de datos en los que todas las celdas de interés están físicamente separadas entre sí, ya que estas técnicas no emplean métodos que puedan separar con precisión las celdas que están en contacto físico. Por lo tanto, se requiere un método más nuevo que pueda realizar análisis de células individuales en secciones de histología, incluso si las células están en contacto físico.
En este artículo, se describe un protocolo simple llamado citometría de histoflujo que ha sido introducido previamente18 y que amplía el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes simultáneamente utilizando microscopios ampliamente disponibles. Este protocolo funciona mediante la tinción de tejidos con tintes superpuestos espectralmente y luego el uso de la compensación espectral para eliminar el sangrado de los canales superpuestos para obtener tinciones individuales claras. Para facilitar el análisis de imágenes histológicas de alto parámetro, se describe una línea de análisis detallada que extrae células individuales de secciones de tejido con el fin de clasificar las células en poblaciones distintas utilizando estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo. Este protocolo funciona en tejidos donde las células están presentes de manera difusa y en tejidos donde las células están muy compactadas entre sí, lo que hace que esta técnica sea versátil para el estudio de tejidos como el SNC tanto en la homeostasis como en la neuroinflamación. La citometría de histoflujo es, por lo tanto, una técnica útil para estudiar las interacciones entre tipos celulares complejos que requieren múltiples marcadores celulares para definir las células mientras se mantiene la información espacial.
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Protocolo
Este protocolo no cubre la sección de tejidos para histología; consulte Jain et al.18 o19 para obtener descripciones de cómo seccionar tejidos para histología. Este protocolo se puede utilizar con cualquier tejido seccionado en portaobjetos de vidrio. En este artículo se utilizan ganglios linfáticos inguinales aislados de un animal inmunizado, tal como se describió anteriormente18. El procedimiento y el cronograma de este protocolo se resumen en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Tinción de secciones de tejido
NOTA: Además de teñir los tejidos con todas las etiquetas de anticuerpos que le interesan al investigador, el investigador también debe preparar controles de un solo color (uno para cada parámetro fluorescente que se va a utilizar) en portaobjetos de tejido adyacentes o idénticos, en los que cada control de color único se tiñe con los reactivos necesarios para producir la señal de un parámetro fluorescente.
- Prepare el tampón de permanente y de bloqueo y el tampón de permanente y tinción (consulte la composición en la Tabla 1 ).
- Descongele las secciones de papel tisú en portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente y limpie la condensación con una toallita. Use un marcador hidrofóbico para delinear el borde de los tejidos que deben teñirse y deje que las marcas se sequen.
- Rehidrate los tejidos sumergiendo las secciones de tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 min. Sacuda el PBS y use una toallita para eliminar el exceso de PBS sin tocar directamente el pañuelo.
- Fije los tejidos agregando suficiente paraformaldehído (PFA) al 4% para cubrir el tejido por completo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
PRECAUCIÓN: El PFA puede ser tóxico y debe manipularse dentro de una campana extractora.
NOTA: Este paso solo es necesario para pañuelos frescos congelados. Si el tejido ya está fijado, ignore este paso. Aquí se describe la fijación de PFA, pero el tejido se puede fijar utilizando otros métodos dependiendo de las necesidades del experimento. - Lave los pañuelos en una bañera de PBS durante 1 minuto con un suave balanceo y luego retire el portaobjetos de la bañera. Reemplace el PBS y repita el lavado 3 veces más.
- Sacuda el exceso de PBS y use una toallita para eliminar el exceso de PBS sin tocar directamente el pañuelo.
- Determine qué anticuerpos secundarios deben utilizarse en el paso 1.12 del protocolo y las especies de animales de las que se derivan los anticuerpos secundarios. Fortalezca la permanente y el tampón de bloqueo añadiendo suero de estos animales a la permanente y el tampón de bloqueo hasta una concentración final del 5% para cada especie.
NOTA: El uso de anticuerpos secundarios ayuda a amplificar la intensidad de la señal. Por lo tanto, se recomienda que los anticuerpos primarios que producen señales débiles se emparejen con anticuerpos secundarios para amplificar sus señales. Si todos los objetivos de anticuerpos que se tiñen son lo suficientemente brillantes como para no requerir anticuerpos secundarios, se pueden omitir los pasos 1.7-1.12 y 1.15. - Bloquea la unión inespecífica de anticuerpos mediante la adición de suficiente Perm fortificado y tampón de bloqueo para cubrir cada tejido. Incubar los portaobjetos durante 1-8 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada protegida de la luz.
