Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo

Resumen

Aquí se describe un método que se puede utilizar para obtener imágenes de cinco o más parámetros fluorescentes mediante microscopía inmunofluorescente. Se describe una línea de análisis para extraer células individuales de estas imágenes y realizar análisis de células individuales a través de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, que pueden identificar subconjuntos de células en secciones de tejido.

Resumen

El uso de la histología para investigar la diversidad de células inmunitarias en secciones de tejido, como las derivadas del sistema nervioso central (SNC), está críticamente limitado por el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez. La mayoría de los subconjuntos de células inmunitarias se han definido mediante citometría de flujo mediante el uso de combinaciones complejas de marcadores de proteínas, que a menudo requieren cuatro o más parámetros para identificarlos de manera concluyente, lo que está más allá de las capacidades de la mayoría de los microscopios convencionales. A medida que la citometría de flujo disocia los tejidos y pierde información espacial, existe la necesidad de técnicas que puedan retener la información espacial mientras interrogan las funciones de los tipos de células complejas. Estos problemas se abordan aquí mediante la creación de un método para ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden visualizar mediante la recopilación de las señales de fluoróforos superpuestos espectralmente y el uso de la desmezcla espectral para separar las señales de cada fluoróforo individual. A continuación, estas imágenes se procesan mediante una canalización de análisis para tomar imágenes histológicas de alto parámetro y extraer células individuales de estas imágenes para que las propiedades fluorescentes únicas de cada célula se puedan analizar a nivel de una sola célula. Mediante el uso de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo, las células se pueden perfilar en subconjuntos y mapear de nuevo en las secciones de histología no solo para cuantificar su abundancia, sino también para establecer cómo interactúan con el entorno tisular. En general, se demuestra la simplicidad y el potencial del uso de la citometría de histoflujo para estudiar poblaciones inmunitarias complejas en secciones de histología.

Introducción

La inflamación impulsada por las células del sistema inmunitario y las células gliales puede contribuir a trastornos crónicos del SNC en los que cada población puede promover la actividad de la otra ^1,2,3. La comprensión de cómo el sistema inmunitario interactúa con estos elementos del SNC para promover la inflamación del SNC es actualmente un tema de interés importante y se ha visto facilitado en gran medida por técnicas de alto parámetro, como la secuenciación de ARN unicelular. A través de la secuenciación de ARN unicelular, hemos descubierto que existe una amplia comunicación entre las células gliales y el sistema inmunitario en varios trastornos del SNC ^4,5,6. Comprender cómo estas interacciones están afectando a estos trastornos será crucial para dilucidar la biología de estas enfermedades.

Un problema con los análisis de secuenciación de una sola célula es que estas técnicas requieren que el tejido se interrumpa para obtener células individuales o núcleos, lo que resulta en una pérdida completa de información espacial. Saber dónde existe una célula en un tejido es fundamental para comprender el papel de la célula en la conducción de la inflamación. Por ejemplo, las células inmunitarias como las células B pueden concentrarse en el SNC durante la neuroinflamación; sin embargo, rara vez entran en el parénquima del SNC y en su lugar se concentran en las barreras del SNC⁷. Dada su localización, es poco probable que estas células contribuyan a la inflamación del SNC al interactuar físicamente con las células gliales en el parénquima del SNC, lo que sugiere que cualquier interacción que puedan tener con las células gliales ocurriría a través de factores secretados. Además, la patología que ocurre en los trastornos del SNC a menudo tiene una estructura ^8,9 tal que la localización de una célula en el tejido podría determinar críticamente si está contribuyendo activamente al trastorno o es un espectador. Por lo tanto, el uso de la orientación espacial para evaluar el papel de una célula en la patología es esencial.

Por lo general, el estudio de las células en los tejidos se ha llevado a cabo mediante el uso de inmunohistoquímica o microscopía de fluorescencia inmunitaria. Un problema con estas técnicas es que, por lo general, solo pueden obtener imágenes de hasta cuatro parámetros simultáneamente. Esta es una limitación importante de estas técnicas, ya que sabemos por citometría de flujo y análisis de secuenciación de ARN unicelular que muchas poblaciones celulares requieren dos o más parámetros para su identificación; Además, el número de parámetros necesarios suele aumentar cuando se buscan subconjuntos específicos de un tipo de célula¹⁰. Por lo tanto, no es práctico utilizar técnicas de imagen estándar para estudiar cómo pueden estar interactuando subconjuntos de células dentro de un tejido.

Este problema se ha superado parcialmente a través de nuevos métodos de alto parámetro que pueden retener información espacial, como la secuenciación espacial de ARN¹¹ y la citometría de masas^{de imágenes 12}. Si bien estas técnicas son valiosas, tienen varios problemas, como no estar ampliamente disponibles, reducir los datos tridimensionales a dos dimensiones y requerir una experiencia considerable para su ejecución. Otra técnica conocida como tinción secuencial, en la que los tejidos se tiñen con un conjunto de anticuerpos seguido de la inactivación del conjunto anterior de anticuerpos antes de teñirse con otro conjunto de anticuerpos, puede lograr una histología de alto parámetro sin necesidad de equipo especializado o experiencia 13,14,15 . Sin embargo, la tinción secuencial puede ser extremadamente laboriosa y requiere una gran cantidad de tiempo de microscopía, lo que puede ser poco práctico para los laboratorios que no poseen un microscopio personal. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas que puedan ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez en microscopios que estén ampliamente disponibles y de manera oportuna.

Una vez que se han adquirido los datos de alto parámetro, surge otro problema: es poco probable que los métodos convencionales de análisis de imágenes analicen con éxito los datos. Técnicas como el conteo manual o el umbral solo son viables si el análisis consta de un solo parámetro o si varios marcadores tienen la misma localización donde solo se cuentan las señales superpuestas. Esta limitación hace que el análisis tradicional sea inadecuado para trabajar con conjuntos de datos de parámetros altos. El análisis exitoso de estos conjuntos de datos se ha logrado mediante la segmentación de células individuales a partir de imágenes histológicas y luego la realización de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo para identificar los tipos de células^16,17. Sin embargo, otro problema que afecta a estos análisis es que solo funcionan para conjuntos de datos en los que todas las celdas de interés están físicamente separadas entre sí, ya que estas técnicas no emplean métodos que puedan separar con precisión las celdas que están en contacto físico. Por lo tanto, se requiere un método más nuevo que pueda realizar análisis de células individuales en secciones de histología, incluso si las células están en contacto físico.

En este artículo, se describe un protocolo simple llamado citometría de histoflujo que ha sido introducido previamente¹⁸ y que amplía el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes simultáneamente utilizando microscopios ampliamente disponibles. Este protocolo funciona mediante la tinción de tejidos con tintes superpuestos espectralmente y luego el uso de la compensación espectral para eliminar el sangrado de los canales superpuestos para obtener tinciones individuales claras. Para facilitar el análisis de imágenes histológicas de alto parámetro, se describe una línea de análisis detallada que extrae células individuales de secciones de tejido con el fin de clasificar las células en poblaciones distintas utilizando estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo. Este protocolo funciona en tejidos donde las células están presentes de manera difusa y en tejidos donde las células están muy compactadas entre sí, lo que hace que esta técnica sea versátil para el estudio de tejidos como el SNC tanto en la homeostasis como en la neuroinflamación. La citometría de histoflujo es, por lo tanto, una técnica útil para estudiar las interacciones entre tipos celulares complejos que requieren múltiples marcadores celulares para definir las células mientras se mantiene la información espacial.

Protocolo

Este protocolo no cubre la sección de tejidos para histología; consulte Jain et ^al.18 o¹⁹ para obtener descripciones de cómo seccionar tejidos para histología. Este protocolo se puede utilizar con cualquier tejido seccionado en portaobjetos de vidrio. En este artículo se utilizan ganglios linfáticos inguinales aislados de un animal inmunizado, tal como se describió anteriormente¹⁸. El procedimiento y el cronograma de este protocolo se resumen en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Tinción de secciones de tejido

NOTA: Además de teñir los tejidos con todas las etiquetas de anticuerpos que le interesan al investigador, el investigador también debe preparar controles de un solo color (uno para cada parámetro fluorescente que se va a utilizar) en portaobjetos de tejido adyacentes o idénticos, en los que cada control de color único se tiñe con los reactivos necesarios para producir la señal de un parámetro fluorescente.