- Añada anticuerpos primarios no conjugados al tampón de Perm y tinción en diluciones determinadas experimentalmente (las especies o isotipos de inmunoglobulinas de los anticuerpos primarios deben ser diferentes y distinguibles por los anticuerpos secundarios que el investigador pretende utilizar en el paso 1.12).
- Vierta el tampón permanente y el tampón de bloqueo y use una toallita para eliminar el exceso de tampón sin tocar directamente el tejido. Añadir suficiente Perm y tampón de tinción con anticuerpos primarios al tejido para cubrirlo e incubar el portaobjetos a 4 °C durante 12-48 h.
NOTA: El investigador deberá determinar el momento óptimo para la incubación de los anticuerpos. - Prepare el tampón de bloqueo y el tampón de tinción (Tabla 1).
- Añada anticuerpos secundarios al tampón de tinción preparado en el paso 1.11 en diluciones determinadas experimentalmente. Los anticuerpos secundarios utilizados deben dirigirse a las mismas especies o isotipos de anticuerpos que se utilizaron en el paso 1.9.
- Prepare el tampón de enfriamiento (como en la Tabla 1).
NOTA: Este paso ayuda a reducir la autofluorescencia del tejido. Si esto no es necesario, se pueden omitir los pasos 1.13 y 1.14. - Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada suficiente tampón de enfriamiento para cubrir los tejidos de los portaobjetos e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
- Lave el pañuelo como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada los anticuerpos secundarios diluidos en el tampón de tinción preparado en el paso 1.12 a los tejidos, de modo que los tejidos queden completamente cubiertos por el tampón de tinción. Incubar portaobjetos a 4 °C durante 2-8 h.
- Prepare la solución de bloqueo añadiendo 50 μL de suero normal de cualquier especie de anticuerpos que se vaya a utilizar en el paso 1.18 (5% de cada especie) al tampón de bloqueo preparado en el paso 1.11.
- Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada la solución de bloqueo con suero normal preparado en el paso 1.16 a los tejidos para que queden completamente cubiertos de tampón de tinción. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1-8 h.
- Prepare la solución de tinción añadiendo anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos en diluciones determinadas experimentalmente al tampón de tinción preparado en el paso 1.11. Además, agregue una tinción nuclear, como amarillo nuclear, a la solución de tinción en una dilución determinada experimentalmente.
NOTA: Los pasos 1.18-1.19 solo son necesarios si el investigador necesita utilizar etiquetas de anticuerpos adicionales que no requieran anticuerpos secundarios para la amplificación de la señal. Si no se utilizan anticuerpos conjugados primarios, se pueden añadir tinciones de núcleos en el paso 1.12. - Sacuda el tampón de bloqueo y use una toallita para eliminar el exceso de tampón sin tocar directamente el tejido. Añadir al tejido suficiente solución de tinción preparada en el paso 1.18 para cubrirlo e incubar a 4 °C durante 12-48 h.
- Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. Agregue 5 gotas de montante a cada portaobjetos sin introducir burbujas, e incline suave y lentamente un cubreobjetos de vidrio sobre el pañuelo para cubrir completamente el pañuelo con montante y excluir todas las burbujas de aire. Guarde las diapositivas a 4 °C en la oscuridad hasta que estén listas para ser fotografiadas.
2. Obtención de imágenes de las secciones de tejido
NOTA: En esta etapa, las secciones de tejido se tiñen con todos los anticuerpos de interés para todas las afecciones que se pretenden obtener imágenes, y los controles de un solo color se tiñen con un parámetro fluorescente en cada sección. Las imágenes deben realizarse en un microscopio que tenga múltiples detectores que se puedan ajustar para detectar rangos específicos de luz e, idealmente, debe tener acceso a tantas líneas láser de excitación como sea posible.
- Inserte uno de los portaobjetos completamente teñidos en el microscopio y configure el microscopio para obtener imágenes de la sección utilizando el objetivo que se va a utilizar para recopilar datos.