1. Prepare el tampón de permanente y de bloqueo y el tampón de permanente y tinción (consulte la composición en la Tabla 1 ).
2. Descongele las secciones de papel tisú en portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente y limpie la condensación con una toallita. Use un marcador hidrofóbico para delinear el borde de los tejidos que deben teñirse y deje que las marcas se sequen.
3. Rehidrate los tejidos sumergiendo las secciones de tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 min. Sacuda el PBS y use una toallita para eliminar el exceso de PBS sin tocar directamente el pañuelo.
4. Fije los tejidos agregando suficiente paraformaldehído (PFA) al 4% para cubrir el tejido por completo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
   PRECAUCIÓN: El PFA puede ser tóxico y debe manipularse dentro de una campana extractora.
   NOTA: Este paso solo es necesario para pañuelos frescos congelados. Si el tejido ya está fijado, ignore este paso. Aquí se describe la fijación de PFA, pero el tejido se puede fijar utilizando otros métodos dependiendo de las necesidades del experimento.
5. Lave los pañuelos en una bañera de PBS durante 1 minuto con un suave balanceo y luego retire el portaobjetos de la bañera. Reemplace el PBS y repita el lavado 3 veces más.
6. Sacuda el exceso de PBS y use una toallita para eliminar el exceso de PBS sin tocar directamente el pañuelo.
7. Determine qué anticuerpos secundarios deben utilizarse en el paso 1.12 del protocolo y las especies de animales de las que se derivan los anticuerpos secundarios. Fortalezca la permanente y el tampón de bloqueo añadiendo suero de estos animales a la permanente y el tampón de bloqueo hasta una concentración final del 5% para cada especie.
   NOTA: El uso de anticuerpos secundarios ayuda a amplificar la intensidad de la señal. Por lo tanto, se recomienda que los anticuerpos primarios que producen señales débiles se emparejen con anticuerpos secundarios para amplificar sus señales. Si todos los objetivos de anticuerpos que se tiñen son lo suficientemente brillantes como para no requerir anticuerpos secundarios, se pueden omitir los pasos 1.7-1.12 y 1.15.
8. Bloquea la unión inespecífica de anticuerpos mediante la adición de suficiente Perm fortificado y tampón de bloqueo para cubrir cada tejido. Incubar los portaobjetos durante 1-8 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada protegida de la luz.
9. Añada anticuerpos primarios no conjugados al tampón de Perm y tinción en diluciones determinadas experimentalmente (las especies o isotipos de inmunoglobulinas de los anticuerpos primarios deben ser diferentes y distinguibles por los anticuerpos secundarios que el investigador pretende utilizar en el paso 1.12).
10. Vierta el tampón permanente y el tampón de bloqueo y use una toallita para eliminar el exceso de tampón sin tocar directamente el tejido. Añadir suficiente Perm y tampón de tinción con anticuerpos primarios al tejido para cubrirlo e incubar el portaobjetos a 4 °C durante 12-48 h.
    NOTA: El investigador deberá determinar el momento óptimo para la incubación de los anticuerpos.
11. Prepare el tampón de bloqueo y el tampón de tinción (Tabla 1).
12. Añada anticuerpos secundarios al tampón de tinción preparado en el paso 1.11 en diluciones determinadas experimentalmente. Los anticuerpos secundarios utilizados deben dirigirse a las mismas especies o isotipos de anticuerpos que se utilizaron en el paso 1.9.
13. Prepare el tampón de enfriamiento (como en la Tabla 1).
    NOTA: Este paso ayuda a reducir la autofluorescencia del tejido. Si esto no es necesario, se pueden omitir los pasos 1.13 y 1.14.
14. Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada suficiente tampón de enfriamiento para cubrir los tejidos de los portaobjetos e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.
15. Lave el pañuelo como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada los anticuerpos secundarios diluidos en el tampón de tinción preparado en el paso 1.12 a los tejidos, de modo que los tejidos queden completamente cubiertos por el tampón de tinción. Incubar portaobjetos a 4 °C durante 2-8 h.
16. Prepare la solución de bloqueo añadiendo 50 μL de suero normal de cualquier especie de anticuerpos que se vaya a utilizar en el paso 1.18 (5% de cada especie) al tampón de bloqueo preparado en el paso 1.11.
17. Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. A continuación, añada la solución de bloqueo con suero normal preparado en el paso 1.16 a los tejidos para que queden completamente cubiertos de tampón de tinción. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1-8 h.
18. Prepare la solución de tinción añadiendo anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos en diluciones determinadas experimentalmente al tampón de tinción preparado en el paso 1.11. Además, agregue una tinción nuclear, como amarillo nuclear, a la solución de tinción en una dilución determinada experimentalmente.
    NOTA: Los pasos 1.18-1.19 solo son necesarios si el investigador necesita utilizar etiquetas de anticuerpos adicionales que no requieran anticuerpos secundarios para la amplificación de la señal. Si no se utilizan anticuerpos conjugados primarios, se pueden añadir tinciones de núcleos en el paso 1.12.
19. Sacuda el tampón de bloqueo y use una toallita para eliminar el exceso de tampón sin tocar directamente el tejido. Añadir al tejido suficiente solución de tinción preparada en el paso 1.18 para cubrirlo e incubar a 4 °C durante 12-48 h.
20. Lave los pañuelos como se describe en los pasos 1.5-1.6. Agregue 5 gotas de montante a cada portaobjetos sin introducir burbujas, e incline suave y lentamente un cubreobjetos de vidrio sobre el pañuelo para cubrir completamente el pañuelo con montante y excluir todas las burbujas de aire. Guarde las diapositivas a 4 °C en la oscuridad hasta que estén listas para ser fotografiadas.

2. Obtención de imágenes de las secciones de tejido

NOTA: En esta etapa, las secciones de tejido se tiñen con todos los anticuerpos de interés para todas las afecciones que se pretenden obtener imágenes, y los controles de un solo color se tiñen con un parámetro fluorescente en cada sección. Las imágenes deben realizarse en un microscopio que tenga múltiples detectores que se puedan ajustar para detectar rangos específicos de luz e, idealmente, debe tener acceso a tantas líneas láser de excitación como sea posible.