- En función de los fluoróforos con los que se tiñe el tejido, identifique las líneas de láser de excitación necesarias para estimular esos fluoróforos e identifique los rangos de emisión de cada fluoróforo que contengan la mayor cantidad de señal.
NOTA: Las herramientas de visualización de espectros de fluorescencia en línea (por ejemplo, consulte la Tabla de materiales) pueden ser útiles para identificar las longitudes de onda de excitación óptimas de los fluoróforos e identificar los rangos óptimos para la detección de fluoróforos. Los fluoróforos utilizados para la citometría de histoflujo deben elegirse de manera que cada fluoróforo difiera en la línea láser óptima por la que el fluoróforo es estimulado o difiera en el rango óptimo de longitudes de onda de emisión. Los fluoróforos que tienen longitudes de onda de excitación/emisión más cercanas serán más difíciles de separar. Los fluoróforos utilizados para este estudio se detallan en el apartado de resultados. - Abra el Software 1 (ver Tabla de Materiales) en un microscopio confocal y seleccione la pestaña de configuración en la parte superior. Luego seleccione el botón de hardware en el lado izquierdo y cambie la profundidad de bits a 16 bits.
NOTA: Se recomienda utilizar profundidades de bits más altas, como datos de 16 bits, para la recopilación de datos, ya que esto mejorará la precisión de la compensación espectral. Además, las densidades de píxeles más altas, los números más altos para los promedios de línea y más pasos en la pila z mejorarán la calidad de la separación espectral. - Seleccione la pestaña Adquirir en la parte superior de la pantalla e introduzca la configuración de formato para incluir la densidad de píxeles de la imagen (normalmente, las resoluciones más altas producen mejores resultados).
- Si está disponible, seleccione la adquisición X bidireccional para acelerar el tiempo de obtención de imágenes, siempre que esta función se haya calibrado adecuadamente.
- Elija un valor estenopeico para el microscopio confocal (normalmente entre 400 y 600 nm) en el que los valores más pequeños suelen producir resultados de citometría de histoflujo de mayor calidad, aunque los valores estenopeicos más pequeños dificultarán la adquisición de imágenes y pueden requerir un tiempo de imagen adicional o intensidades de excitación más altas para producir imágenes.
- Seleccione Mostrar panel de escaneo secuencial en la parte superior del menú de la izquierda para abrir la opción de escaneo secuencial. Utilice el signo '+' para configurar secuencias adicionales, donde cada secuencia contendrá una longitud de onda de excitación que se decidió en el paso 2.2.
- Encienda todos los láseres que necesite haciendo clic en los botones ON asociados con los láseres de interés en el centro de la pantalla para ponerlos en un estado ON. Vaya a cada secuencia específica y aumente la potencia del láser en el centro de la pantalla hasta el valor que desee, donde cada secuencia tendrá una longitud de onda de excitación que se utiliza.
- Encienda tantos detectores como sea necesario en la parte inferior de la pantalla en cada secuencia para obtener imágenes de todos los fluoróforos que se obtendrán en esa línea láser. Ajuste los rangos de los detectores haciendo doble clic en sus rangos e ingresando los rangos superior e inferior de las longitudes de onda que deben recopilarse.
NOTA: Se recomienda utilizar detectores de alta sensibilidad siempre que sea posible, e idealmente, todos los canales deben recogerse en los mismos tipos de detectores, aunque esto no es obligatorio. - Pulsa el botón en vivo y, a continuación, concéntrate en la muestra. Utilice el botón Escala automática a la izquierda de la imagen en el software para evaluar si los canales están adecuadamente saturados con señal. El usuario debe ajustar los valores de ganancia y las intensidades del láser en cada secuencia hasta que el escalado automático no alcance el valor máximo (65535 para datos de 16 bits) pero esté muy cerca de la saturación para todos los canales.