1. Inserte uno de los portaobjetos completamente teñidos en el microscopio y configure el microscopio para obtener imágenes de la sección utilizando el objetivo que se va a utilizar para recopilar datos.
2. En función de los fluoróforos con los que se tiñe el tejido, identifique las líneas de láser de excitación necesarias para estimular esos fluoróforos e identifique los rangos de emisión de cada fluoróforo que contengan la mayor cantidad de señal.
   NOTA: Las herramientas de visualización de espectros de fluorescencia en línea (por ejemplo, consulte la Tabla de materiales) pueden ser útiles para identificar las longitudes de onda de excitación óptimas de los fluoróforos e identificar los rangos óptimos para la detección de fluoróforos. Los fluoróforos utilizados para la citometría de histoflujo deben elegirse de manera que cada fluoróforo difiera en la línea láser óptima por la que el fluoróforo es estimulado o difiera en el rango óptimo de longitudes de onda de emisión. Los fluoróforos que tienen longitudes de onda de excitación/emisión más cercanas serán más difíciles de separar. Los fluoróforos utilizados para este estudio se detallan en el apartado de resultados.
3. Abra el Software 1 (ver Tabla de Materiales) en un microscopio confocal y seleccione la pestaña de configuración en la parte superior. Luego seleccione el botón de hardware en el lado izquierdo y cambie la profundidad de bits a 16 bits.
   NOTA: Se recomienda utilizar profundidades de bits más altas, como datos de 16 bits, para la recopilación de datos, ya que esto mejorará la precisión de la compensación espectral. Además, las densidades de píxeles más altas, los números más altos para los promedios de línea y más pasos en la pila z mejorarán la calidad de la separación espectral.
4. Seleccione la pestaña Adquirir en la parte superior de la pantalla e introduzca la configuración de formato para incluir la densidad de píxeles de la imagen (normalmente, las resoluciones más altas producen mejores resultados).
5. Si está disponible, seleccione la adquisición X bidireccional para acelerar el tiempo de obtención de imágenes, siempre que esta función se haya calibrado adecuadamente.
6. Elija un valor estenopeico para el microscopio confocal (normalmente entre 400 y 600 nm) en el que los valores más pequeños suelen producir resultados de citometría de histoflujo de mayor calidad, aunque los valores estenopeicos más pequeños dificultarán la adquisición de imágenes y pueden requerir un tiempo de imagen adicional o intensidades de excitación más altas para producir imágenes.
7. Seleccione Mostrar panel de escaneo secuencial en la parte superior del menú de la izquierda para abrir la opción de escaneo secuencial. Utilice el signo '+' para configurar secuencias adicionales, donde cada secuencia contendrá una longitud de onda de excitación que se decidió en el paso 2.2.
8. Encienda todos los láseres que necesite haciendo clic en los botones ON asociados con los láseres de interés en el centro de la pantalla para ponerlos en un estado ON. Vaya a cada secuencia específica y aumente la potencia del láser en el centro de la pantalla hasta el valor que desee, donde cada secuencia tendrá una longitud de onda de excitación que se utiliza.
9. Encienda tantos detectores como sea necesario en la parte inferior de la pantalla en cada secuencia para obtener imágenes de todos los fluoróforos que se obtendrán en esa línea láser. Ajuste los rangos de los detectores haciendo doble clic en sus rangos e ingresando los rangos superior e inferior de las longitudes de onda que deben recopilarse.
   NOTA: Se recomienda utilizar detectores de alta sensibilidad siempre que sea posible, e idealmente, todos los canales deben recogerse en los mismos tipos de detectores, aunque esto no es obligatorio.
10. Pulsa el botón en vivo y, a continuación, concéntrate en la muestra. Utilice el botón Escala automática a la izquierda de la imagen en el software para evaluar si los canales están adecuadamente saturados con señal. El usuario debe ajustar los valores de ganancia y las intensidades del láser en cada secuencia hasta que el escalado automático no alcance el valor máximo (65535 para datos de 16 bits) pero esté muy cerca de la saturación para todos los canales.
    NOTA: Dado que los diferentes fluoróforos pueden diferir en su brillo y los diferentes objetivos de anticuerpos pueden diferir en su abundancia, será necesario ajustar la sensibilidad de los detectores para que sea de baja sensibilidad para señales brillantes y alta sensibilidad para señales tenues si ambos fluoróforos son estimulados por el mismo láser (la intensidad del láser no puede cambiar en este escenario ya que ambos fluoróforos se verían afectados). Para obtener los mejores resultados, la señal de fluorescencia de cada canal en el experimento debe equilibrarse de modo que cada canal tenga cantidades aproximadamente equivalentes de señal, lo que reducirá el sangrado espectral a través de otros canales y dará como resultado señales más fuertes. Dado que las diferentes muestras pueden diferir en la abundancia de los marcadores de interés que se tiñen, se recomienda que los ajustes del microscopio se prueben en múltiples condiciones experimentales para confirmar que no se está produciendo blanqueamiento en ninguna de las condiciones experimentales.
11. Una vez finalizados los ajustes del microscopio, cargue el microscopio con los portaobjetos de control de color individuales y encuentre una tinción representativa para cada fluoróforo. Configure una pila Z enfocándose debajo de la muestra y presionando el botón de inicio en el menú de la pila Z, luego enfocándose sobre la muestra y presionando el botón de finalización .
12. Elija el número de pasos y la distancia entre pasos (y utilice el mismo número de pasos y parámetros, como las densidades de píxeles y la profundidad de bits, que se utilizarán para obtener imágenes de las diapositivas completamente manchadas) y, a continuación, pulse el botón de inicio.
    NOTA: Idealmente, estas imágenes deben incluir las señales más brillantes de tinción real que se pueden encontrar en el portaobjetos.
13. Una vez que se hayan obtenido imágenes de los controles de un solo color, proceda a utilizar la misma configuración del microscopio para obtener imágenes de todas las muestras completamente teñidas.

3. Compensación de fluorescencia

1. Abra los archivos .lif en el Software 1 y haga clic en la pestaña de proceso.
2. Elija el módulo Separación de tinte y, a continuación, elija la opción Separación automática de tinte . Seleccione el método Manual para la separación de tintes y elija no reescalar.
3. Abra una de las imágenes de control de un solo color. Inspeccione manualmente los controles de un solo color para el sangrado espectral de un canal al siguiente observando las ventanas en escala de grises para cada canal en busca de evidencia de una señal en canales inapropiados. Use el botón Escala automática si es necesario para ver un sangrado débil.
4. Comience a eliminar el sangrado ingresando manualmente números (generalmente de 0 a 1, donde 0 representa que no hay sangrado y 1 representa que no hay sangrado) en la matriz en la pantalla, luego presione aplicar para probar si el sangrado se ha eliminado adecuadamente. Esto debe repetirse hasta que las señales en todos los demás canales, excepto el canal de interés, se hayan reducido a niveles de fondo.
   NOTA: La sobrecompensación dará lugar a resultados inexactos, por lo que la fluorescencia debe reducirse a los niveles de fondo, pero no por debajo de ellos. Los datos sobrecompensados aparecerán como un canal que tiene una señal y otros canales que parecen tener agujeros negros donde está la señal de interés (Figura 2).
5. Una vez completado uno de los controles de un solo color, registre los valores en la matriz y, a continuación, restablezca la matriz y pase al siguiente control de un solo color. Repita este proceso para cada uno de los controles de color.
   NOTA: El primer tinte estará en la fila del tinte 1 y la cantidad de fluorescencia que debe eliminarse del tinte 1 estará en las columnas adyacentes.
6. Reúna todos los valores adquiridos de cada control en una matriz y aplique esta matriz a una muestra completamente teñida. Si la separación parece precisa, aplique la configuración a todas las imágenes del experimento, de lo contrario, vuelva a evaluar los controles de color individuales.
   NOTA: La compensación efectiva debería eliminar la mayor parte del sangrado a través de los canales, como se resume y se muestra en la Figura 3.
7. Guarde todos los archivos compensados en un archivo .lif separado.