NOTA: Dado que los diferentes fluoróforos pueden diferir en su brillo y los diferentes objetivos de anticuerpos pueden diferir en su abundancia, será necesario ajustar la sensibilidad de los detectores para que sea de baja sensibilidad para señales brillantes y alta sensibilidad para señales tenues si ambos fluoróforos son estimulados por el mismo láser (la intensidad del láser no puede cambiar en este escenario ya que ambos fluoróforos se verían afectados). Para obtener los mejores resultados, la señal de fluorescencia de cada canal en el experimento debe equilibrarse de modo que cada canal tenga cantidades aproximadamente equivalentes de señal, lo que reducirá el sangrado espectral a través de otros canales y dará como resultado señales más fuertes. Dado que las diferentes muestras pueden diferir en la abundancia de los marcadores de interés que se tiñen, se recomienda que los ajustes del microscopio se prueben en múltiples condiciones experimentales para confirmar que no se está produciendo blanqueamiento en ninguna de las condiciones experimentales. - Una vez finalizados los ajustes del microscopio, cargue el microscopio con los portaobjetos de control de color individuales y encuentre una tinción representativa para cada fluoróforo. Configure una pila Z enfocándose debajo de la muestra y presionando el botón de inicio en el menú de la pila Z, luego enfocándose sobre la muestra y presionando el botón de finalización .
- Elija el número de pasos y la distancia entre pasos (y utilice el mismo número de pasos y parámetros, como las densidades de píxeles y la profundidad de bits, que se utilizarán para obtener imágenes de las diapositivas completamente manchadas) y, a continuación, pulse el botón de inicio.
NOTA: Idealmente, estas imágenes deben incluir las señales más brillantes de tinción real que se pueden encontrar en el portaobjetos. - Una vez que se hayan obtenido imágenes de los controles de un solo color, proceda a utilizar la misma configuración del microscopio para obtener imágenes de todas las muestras completamente teñidas.
3. Compensación de fluorescencia
- Abra los archivos .lif en el Software 1 y haga clic en la pestaña de proceso.
- Elija el módulo Separación de tinte y, a continuación, elija la opción Separación automática de tinte . Seleccione el método Manual para la separación de tintes y elija no reescalar.
- Abra una de las imágenes de control de un solo color. Inspeccione manualmente los controles de un solo color para el sangrado espectral de un canal al siguiente observando las ventanas en escala de grises para cada canal en busca de evidencia de una señal en canales inapropiados. Use el botón Escala automática si es necesario para ver un sangrado débil.
- Comience a eliminar el sangrado ingresando manualmente números (generalmente de 0 a 1, donde 0 representa que no hay sangrado y 1 representa que no hay sangrado) en la matriz en la pantalla, luego presione aplicar para probar si el sangrado se ha eliminado adecuadamente. Esto debe repetirse hasta que las señales en todos los demás canales, excepto el canal de interés, se hayan reducido a niveles de fondo.
NOTA: La sobrecompensación dará lugar a resultados inexactos, por lo que la fluorescencia debe reducirse a los niveles de fondo, pero no por debajo de ellos. Los datos sobrecompensados aparecerán como un canal que tiene una señal y otros canales que parecen tener agujeros negros donde está la señal de interés (Figura 2). - Una vez completado uno de los controles de un solo color, registre los valores en la matriz y, a continuación, restablezca la matriz y pase al siguiente control de un solo color. Repita este proceso para cada uno de los controles de color.
NOTA: El primer tinte estará en la fila del tinte 1 y la cantidad de fluorescencia que debe eliminarse del tinte 1 estará en las columnas adyacentes. - Reúna todos los valores adquiridos de cada control en una matriz y aplique esta matriz a una muestra completamente teñida. Si la separación parece precisa, aplique la configuración a todas las imágenes del experimento, de lo contrario, vuelva a evaluar los controles de color individuales.
NOTA: La compensación efectiva debería eliminar la mayor parte del sangrado a través de los canales, como se resume y se muestra en la Figura 3. - Guarde todos los archivos compensados en un archivo .lif separado.
4. Identificación de núcleos y células mediante ilastik
- Abra los archivos .lif compensados en FIJI20. Habilite la visualización de pilas en una hiperpila y seleccione una imagen.
- (Opcional) Utilice una herramienta de selección como la herramienta de rectángulo para incluir las partes de la imagen que se analizarán y excluir las áreas que no se analizarán. Recorte la imagen utilizando la función de recorte de > de imagen.