4. Identificación de núcleos y células mediante ilastik

1. Abra los archivos .lif compensados en FIJI²⁰. Habilite la visualización de pilas en una hiperpila y seleccione una imagen.
2. (Opcional) Utilice una herramienta de selección como la herramienta de rectángulo para incluir las partes de la imagen que se analizarán y excluir las áreas que no se analizarán. Recorte la imagen utilizando la función de recorte de > de imagen.
   NOTA: Reducir el tamaño de la imagen es útil en los pasos posteriores para reducir el consumo de memoria de acceso aleatorio (RAM) y aumentar la velocidad de procesamiento.
3. Guarde la imagen como un archivo .tif. Además, guarde la imagen como un archivo hdf5 utilizando el complemento ilastik para FIJI haciendo clic en Complementos > ilastik > Exportar hdf5. Guarde el archivo como "nombre de elección".h5 con compresión 0.
4. Abra Ilastik²¹ y haga un proyecto de clasificación de píxeles. Utilice la función Agregar nueva > Agregar imágenes separadas para agregar al menos 3 imágenes representativas yendo a agregar nuevos datos de entrada.
5. Haga clic con el botón derecho en una de las imágenes, seleccione Editar propiedades y cambie el modo de visualización a escala de grises.
6. A la izquierda de la pantalla, seleccione la pestaña de selección de funciones. Haga clic en Seleccionar características y seleccione todas las funciones hasta el valor sigma más alto que el programa le permita usar, luego presione OK.
7. Ahora seleccione la pestaña Entrenamiento. Utilice la herramienta de pincel (mientras se selecciona la etiqueta uno ) para resaltar las células individuales (Figura 4) de interés, de modo que el interior (citoplasma y núcleo) y la membrana celular se incluyan en el resaltado.
8. Repita esto en todas las muestras de entrenamiento en las que se seleccionan todos los tipos de células de interés, y se deben seleccionar varias células de diferentes intensidades, morfologías y localizaciones en el tejido de cada muestra.
   NOTA: Dependiendo de los marcadores elegidos para un conjunto individual de tinciones, puede haber o no tinciones intracelulares o tinciones de membrana celular para las células de interés. Independientemente de los marcadores que se utilicen, asegúrese de que el resaltado incluya la tinción más externa en las células de interés e incluya el interior de la célula, independientemente de si se utiliza una tinción intracelular.
9. A continuación, utilice la etiqueta dos para resaltar todo lo que no sea la celda de interés (Figura 4). Esto puede incluir espacio en blanco, núcleos no marcados o tejido que no tiene marcadores de interés. Asegúrese de incluir el espacio inmediatamente adyacente a las celdas de interés para promover el aprendizaje de los límites exactos de las celdas.
10. Utilice la función Live Update para evaluar la calidad de la formación en imágenes de interés. Si el entrenamiento es inadecuado, continúe el entrenamiento en los pasos 4.7 a 4.9. De lo contrario, si está satisfecho, haga clic en la pestaña Exportación de predicción .
11. Establezca la fuente en probabilidades. Haga clic en el botón Elegir configuración de imagen de exportación , luego configure el parámetro c para exportar 0-1 (suponiendo que la etiqueta 1 resalte los parámetros de interés).
12. Convierta el tipo de datos en un entero de 16 bits y expórtelo como un archivo hdf5 al directorio de interés con el nombre de interés (recomendamos usar {nickname} mask.h5), luego presione OK.
13. Haga clic en la pestaña Procesamiento por lotes . Presione el botón Seleccionar archivos de datos sin procesar , seleccione todos los archivos .h5 de interés que requieran procesamiento y, a continuación, presione Abrir. Haga clic en Procesar todos los archivos.
14. Repita los pasos 4.4 a 4.13, excepto que en lugar de identificar las células, ahora identifique los núcleos y excluya todo lo demás (Figura 4). Exporte esto como una predicción separada para identificar núcleos celulares.
15. Abra Ilastik y cree un nuevo proyecto de conversión de datos. Agregue un archivo hdf5 representativo en la pestaña Datos de entrada mediante la función Agregar nuevo > Agregar imagen separada .
16. Haga clic en la pestaña Exportación de datos y elija el botón Elegir configuración de imagen de exportación con la fuente configurada para ingresar. Cambie el formato a tiff de varias páginas, elija una ubicación de guardado con la función de selección y establezca el nombre del archivo en {apodo}. Presione OK.
17. Haga clic en la pestaña Procesamiento por lotes y seleccione todos sus archivos hdf5 usando el botón Seleccionar archivos de datos de entrada y presione el botón Procesar todos los archivos .
18. Abra el Software 2 (consulte la Tabla de materiales) y agregue todos los archivos tif/tiff generados en los pasos 4.3 y 4.17 usando el botón Agregar archivos . Elija una ubicación para las salidas de archivos y presione el botón Iniciar todo para convertir todos los archivos en archivos .ims. Los archivos ya están listos para el análisis en el Software 3 (ver Tabla de Materiales).

5. Análisis en software 3

1. Abra una de las imágenes que contiene todas las manchas fluorescentes. Seleccione Editar-> Agregar canales y agregue los archivos .ims correspondientes a las máscaras hechas sobre núcleos y cuerpos celulares. Repita esto para todas las muestras.
2. Seleccione el botón Agregar nuevas celdas . Seleccione la opción Detectar núcleo y célula y continúe.
3. Seleccione la máscara sobre los núcleos para que sea el canal de origen para detectar núcleos y seleccione la opción avanzada para dividir los núcleos por puntos de semilla. Elija un valor para el diámetro del núcleo) y continúe.
   NOTA: El valor óptimo para el diámetro del núcleo deberá probarse ejecutando la simulación y evaluando manualmente si el programa no está dividiendo suficientes núcleos (se agrupan varios núcleos) o si hay una sobredivisión (un núcleo se divide en más de uno).
4. Elija un valor para la evaluación de calidad y, a continuación, continúe. Por lo general, es mejor incluir todos los núcleos, ya que la omisión de núcleos puede llevar a que varias células se fusionen en una.
5. Elija un valor de umbral para crear superficies nucleares y, a continuación, continúe. Asegúrese de que todos los núcleos, incluso los que son más tenues, sigan incluidos en el umbral. No haga que el umbral sea demasiado bajo, ya que esto puede sobrestimar el tamaño de los núcleos o potencialmente incluir desechos como tinción nuclear.
6. Seleccione un valor para el número mínimo de vóxeles por núcleo y continúe. Por lo general, es mejor conservar todo a menos que los escombros o los no núcleos se puedan excluir usando este parámetro.
7. Elija la opción Límite de celda y citoplasma , seleccione la máscara sobre células para que sea el canal de origen para detectar cuerpos celulares y, a continuación, continúe.
8. Elija un umbral de celda que capture con precisión todas las celdas de interés, pero que no sea tan bajo que incluya el fondo o cualquier detección no específica de celdas. Seleccione la opción para dividir las células que se tocan de manera que haya un núcleo por célula y estén separadas por la distancia de los núcleos. Además, elija expandir las células en núcleos y luego continúe.
9. Seleccione un valor para el número mínimo de vóxeles por celda y continúe. Por lo general, es mejor conservar todo a menos que los residuos o las no celdas se puedan excluir mediante este parámetro.
10. Evalúe si las superficies creadas sobre las celdas son precisas observando si se han fusionado varias celdas o si faltan celdas. Si las superficies son inadecuadas, vuelva al paso 5.2 y pruebe nuevos parámetros hasta que se determine la configuración óptima.
11. Una vez que se establezcan las mejores configuraciones, haga clic en el objeto de celdas creadas en el menú de la izquierda, haga clic en la pestaña de creación y haga clic en el botón Almacenar parámetros para lotes para guardar la configuración utilizada.
12. Abra varias ventanas de Software 3 y abra imágenes separadas en cada ventana. Presione el nuevo botón Celdas en cada ventana, elija la configuración guardada en el menú Parámetros de creación favoritos e indique a cada ventana que se ejecute hasta su finalización. Repita esto tantas veces como sea necesario hasta que se analicen todas las muestras.
    NOTA: La ejecución de varias instancias de Software 3 hará que este análisis avance más rápido, pero el número de ventanas que se pueden ejecutar en paralelo dependerá de la velocidad de procesamiento de la unidad central de procesamiento (CPU) y de la cantidad de RAM que tenga el equipo en el que se ejecute el análisis.
13. Una vez completadas todas las muestras, haga clic en el objeto de celdas creado en el menú de la izquierda de cada imagen y haga clic en la pestaña Estadísticas. Haga clic en el botón Configurar lista de valores de estadísticas visibles, anule la selección de todas las estadísticas excepto el valor "Media de intensidad de celda" y, a continuación, presione OK.
14. Para cada imagen que deba analizarse, haga clic en el botón Exportar todas las estadísticas a archivo en la pestaña de estadísticas y guarde los archivos en una ubicación.

6. Análisis de citometría de histoflujo y mapeo de poblaciones en secciones de tejido

1. Abra Anaconda y JupyterLab dentro de Anaconda. A continuación, abra el script proporcionado en el Archivo de codificación complementaria 1. Ejecute el código mediante el menú Ejecutar y seleccione Ejecutar todas las celdas, o ejecute las celdas individualmente en orden seleccionando Ejecutar celdas seleccionadas.
2. Cuando se le pida que introduzca el archivo de origen, introduzca el directorio de archivos para los valores fluorescentes exportados generados en el paso 5.14. El directorio de archivos se puede obtener observando las propiedades de uno de los archivos .csv exportados y copiando la ruta del archivo en el símbolo del sistema.
3. A continuación, el programa solicitará una ubicación de salida para los archivos procesados. Introduzca el directorio de archivos de cualquier ubicación que sea adecuada para guardar los archivos procesados. El programa detectará automáticamente el número de canales fluorescentes contenidos en la carpeta.
4. Ejecute la siguiente sección del código para anotar los datos con los nombres de cada canal. Este código se puede modificar según sea necesario para cambiar el parámetro "numberOfChannels" para que coincida con el número de canales detectados en el paso 6.3. Además, los nombres de los canales se pueden modificar para tantos canales como sea necesario repitiendo la línea 'ChX':'Marker' tantas veces como sea necesario y modificando los nombres de los marcadores.
5. Al ejecutar la siguiente línea de código, se creará un archivo .csv en la ubicación especificada que está anotado y contiene todos los parámetros fluorescentes del conjunto de datos. Repita los pasos 6.1-6.5 para cada conjunto de exportaciones de Software 3 para crear archivos .csv para todos los datos.
6. Convierta los archivos .csv en archivos .fcs abriendo el Software 4 (consulte la Tabla de materiales) y arrastrando los archivos .csv a la ventana del programa. El software 4 comenzará automáticamente a convertir los archivos a archivos .fcs.
7. Haga doble clic en una de las muestras del Software 4 para abrir una ventana sobre esa muestra. Utilice las herramientas de compuerta del Software 4 para crear una estrategia de compuerta. Se recomienda comenzar por compuerta en un marcador que defina el linaje que contenga todas las celdas de interés, luego continuar con las compuertas que eliminan primero los subconjuntos más raros y luego terminar con los tipos de celdas más abundantes.
8. Una vez que se establece una estrategia de compuertas, pruebe la precisión de las compuertas haciendo clic con el botón derecho en esa población en el menú y eligiendo exportar. Exporte todos los parámetros como un archivo .csv con encabezados incluidos.
9. Abra JupyterLab en Anaconda. A continuación, abra el script proporcionado en el archivo de codificación complementaria 2 y ejecute el código. Cuando se le solicite que introduzca la ubicación del archivo Software 4, introduzca el directorio de archivos del archivo .csv exportado generado en el paso anterior. El directorio de archivos se puede obtener observando las propiedades del archivo de .csv exportado y copiando la ruta del archivo en el símbolo del sistema.
10. Cuando se le pida que agregue la ubicación de salida, elija cualquier directorio de archivos de su elección y asegúrese de que el directorio de archivos incluya el nombre del archivo al final ('directorio de archivos'\filename.txt). Ejecute el resto del código.
11. Copie el texto en el archivo .txt y abra el archivo .ims correspondiente en Software 3 para la misma muestra en la que se basan los datos exportados. Haga clic en el objeto Cell en el archivo, cambie a la pestaña de estadísticas, pegue el texto en la barra de búsqueda e inicie la búsqueda. Se resaltarán todas las celdas de interés.
12. Inspeccione manualmente si todas las celdas de interés se capturaron mediante la estrategia de compuertas. Si el número de celdas está subestimado o sobreestimado (los ejemplos se muestran en la Figura 5), vuelva al paso 6.7, ajuste la puerta y vuelva a evaluar si las celdas se capturan con precisión con la nueva puerta. Repita esto con todas las puertas de la estrategia de compuerta y evalúe la compuerta en varias muestras.
13. Cuando se validen todas las puertas, exporte los datos del Software 4 utilizando la función de editor de tablas y analice los datos utilizando el método de análisis preferido.
    NOTA: Las poblaciones de células se pueden mapear de nuevo en las secciones de tejido en el Software 3 identificando la población cerrada como en los pasos 6.8-6.11 y luego creando una superficie basada en las células seleccionadas. Esto se puede hacer para cada población cerrada, como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7.

Resultados

Figura 1: Flujo de trabajo de citometría de histoflujo. Las secciones de tejido se tiñen con tintes superpuestos espectralmente (paso 1). Las imágenes se recopilan a través de láseres de excitación individuales emparejados con filtros de paso de banda ajustables para minimizar el sangrado espectral entre fluoróforos (paso 2). El sangrado espectral entre canales se corrige en función de una matriz de compensación generada mediante controles de tejido teñidos de un solo color (paso 3). A continuación, los núcleos y las células de las imágenes se identifican mediante ilastik (paso 4) y se dividen en células individuales en el Software 3 (paso 5). Se incorporan parámetros adicionales antes de exportar todos los datos del software 3 al software 4 para realizar el análisis de citometría de flujo. A continuación, las identidades de las células se exportan desde el software 4 y se asignan de nuevo a los ID de las células en el tejido original para resolver la localización espacial de las células en secciones de tejido (paso 6). Los signos de dinero representan el software comercial que requiere compra, y los signos de computadora representan el software libre. El tiempo aproximado para cada paso se indica al lado del reloj de arena. El software comercial se enumera en la Tabla de materiales. Esta figura es una adaptación de Jain et ^al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 3, los tejidos de los ganglios linfáticos se tiñeron con un anticuerpo CD138 anti-ratón de rata emparejado con un anticuerpo secundario anti-rata Dylight 405, Nuclear Yellow, un anticuerpo CD4 anti-ratón de rata conjugado con Alexa Fluor 488, un anticuerpo IgD anti-ratón de rata conjugado con PerCP-eF710, un anticuerpo Iba1 anti-ratón de conejo emparejado con un anticuerpo secundario anti-conejo Alexa Fluor 546 de Donkey, un anticuerpo CD3ε anti-ratón en ratas conjugado con PE-eF610, un anticuerpo B220 anti-ratón en ratas conjugado con Alexa Fluor 647 y un anticuerpo CD45 anti-ratón en ratas conjugado con APC-R700. Se utilizó un láser violeta de 405 nm para estimular los tintes Dylight 405 y Nuclear yellow, y sus emisiones se detectaron en los rangos de 408-438 nm y 460-530 nm, respectivamente. Se utilizó un láser verde de 488 nm para estimular los tintes Alexa Fluor 488 y PerCP-eF710, y sus emisiones se detectaron en los rangos de 495-545 nm y 682-750 nm, respectivamente. Se utilizó un láser amarillo-verde de 552 nm para estimular los tintes Alexa Fluor 546 y PE-eF610, y sus emisiones se detectaron en los rangos de 557-600 nm y 615-652 nm, respectivamente. Se utilizó un láser rojo de 640 nm para estimular los tintes Alexa Fluor 647 y APC-R700, y sus emisiones se detectaron en los rangos de 647-682 nm y 700-750 nm, respectivamente.

Figura 2: Ejemplos de compensación deficiente y de calidad. Las perlas se tiñeron con un anticuerpo conjugado con PE-eFluor 610 y se obtuvieron imágenes en los canales correspondientes a los canales PE-eFluor 610 (PE-eF610) y Alexa Fluor 546 (A546). Se aplicaron diferentes grados de compensación a la misma imagen en el canal A546 (reducción del 10 % para la infracompensación, del 28 % para la compensación correcta y del 60 % para la sobrecompensación) para eliminar el sangrado del fluoróforo PE-eF610, lo que dio lugar a diferentes grados de separación. Para visualizar mejor los grados de compensación, se proporciona una versión iluminada de las imágenes de sangrado. La flecha amarilla apunta a la misma área en cada imagen correspondiente a un área donde hay tinción real en el canal PE-eF610. Barras de escala: 4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Compensación de fluorescencia mediante secciones de tejido teñidas. (A-C) Las secciones de tejido de los ganglios linfáticos se tiñeron con Abs individuales conjugados con los fluoróforos enumerados. A continuación, se tomaron imágenes de muestras de una sola tinción sin compensación en todos los canales (A, arriba) y se aplicó una compensación a los controles de un solo color (A, abajo). (B) Se cuantificó el sangrado entre canales en (A) (intensidad de fluorescencia media de la imagen actual dividida por la intensidad de fluorescencia media del canal del fluoróforo actual) y se presentó en mapas de calor. Los cuadrados blancos representan valores que superan el 100% de sangrado. (C) La superposición espectral se evalúa en las condiciones de compensación no compensada y basada en células comparando la separación espectral de Iba1-A546 y CD3-PEeF610 en muestras completamente teñidas. Barras de escala: 30 μm. Esta figura es una adaptación de Jain et ^al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Siguiendo este protocolo (resumido en la Figura 1), los tintes fluorescentes superpuestos espectralmente deben separarse de manera efectiva, como se muestra en la Figura 3A, B. Si bien es posible que no sea posible la separación completa de los colorantes, la separación debe ser suficiente para diferenciar claramente los diferentes tipos de células (Figura 3C). Si todavía hay sombras de células superpuestas espectralmente en otro canal, esto puede indicar que todavía se está produciendo un sangrado, y las imágenes pueden necesitar un reprocesamiento (Figura 2). Además, la sobrecompensación será evidente si el área compensada cae por debajo de los niveles de fluorescencia asociados con la tinción de fondo y aparecerá como áreas negras donde alguna vez estuvo el sangrado (Figura 2). La sobrecompensación puede provocar la pérdida de señal real en el canal al que se ha aplicado la compensación y debe evitarse. No obstante, si este protocolo se ha seguido correctamente, no debería haber problemas con la compensación y, por lo tanto, el investigador debe considerar si cualquier sangrado aparente es artificial o parte de la biología.