NOTA: Reducir el tamaño de la imagen es útil en los pasos posteriores para reducir el consumo de memoria de acceso aleatorio (RAM) y aumentar la velocidad de procesamiento. - Guarde la imagen como un archivo .tif. Además, guarde la imagen como un archivo hdf5 utilizando el complemento ilastik para FIJI haciendo clic en Complementos > ilastik > Exportar hdf5. Guarde el archivo como "nombre de elección".h5 con compresión 0.
- Abra Ilastik21 y haga un proyecto de clasificación de píxeles. Utilice la función Agregar nueva > Agregar imágenes separadas para agregar al menos 3 imágenes representativas yendo a agregar nuevos datos de entrada.
- Haga clic con el botón derecho en una de las imágenes, seleccione Editar propiedades y cambie el modo de visualización a escala de grises.
- A la izquierda de la pantalla, seleccione la pestaña de selección de funciones. Haga clic en Seleccionar características y seleccione todas las funciones hasta el valor sigma más alto que el programa le permita usar, luego presione OK.
- Ahora seleccione la pestaña Entrenamiento. Utilice la herramienta de pincel (mientras se selecciona la etiqueta uno ) para resaltar las células individuales (Figura 4) de interés, de modo que el interior (citoplasma y núcleo) y la membrana celular se incluyan en el resaltado.
- Repita esto en todas las muestras de entrenamiento en las que se seleccionan todos los tipos de células de interés, y se deben seleccionar varias células de diferentes intensidades, morfologías y localizaciones en el tejido de cada muestra.
NOTA: Dependiendo de los marcadores elegidos para un conjunto individual de tinciones, puede haber o no tinciones intracelulares o tinciones de membrana celular para las células de interés. Independientemente de los marcadores que se utilicen, asegúrese de que el resaltado incluya la tinción más externa en las células de interés e incluya el interior de la célula, independientemente de si se utiliza una tinción intracelular. - A continuación, utilice la etiqueta dos para resaltar todo lo que no sea la celda de interés (Figura 4). Esto puede incluir espacio en blanco, núcleos no marcados o tejido que no tiene marcadores de interés. Asegúrese de incluir el espacio inmediatamente adyacente a las celdas de interés para promover el aprendizaje de los límites exactos de las celdas.
- Utilice la función Live Update para evaluar la calidad de la formación en imágenes de interés. Si el entrenamiento es inadecuado, continúe el entrenamiento en los pasos 4.7 a 4.9. De lo contrario, si está satisfecho, haga clic en la pestaña Exportación de predicción .
- Establezca la fuente en probabilidades. Haga clic en el botón Elegir configuración de imagen de exportación , luego configure el parámetro c para exportar 0-1 (suponiendo que la etiqueta 1 resalte los parámetros de interés).
- Convierta el tipo de datos en un entero de 16 bits y expórtelo como un archivo hdf5 al directorio de interés con el nombre de interés (recomendamos usar {nickname} mask.h5), luego presione OK.
- Haga clic en la pestaña Procesamiento por lotes . Presione el botón Seleccionar archivos de datos sin procesar , seleccione todos los archivos .h5 de interés que requieran procesamiento y, a continuación, presione Abrir. Haga clic en Procesar todos los archivos.
- Repita los pasos 4.4 a 4.13, excepto que en lugar de identificar las células, ahora identifique los núcleos y excluya todo lo demás (Figura 4). Exporte esto como una predicción separada para identificar núcleos celulares.
- Abra Ilastik y cree un nuevo proyecto de conversión de datos. Agregue un archivo hdf5 representativo en la pestaña Datos de entrada mediante la función Agregar nuevo > Agregar imagen separada .
- Haga clic en la pestaña Exportación de datos y elija el botón Elegir configuración de imagen de exportación con la fuente configurada para ingresar. Cambie el formato a tiff de varias páginas, elija una ubicación de guardado con la función de selección y establezca el nombre del archivo en {apodo}. Presione OK.
- Haga clic en la pestaña Procesamiento por lotes y seleccione todos sus archivos hdf5 usando el botón Seleccionar archivos de datos de entrada y presione el botón Procesar todos los archivos .
- Abra el Software 2 (consulte la Tabla de materiales) y agregue todos los archivos tif/tiff generados en los pasos 4.3 y 4.17 usando el botón Agregar archivos . Elija una ubicación para las salidas de archivos y presione el botón Iniciar todo para convertir todos los archivos en archivos .ims. Los archivos ya están listos para el análisis en el Software 3 (ver Tabla de Materiales).