Figura 4: Ejemplo de detección de núcleos y células basada en ilastik. La tinción amarilla nuclear (arriba a la izquierda) se utilizó para identificar los núcleos (arriba a la derecha en amarillo) y lo que no es un núcleo (en azul). La tinción representativa de CD45 (que se muestra en la parte inferior izquierda) se utiliza para identificar las células (abajo a la derecha en amarillo) y lo que no es una célula (en azul). Esta figura es una adaptación de Jain et ^al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que los tintes se separan con precisión, la división del tejido en células individuales es esencial para realizar análisis de una sola célula. El protocolo descrito aquí utiliza el aprendizaje automático definido por el usuario (Figura 4) para separar las células incluso cuando están muy compactadas, como se muestra en los ganglios linfáticos que se muestran en la Figura 6.

Figura 5: Evaluación de si una puerta se ha ajustado correctamente. Se muestra una tinción representativa de CD138 (coloreada en cian) en un ganglio linfático, y se hicieron tres puertas separadas (el diagrama de puntos a la izquierda) para identificar las células CD138⁺ en el tejido. Una estimación demasiado conservadora de las células CD138⁺ se muestra como la puerta azul y se asigna al tejido en azul. Una estimación equilibrada de las células CD138⁺ se muestra como la puerta verde y se asigna al tejido en verde. Una estimación excesivamente permisiva de las células CD138⁺ se muestra como la puerta roja y se asigna al tejido en rojo. El círculo amarillo identifica un área donde las células CD138⁺ no están siendo identificadas por la puerta demasiado conservadora, y el círculo magenta identifica un área sin células CD138+, que se afirma que contiene células CD138⁺ por la puerta excesivamente permisiva. Barras de escala: 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se debe tener cuidado al determinar las posiciones precisas de las puertas en el análisis de citometría de flujo (que se muestra en la Figura 5) para asegurarse de que estas puertas no sobreestimen o subestimen la abundancia de células. Esto debe determinarse mapeando las células de nuevo en el tejido, como en la Figura 5, para ver si las células que expresan sus marcadores de interés se capturan en el análisis. Si se seleccionan demasiadas celdas (por ejemplo, las celdas que no expresan CD138 se seleccionan como CD138⁺), entonces las puertas deben cambiarse para que sean menos permisivas, y si se seleccionan demasiadas celdas, entonces las puertas deben ser más permisivas. Las compuertas deben optimizarse para la selectividad, de modo que las compuertas aguas arriba se optimicen primero y, a continuación, cada compuerta posterior de la cadena. Al final, la optimización efectiva de una estrategia de compuerta debe ser capaz de resolver subconjuntos de celdas de interés (Figura 6 y Figura 7).

Figura 6: Identificación de células en secciones de tejido basada en citometría de flujo. (A) Los valores fluorescentes exportados de células individuales del Software 3 en secciones de ganglios linfáticos se analizaron en el Software 4 para identificar las poblaciones celulares declaradas en función de la estrategia de compuerta mostrada. (B) Las poblaciones identificadas en el Software 4 se mapearon de nuevo en la misma sección de tejido y se generaron superficies para cada población. No se muestra la tinción CD45. Barra de escala: 30 μm. Esta figura es una adaptación de Jain et ^al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Desglose de tinciones individuales y poblaciones en ganglios linfáticos de ratón. Las tinciones individuales para los marcadores de células inmunitarias se muestran en los paneles superiores, y su población cerrada asociada identificada en la Figura 6A se muestra debajo de cada tinción. Barra de escala: 30 μm, que se muestra en el panel superior izquierdo. Esta figura es una adaptación de Jain et ^al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta técnica se^{ha utilizado previamente} para caracterizar los infiltrados de células inmunitarias en la médula espinal durante la neuroinflamación y se ha validado que se encuentran proporciones equivalentes de células inmunitarias infiltrantes mediante citometría de histoflujo y citometría de flujo. La técnica también ha sido validada, demostrando que funciona en bazos y cerebros de ratones y puede identificar diferencias entre las condiciones de tratamiento, que se reprodujeron en experimentos idénticos de citometría de flujo (no publicado). Esta técnica también se ha utilizado para analizar la médula espinal de ratones que reciben inyecciones estereotácticas de los modelos del SNC.

Figura 8: Separación de 8 tintes en una sección de amígdala humana. Las secciones de amígdalas humanas se tiñeron con CD20 para identificar las células B e IgM, IgA e IgG para identificar las células plasmáticas. Se incorporaron las tinciones Blimp1 y CD38 para validar aún más las identidades de las células plasmáticas, y Ki67 para identificar las células proliferantes. La mancha amarilla nuclear no se muestra en la imagen combinada. Barra de escala: 22 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta técnica también se puede aplicar para analizar secciones de tejido humano. Como ejemplo de tinción dentro de tejidos humanos, se tiñeron secciones de amígdalas humanas con una selección de 8 marcadores: un anticuerpo IgM antihumano de cabra conjugado con Dylight 405, Nuclear Yellow, un anticuerpo IgA antihumano de cabra conjugado con Alexa Fluor 488, un anticuerpo CD20 antihumano de ratón emparejado con un fragmento F(ab')2 anti-ratón de cabra conjugado con PerCP-eFluor 710, un anti-humano IgG de cabra conjugado con Cy3, un anticuerpo Ki67 anti-humano de conejo emparejado con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con PE-Alexa Fluor 610, un anticuerpo Blimp1 anti-rata de rata emparejado con un anticuerpo anti-rata de burro conjugado con Alexa Fluor 647, y un anticuerpo CD38 anti-humano de ratón conjugado con APC-R700. Después de la compensación, se puede ver la separación de estos marcadores en la sección de la amígdala (Figura 8). Esto demuestra la utilidad de esta técnica en diferentes tejidos y especies.

Nombre de la solución	Composición		Cómo hacer
Búfer de bloqueo	10% de suero de caballo, 1% de BSA y 0,1% de gelatina de manchas de pescado frío en PBS		Añadir 5 ml de suero de caballo, 0,5 g de BSA, 50 μl de gelatina fría para manchas de pescado a 45 ml de PBS. Alícuota estas soluciones en tubos de 15 ml y almacenarlos a -20 °C hasta que los necesite.
Permanente y búfer de bloqueo	10% Suero de caballo, 1% BSA, 0,1% gelatina de tinte de pescado frío, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween-20 en PBS		Agregue 5 ml de suero para caballos, 0,5 g de BSA, 50 μl de gelatina fría para manchas de pescado, 50 μl de Triton X-100 y 25 μl de Tween-20 a 45 ml de PBS. Alícuota estas soluciones en tubos de 15 ml y almacenarlos a -20 °C hasta que los necesite.
Permanente y tampón de tinción	1% BSA, 0,1% gelatina de tinción de pescado frío, 0,5% Triton X-100 en PBS		Agregue 0,5 g de BSA, 50 μL de gelatina fría para manchas de pescado y 250 μL de Triton X-100 a 50 mL de PBS. Alícuota estas soluciones en tubos de 15 ml y almacenarlos a -20 °C hasta que los necesite.
Tampón de enfriamiento	5% Trueblack, 66,5% etanol, 28,5% agua		Precalienta la solución Trueblack a 70 °C durante 5 min. A continuación, añada 50 μL de Trueblack a 950 μL de etanol al 70% para hacer el tampón Trueblack. Haz esto fresco cada vez. Necesitará ~ 500 μL por portaobjetos, aunque las cantidades específicas dependerán de la naturaleza de sus tejidos.
Tampón de tinción	1% de BSA y 0,1% de gelatina de manchas de pescado frío en PBS		Añadir 0,5 g de BSA y 50 μL de gelatina fría para manchas de pescado a 50 mL de PBS. Alícuota estas soluciones en tubos de 15 ml y almacenarlos a -20 °C hasta que los necesite.