5. Análisis en software 3
- Abra una de las imágenes que contiene todas las manchas fluorescentes. Seleccione Editar-> Agregar canales y agregue los archivos .ims correspondientes a las máscaras hechas sobre núcleos y cuerpos celulares. Repita esto para todas las muestras.
- Seleccione el botón Agregar nuevas celdas . Seleccione la opción Detectar núcleo y célula y continúe.
- Seleccione la máscara sobre los núcleos para que sea el canal de origen para detectar núcleos y seleccione la opción avanzada para dividir los núcleos por puntos de semilla. Elija un valor para el diámetro del núcleo) y continúe.
NOTA: El valor óptimo para el diámetro del núcleo deberá probarse ejecutando la simulación y evaluando manualmente si el programa no está dividiendo suficientes núcleos (se agrupan varios núcleos) o si hay una sobredivisión (un núcleo se divide en más de uno). - Elija un valor para la evaluación de calidad y, a continuación, continúe. Por lo general, es mejor incluir todos los núcleos, ya que la omisión de núcleos puede llevar a que varias células se fusionen en una.
- Elija un valor de umbral para crear superficies nucleares y, a continuación, continúe. Asegúrese de que todos los núcleos, incluso los que son más tenues, sigan incluidos en el umbral. No haga que el umbral sea demasiado bajo, ya que esto puede sobrestimar el tamaño de los núcleos o potencialmente incluir desechos como tinción nuclear.
- Seleccione un valor para el número mínimo de vóxeles por núcleo y continúe. Por lo general, es mejor conservar todo a menos que los escombros o los no núcleos se puedan excluir usando este parámetro.
- Elija la opción Límite de celda y citoplasma , seleccione la máscara sobre células para que sea el canal de origen para detectar cuerpos celulares y, a continuación, continúe.
- Elija un umbral de celda que capture con precisión todas las celdas de interés, pero que no sea tan bajo que incluya el fondo o cualquier detección no específica de celdas. Seleccione la opción para dividir las células que se tocan de manera que haya un núcleo por célula y estén separadas por la distancia de los núcleos. Además, elija expandir las células en núcleos y luego continúe.
- Seleccione un valor para el número mínimo de vóxeles por celda y continúe. Por lo general, es mejor conservar todo a menos que los residuos o las no celdas se puedan excluir mediante este parámetro.
- Evalúe si las superficies creadas sobre las celdas son precisas observando si se han fusionado varias celdas o si faltan celdas. Si las superficies son inadecuadas, vuelva al paso 5.2 y pruebe nuevos parámetros hasta que se determine la configuración óptima.
- Una vez que se establezcan las mejores configuraciones, haga clic en el objeto de celdas creadas en el menú de la izquierda, haga clic en la pestaña de creación y haga clic en el botón Almacenar parámetros para lotes para guardar la configuración utilizada.
- Abra varias ventanas de Software 3 y abra imágenes separadas en cada ventana. Presione el nuevo botón Celdas en cada ventana, elija la configuración guardada en el menú Parámetros de creación favoritos e indique a cada ventana que se ejecute hasta su finalización. Repita esto tantas veces como sea necesario hasta que se analicen todas las muestras.
NOTA: La ejecución de varias instancias de Software 3 hará que este análisis avance más rápido, pero el número de ventanas que se pueden ejecutar en paralelo dependerá de la velocidad de procesamiento de la unidad central de procesamiento (CPU) y de la cantidad de RAM que tenga el equipo en el que se ejecute el análisis. - Una vez completadas todas las muestras, haga clic en el objeto de celdas creado en el menú de la izquierda de cada imagen y haga clic en la pestaña Estadísticas. Haga clic en el botón Configurar lista de valores de estadísticas visibles, anule la selección de todas las estadísticas excepto el valor "Media de intensidad de celda" y, a continuación, presione OK.
- Para cada imagen que deba analizarse, haga clic en el botón Exportar todas las estadísticas a archivo en la pestaña de estadísticas y guarde los archivos en una ubicación.