Tabla 1: Una lista de las soluciones y sus composiciones necesarias para teñir secciones de tejido.

Archivo de codificación suplementario 1: Un script de Python que recopila los valores de fluorescencia de cada canal y crea un archivo de resumen. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Un script de Python que crea una lista de todos los números de identificación de las celdas cerradas en un archivo de texto. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí se describe el uso de la citometría de histoflujo, técnica que ha sido validada previamente¹⁸. Se demuestra que cuando se tiñen secciones de tejido con colorantes superpuestos espectralmente, ese sangrado a través de los canales se puede eliminar mediante compensación espectral, lo que da como resultado un mayor número de parámetros fluorescentes que se resuelven claramente de lo que normalmente sería posible con métodos convencionales. Dado que las imágenes histológicas de alto parámetro son difíciles de analizar con métodos convencionales, se proporciona una tubería de análisis para segmentar células individuales a partir de estas imágenes. Al exportar las firmas fluorescentes de estas células individuales, se demuestra que los análisis de una sola célula, como los realizados en la citometría de flujo, se pueden aplicar de manera similar a las imágenes histológicas. Mientras que la citometría de flujo no incluye el análisis espacial, se demuestra que la citometría de histoflujo puede mapear las poblaciones identificadas mediante estrategias de compuerta en secciones de tejido para evaluar su localización espacial. En general, se demuestra que la citometría de histoflujo combina las fortalezas de la citometría de flujo y la histología.

Si bien la citometría de histoflujo tiene la ventaja de retener información espacial, también tiene muchas de las mismas limitaciones que tiene la histología convencional. Si bien la citometría de flujo es excelente para cuantificar células en todo un tejido, la histología generalmente se realiza mediante el análisis de una pequeña muestra de secciones de tejido que se toman como representativas del tejido. Para que la histología pueda cuantificar con precisión el número de células en un tejido, sería necesario obtener imágenes de cada corte de tejido tomado del tejido y cuantificar el número de células en cada uno, lo que sería poco práctico. Otro problema es que algunas células se dividen por la mitad durante la sección del tejido, y no hay forma de reconstruir estas células. De hecho, una limitación del protocolo enumerado aquí es que no incluye ningún método para excluir las células en los bordes del tejido. A pesar de estas limitaciones, una ventaja que tiene la citometría de histoflujo sobre la citometría de flujo es que no hay necesidad de disociar los tejidos en suspensiones unicelulares, lo que puede introducir sesgos en las poblaciones que se aíslan o se capturan de manera inadecuada²². Por lo tanto, aunque la citometría de histoflujo tiene varias ventajas sobre la citometría de flujo convencional, la obtención de mediciones en todo el tejido seguirá siendo un desafío.

Aquí, se demuestra que se pueden separar ocho parámetros fluorescentes superpuestos espectralmente; sin embargo, otros han logrado separar 13 tintes fluorescentes¹⁷. El número de colorantes que se pueden separar depende de las propiedades del microscopio en el que se recogen los datos. Los tintes fluorescentes difieren en cuanto a sus longitudes de onda de excitación óptimas y en sus longitudes de onda de emisión más comunes. Los microscopios que hacen uso de estas propiedades mediante el uso de una amplia gama de longitudes de onda de excitación para que coincidan con mayor precisión con las longitudes de onda de excitación óptimas de los fluoróforos y mediante el ajuste de los detectores de emisión para que coincidan con precisión con las longitudes de onda emitidas con mayor frecuencia maximizarán la separación de los tintes fluorescentes. Minimizar la superposición espectral es esencial para generar datos de alta calidad, ya que la compensación del sangrado a través de los canales puede afectar potencialmente el rango dinámico de detección de los fluoróforos que interactúan entre sí y, por lo tanto, la separación basada en la emisión y la excitación es un primer paso crítico para separar los fluoróforos. Dependiendo de las propiedades de su microscopio y del número de parámetros fluorescentes que se necesiten obtener imágenes, puede ser necesario colocar varios fluoróforos que comparten las mismas longitudes de onda de excitación pero difieren en sus longitudes de onda de emisión en las mismas líneas láser. Por lo general, esto se logra mediante el uso de colorantes fluorescentes base en combinación con colorantes fluorescentes conjugados, donde los colorantes conjugados emiten a longitudes de onda más largas y, por lo tanto, se pueden distinguir en función de sus longitudes de onda de emisión. En general, los tintes deben distinguirse por sus frecuencias de excitación o de emisión para una separación efectiva.

Obtener una compensación perfecta se complica por varios factores, incluido el aspecto espacial de la compensación. En primer lugar, el hecho de que un fluoróforo emita un fotón se basa en parte en el azar²³, donde los fotones recogidos en cada imagen están sesgados hacia las ubicaciones de tinción densa. Sin embargo, las áreas menos densamente teñidas pueden, por casualidad, emitir un fotón que aparece en uno de los canales superpuestos, pero no en el canal principal. Dado que la compensación se aplica por vóxel, la superposición espectral no se eliminará durante la compensación debido a la falta de colocalización espacial. Esto se puede ver en la Figura 2, donde la compensación da como resultado que las ubicaciones de tinción densa se reduzcan (los bordes de las cuentas) pero no el centro de las cuentas, donde hay una tinción mínima y una superposición deficiente con los canales con sangrado. Es probable que esta tinción en el centro de las cuentas se deba a otro problema que puede afectar a la compensación, que es que los fotones producidos fuera del plano focal pueden aparecer en vóxeles en el plano focal que es poco probable que se reproduzcan tanto en el canal principal como en el canal que necesita ser compensado²⁴. Como resultado, este "ruido" no se eliminará de manera efectiva mediante compensación sin introducir una sobrecompensación. Estos problemas se pueden abordar parcialmente mediante el uso de un promedio de líneas, la medición de los valores fluorescentes de un solo vóxel varias veces y el uso del promedio para limitar el impacto de los eventos aleatorios. Si se utiliza un microscopio confocal, el tamaño del agujero de alfiler también puede reducirse para excluir la incorporación de fotones desenfocados a las imágenes^25,26. El uso de estas correcciones tiene el costo de tiempos adicionales de adquisición de imágenes, que pueden llegar a ser extensos.

Si bien esta técnica se desarrolló utilizando imágenes tomadas de un microscopio confocal, funcionará con otros tipos de microscopios. Otros, utilizando métodos similares, han aplicado estas metodologías a imágenes tomadas de microscopios de dos fotones¹⁷ con gran éxito. Si bien esta técnica podría aplicarse a imágenes tomadas de microscopios de campo amplio, existen varias ventajas asociadas con los microscopios confocales que mejoran la resolución de si un fotón se originó dentro del plano focal. Dado que una resolución precisa de la ubicación de los fotones (es decir, el seccionamiento óptico) mejora la calidad de la compensación, se espera que la calidad de la compensación sea relativamente pobre. Esto podría abordarse mediante el uso de la deconvolución para eliminar los fotones desenfocados y mejorar la resolución de las imágenes de campo amplio²⁷. Una advertencia importante que determinará si la deconvolución es compatible con este protocolo es si los valores de fluorescencia en cada canal permanecen proporcionales entre sí en todas las imágenes analizadas. Si los valores de fluorescencia después de la deconvolución se vuelven arbitrarios, es poco probable que la misma matriz de compensación generada en una imagen se aplique con éxito a otras imágenes. En general, el factor más importante que determina si un microscopio puede utilizar este flujo de trabajo es si ese microscopio tiene detectores cuyo rango de detección se puede ajustar de manera flexible. Si esto está disponible, entonces múltiples fluoróforos estimulados a través de la misma excitación pueden resolverse mediante la detección de sus espectros de emisión dentro de diferentes ventanas de detección.