6. Análisis de citometría de histoflujo y mapeo de poblaciones en secciones de tejido
- Abra Anaconda y JupyterLab dentro de Anaconda. A continuación, abra el script proporcionado en el Archivo de codificación complementaria 1. Ejecute el código mediante el menú Ejecutar y seleccione Ejecutar todas las celdas, o ejecute las celdas individualmente en orden seleccionando Ejecutar celdas seleccionadas.
- Cuando se le pida que introduzca el archivo de origen, introduzca el directorio de archivos para los valores fluorescentes exportados generados en el paso 5.14. El directorio de archivos se puede obtener observando las propiedades de uno de los archivos .csv exportados y copiando la ruta del archivo en el símbolo del sistema.
- A continuación, el programa solicitará una ubicación de salida para los archivos procesados. Introduzca el directorio de archivos de cualquier ubicación que sea adecuada para guardar los archivos procesados. El programa detectará automáticamente el número de canales fluorescentes contenidos en la carpeta.
- Ejecute la siguiente sección del código para anotar los datos con los nombres de cada canal. Este código se puede modificar según sea necesario para cambiar el parámetro "numberOfChannels" para que coincida con el número de canales detectados en el paso 6.3. Además, los nombres de los canales se pueden modificar para tantos canales como sea necesario repitiendo la línea 'ChX':'Marker' tantas veces como sea necesario y modificando los nombres de los marcadores.
- Al ejecutar la siguiente línea de código, se creará un archivo .csv en la ubicación especificada que está anotado y contiene todos los parámetros fluorescentes del conjunto de datos. Repita los pasos 6.1-6.5 para cada conjunto de exportaciones de Software 3 para crear archivos .csv para todos los datos.
- Convierta los archivos .csv en archivos .fcs abriendo el Software 4 (consulte la Tabla de materiales) y arrastrando los archivos .csv a la ventana del programa. El software 4 comenzará automáticamente a convertir los archivos a archivos .fcs.
- Haga doble clic en una de las muestras del Software 4 para abrir una ventana sobre esa muestra. Utilice las herramientas de compuerta del Software 4 para crear una estrategia de compuerta. Se recomienda comenzar por compuerta en un marcador que defina el linaje que contenga todas las celdas de interés, luego continuar con las compuertas que eliminan primero los subconjuntos más raros y luego terminar con los tipos de celdas más abundantes.
- Una vez que se establece una estrategia de compuertas, pruebe la precisión de las compuertas haciendo clic con el botón derecho en esa población en el menú y eligiendo exportar. Exporte todos los parámetros como un archivo .csv con encabezados incluidos.
- Abra JupyterLab en Anaconda. A continuación, abra el script proporcionado en el archivo de codificación complementaria 2 y ejecute el código. Cuando se le solicite que introduzca la ubicación del archivo Software 4, introduzca el directorio de archivos del archivo .csv exportado generado en el paso anterior. El directorio de archivos se puede obtener observando las propiedades del archivo de .csv exportado y copiando la ruta del archivo en el símbolo del sistema.
- Cuando se le pida que agregue la ubicación de salida, elija cualquier directorio de archivos de su elección y asegúrese de que el directorio de archivos incluya el nombre del archivo al final ('directorio de archivos'\filename.txt). Ejecute el resto del código.
- Copie el texto en el archivo .txt y abra el archivo .ims correspondiente en Software 3 para la misma muestra en la que se basan los datos exportados. Haga clic en el objeto Cell en el archivo, cambie a la pestaña de estadísticas, pegue el texto en la barra de búsqueda e inicie la búsqueda. Se resaltarán todas las celdas de interés.
- Inspeccione manualmente si todas las celdas de interés se capturaron mediante la estrategia de compuertas. Si el número de celdas está subestimado o sobreestimado (los ejemplos se muestran en la Figura 5), vuelva al paso 6.7, ajuste la puerta y vuelva a evaluar si las celdas se capturan con precisión con la nueva puerta. Repita esto con todas las puertas de la estrategia de compuerta y evalúe la compuerta en varias muestras.
- Cuando se validen todas las puertas, exporte los datos del Software 4 utilizando la función de editor de tablas y analice los datos utilizando el método de análisis preferido.
NOTA: Las poblaciones de células se pueden mapear de nuevo en las secciones de tejido en el Software 3 identificando la población cerrada como en los pasos 6.8-6.11 y luego creando una superficie basada en las células seleccionadas. Esto se puede hacer para cada población cerrada, como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7.