El número de parámetros fluorescentes puede incrementarse aún más si se combina con técnicas para teñir en serie el mismo tejido varias veces¹³, como el IBEX^14,15. Con el uso de la tinción en serie, se puede medir un número ilimitado de parámetros; Sin embargo, esto puede llevar mucho tiempo. El uso de una combinación de los métodos de compensación discutidos aquí y la tinción en serie puede reducir considerablemente el tiempo requerido para tomar estas imágenes, ya que se pueden obtener imágenes de más canales simultáneamente para cada ronda de tinción. La tubería de análisis descrita aquí se escalará para tantos marcadores como se desee y será compatible con secciones de tejido teñidas en serie.

Un paso crítico en este proceso de análisis es la segmentación de células individuales a partir de imágenes histológicas. Encontrar estrategias efectivas para segmentar con precisión las células a partir de imágenes histológicas es un problema común²⁸, y continuamente se están desarrollando nuevos métodos. Si bien este método puede separar eficazmente las células individuales de las células compactas, los límites exactos de las células suelen ser imperfectos. Por lo tanto, se recomienda que los usuarios limiten el análisis solo a las poblaciones de células que les interesan, ya que cuantas menos células deban separarse, más precisos serán los límites celulares. Los usuarios también pueden lograr una mejor separación de células definiendo múltiples poblaciones en ilastik, lo que permite al programa segmentar diferentes poblaciones de células. Un problema con este enfoque, sin embargo, es que las células definidas de esta manera no se pueden combinar en el mismo objeto de "célula" en el Software 3 y posiblemente podría conducir a un doble recuento de células. No obstante, si los límites de celda más precisos son críticos para un experimento, se puede utilizar este enfoque. Se recomienda que los usuarios experimenten con los algoritmos de segmentación más nuevos a medida que se desarrollen e incorporen a esta canalización para obtener resultados aún mejores.

Pueden surgir varios problemas a la hora de desarrollar un nuevo panel de citometría de histoflujo. En primer lugar, es fundamental que los diferentes marcadores fluorescentes produzcan cantidades más o menos similares de fluorescencia. Si un fluoróforo es mucho más brillante que otro, esto puede ser problemático si este fluoróforo se filtra en otro fluoróforo, ya que el sangrado puede superar la tinción real en ese canal. Esto se observa en la Figura 3, donde Alexa Fluor 546 sangra gravemente en PE-eFluor 610. Si bien la compensación aún puede eliminar este sangrado, a menudo todavía habrá algo de fluorescencia persistente debido a que la luz desenfocada no se elimina, lo que puede hacer que la compensación sea incompleta. Además, la mayoría de los detectores utilizados en los microscopios no tienen rangos dinámicos extensos como los de los citómetros de flujo. Como resultado, a medida que aumenta el sangrado en un canal, una mayor parte del rango dinámico de ese detector se saturará con señales de otros fluoróforos y menos del fluoróforo de interés. Cuando se elimina la compensación de un canal de este tipo con un sangrado extenso, se puede resolver la señal verdadera; Sin embargo, la diferencia entre las células positivas para ese marcador y las negativas para él se reducirá y puede resultar en una incapacidad para resolver estados intermedios o incluso potencialmente resolver positivos a partir de negativos. Por lo tanto, debe evitarse la superposición entre canales. En segundo lugar, el brillo de los marcadores puede cambiar entre diferentes tejidos. Un panel de marcadores que funciona en los ganglios linfáticos, por ejemplo, puede que ya no funcione cuando se usa en el bazo o en el sistema nervioso central porque un marcador puede volverse demasiado brillante o tenue, lo que hace que ese canal sangre demasiado hacia otros canales o se vea abrumado por el sangrado de otros canales. En tal caso, puede ser necesario cambiar los fluoróforos de los marcadores o cambiar el uso de anticuerpos primarios conjugados por el uso de anticuerpos secundarios. Por último, puede ser valioso aprovechar las diferencias en la localización de los marcadores cuando hay una superposición excesiva entre canales. Si dos canales se superponen fuertemente entre sí, pero uno es un marcador nuclear y el otro es un marcador de superficie de celda, entonces la superposición espectral se afectará mínimamente entre sí porque la compensación no afectará a los mismos vóxeles. Si es posible, los paneles deben diseñarse para garantizar que los canales superpuestos difieran en su localización o que los marcadores se expresen en celdas separadas.

En general, se demuestra que la citometría de histoflujo es una técnica versátil para analizar imágenes histológicas a nivel de una sola célula. Mientras que las técnicas más antiguas pueden limitarse al análisis de células que no están en contacto directo célula con célula, esta línea de análisis puede separar las células en contacto, lo que la hace apropiada para el estudio de células en tejidos en homeostasis o durante la inflamación cuando las células inmunitarias se agrupan en los sitios de daño.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100% Etanol	Sigma	676829-1L
4% PFA	Microscopía Electrónica Ciencias	157-4
Anaconda	N/A	N/A
Albúmina sérica bovina	Sigma	A4503-50G
Gelatina de tinción de pescado frío	Sigma	G7765
Recopilación de datos multicanal del script Imaris.ipynb	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Convertir
la salida de FlowJo en un archivo txt para la selección de celdas en el script Imaris.ipynb	N/A	N/A	https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Burro
anti-rata Alexa Fluor 647	JacksonImmunoResearch	712-605-153	concentración 1:300
burro anti-ratas DyLight 405	Jackson ImmunoResearch	712-475-153	concentración 1:200
Suero de burro	JacksonImmunoResearch	017-000-001
F(ab')2-Cabra anti-ratón IgG PerCP-eFluor 710	Thermofisher	46-4010-82	concentración 1:25
FIJI	N/A	N/A	https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo	FlowJo LLC		Software 4
Espectrador			https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Secciones de amígdalas humanas congeladas	frescas amsbio	HF-707
Cubreobjetos de vidrio	VWR	48393 106
IgA antihumana de cabra Alexa Fluor 488	JacksonImmunoResearch	109-546-011	concentración 1:400
IgG antihumana de cabra Cy3	JacksonImmunoResearch	709-166-098	de 1:400
IgM de cabra antihumana Dylight 405	JacksonImmunoResearch	109-476-129	concentración 1:300
Anticonejo de cabra A546	Thermo Fisher Scientific	A-11035	concentración 1:250
cabra anti-conejo IgG PE-Alexa Fluor 610	Thermofisher	A-20981	concentración 1:250
Suero de caballo	Sigma	H1138
Ilastik	N/A	N/A
Ilastik FIJI plugin	N/A	N/A
Convertidor de archivos Imaris	Oxford Instruments		Software 2
Imaris con módulo de célula	Oxford Instruments		Software 3
kimwipe	Kimtech	34155
LasX software de ciencias de la vida	Leica		Software 1
Ratón anti-humano CD20	VWR	CA95024-322	concentración 1:40
Ratón anti-humano CD38 APC-R700	BD Biosciences	564980	1:20
Suero de Cabra Normal	JacksonImmunoResearch	005-000-001
Suero de Ratón Normal	JacksonImmunoResearch	015-000-001
Suero de Conejo Normal	JacksonImmunoResearch	011-000-001
Suero de Rata Normal	JacksonImmunoResearch	012-000-120
Nuclear Yellow	Abcam	ab138903	Disolver en DMSO a una concentración de 2 mg/ml y almacenar a 4° C en la oscuridad
Bolígrafo PAP	Cedarlane	MU22
PBS	Gibco	10010-023
Conejo anti-humano Ki67	Abcam	ab15580	:500
Conejo anti-ratón Iba1	Wako	019-19741	concentración 1:500
Rata anti-humano Dirigible		14-5963-82	concentración 1:40
Rata anti-ratón B220 Alexa Fluor 647	BioLegend	103226	concentración 1:250
Rata anti-ratón CD138	Biolegend	142502	concentración 1:200 Rata
anti-ratón CD3 PE-eFluor 610	Thermo Fisher Scientific	61-0032-82	1:40
Rata anti-ratón CD4 Alexa Fluor 488	BioLegend	100529	concentración 1:200
Rata anti-ratón CD45 aloficocianina-R700	BD Biosciences	565478	concentración 1:50
Rata anti-ratón IgD PerCP-eFluor 710	Thermo Fisher Scientific	46-5993-82	concentración 1:50
SP8 Microscopio confocal	Leica
Triton X-100	Sigma	X100-500ml
Trueblack	Biotium	23007
Tween-20	Sigma	P7949-500ml
Ultracomp ebeads	Thermofisher	01-2222-42