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Resultados
Figura 1: Flujo de trabajo de citometría de histoflujo. Las secciones de tejido se tiñen con tintes superpuestos espectralmente (paso 1). Las imágenes se recopilan a través de láseres de excitación individuales emparejados con filtros de paso de banda ajustables para minimizar el sangrado espectral entre fluoróforos (paso 2). El sangrado espectral e...
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Discusión
Aquí se describe el uso de la citometría de histoflujo, técnica que ha sido validada previamente18. Se demuestra que cuando se tiñen secciones de tejido con colorantes superpuestos espectralmente, ese sangrado a través de los canales se puede eliminar mediante compensación espectral, lo que da como resultado un mayor número de parámetros fluorescentes que se resuelven claramente de lo que normalmente sería posible con métodos convencionales. Dado que las imágenes histológicas de alto parámetro son...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Agradecimientos
Agradecemos a la Plataforma de Microscopía Avanzada del Hotchkiss Brain Institute por la infraestructura y la experiencia en imágenes. RWJ contó con el apoyo de una beca postdoctoral del programa Eyes High de la Universidad de Calgary y de una beca educativa sin restricciones de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y Roche Canadá. VWY recibió apoyo salarial del programa de Nivel 1 de la Cátedra de Investigación de Canadá. Este trabajo fue apoyado por fondos operativos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud 1049959, la Subvención 3236 de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple Dirigido por el Congreso. La figura 1 se crea con BioRender.com. Las cifras adaptadas en esta publicación se publicaron originalmente en The Journal of Immunology. Rajiv W. Jain, David A. Elliott y V. Wee Yong. 2023. Análisis de célula única de imágenes histológicas de alto parámetro mediante citometría de histoflujo. J. Immunol. 210: 2038-2049. Derechos de autor © [2023]. La Asociación Americana de Inmunólogos, Inc.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100% Etanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Microscopía Electrónica Ciencias | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A4503-50G | |
| Gelatina de tinción de pescado frío | Sigma | G7765 | |
| Recopilación de datos multicanal del script Imaris.ipynb | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Convertir |
| la salida de FlowJo en un archivo txt para la selección de celdas en el script Imaris.ipynb | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Burro |
| anti-rata Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | concentración 1:300 |
| burro anti-ratas DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | concentración 1:200 |
| Suero de burro | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Cabra anti-ratón IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | concentración 1:25 |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Espectrador | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Secciones de amígdalas humanas congeladas | frescas amsbio | HF-707 | |
| Cubreobjetos de vidrio | VWR | 48393 106 | |
| IgA antihumana de cabra Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | concentración 1:400 |
| IgG antihumana de cabra Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | de 1:400 |
| IgM de cabra antihumana Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | concentración 1:300 |
| Anticonejo de cabra A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | concentración 1:250 |
| cabra anti-conejo IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | concentración 1:250 |
| Suero de caballo | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | |
| Convertidor de archivos Imaris | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris con módulo de célula | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX software de ciencias de la vida | Leica | Software 1 | |
| Ratón anti-humano CD20 | VWR | CA95024-322 | concentración 1:40 |
| Ratón anti-humano CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 |
| Suero de Cabra Normal | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Suero de Ratón Normal | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Suero de Conejo Normal | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Suero de Rata Normal | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Disolver en DMSO a una concentración de 2 mg/ml y almacenar a 4° C en la oscuridad |
| Bolígrafo PAP | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Conejo anti-humano Ki67 | Abcam | ab15580 | :500 |
| Conejo anti-ratón Iba1 | Wako | 019-19741 | concentración 1:500 |
| Rata anti-humano Dirigible | 14-5963-82 | concentración 1:40 | |
| Rata anti-ratón B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | concentración 1:250 |
| Rata anti-ratón CD138 | Biolegend | 142502 | concentración 1:200 Rata |
| anti-ratón CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 |
| Rata anti-ratón CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | concentración 1:200 |
| Rata anti-ratón CD45 aloficocianina-R700 | BD Biosciences | 565478 | concentración 1:50 |
| Rata anti-ratón IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | concentración 1:50 |
| SP8 Microscopio confocal | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Referencias
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