Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Un modelo de lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral por pinzamiento cruzado de la aorta supracelíaca en ratas

926 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

En este artículo

Resumen

Este estudio describe un modelo de lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral durante el pinzamiento cruzado de la aorta supracelíaca mediante laparotomía en ratas. Permite investigar los efectos clínicos y biológicos del pinzamiento aórtico, así como el impacto de la isquemia-reperfusión en los órganos subyacentes y las lesiones pulmonares remotas.

Resumen

La cirugía abierta para los aneurismas de aorta abdominal requiere una interrupción transitoria de la circulación sanguínea, lo que provoca isquemia-reperfusión de los órganos aguas abajo. Las arterias renal, mesentérica y esplácnica pueden estar afectadas. Ningún tratamiento ha demostrado ser eficaz para prevenir la lesión pulmonar remota causada por isquemia-reperfusión después del pinzamiento aórtico supracelíaco. Para estudiar las vías fisiopatológicas de la lesión pulmonar aguda y los tratamientos farmacológicos, se ha desarrollado un modelo experimental de pinzamiento aórtico en ratas.

Se administra analgesia subcutánea con buprenorfina (0,05 mg/kg) antes del procedimiento. La anestesia general con ventilación espontánea se induce utilizando gas halógeno (isoflurano al 2,5%) a través de una máscara. Una laparotomía xyfopúbica se realiza en una mesa caliente (temperatura controlada por vía intrarectal). El bloqueo gastroesplénico y los intestinos se retraen hacia el flanco derecho y el hígado se moviliza hacia la parte superior del abdomen. El diafragma y sus pilares están identificados para permitir la liberación paso a paso de la aorta supracelíaca de su paso intradiafragmático. La disección se realiza suavemente para lograr el control circunferencial de la aorta entre los pilares del diafragma. El tronco celíaco subyacente y la arteria mesentérica superior se identifican cuidadosamente. Se puede usar una pinza microvascular para la oclusión aórtica por encima de las arterias viscerales. El pinzamiento adecuado se verifica por la ausencia de pulsatilidad aórtica, asociada con palidez del intestino delgado. La rata permanece anestesiada durante toda la duración de la isquemia. Al final de la duración de la isquemia, se retira el microclamp y se comprueba la pulsatilidad aórtica, así como la recoloración intestinal. La pared abdominal se cierra con una sutura, seguida del cierre de la piel de la rata. Al final del período de reperfusión, el animal se anestesia de la misma manera. Se sacrifica por desangramiento durante la toma de muestras de sangre y luego se puede recolectar el pulmón. La lesión pulmonar se puede evaluar mediante análisis de gases en sangre, gravimetría pulmonar y examen histológico. Las muestras de pulmón también se pueden utilizar para análisis de RT-PCR y Western blot.

Introducción

Un aneurisma aórtico es una dilatación focal y permanente de la aorta1. La evolución de un aneurisma tiende a la ruptura, asociada a hemorragia masiva, que conlleva una mortalidad significativa2. Por lo tanto, el enfoque del tratamiento radica en la prevención de esta complicación dramática. Los aneurismas aórticos suelen ser infrarrenales y se pueden tratar con endoprótesis aórtica. Un endoinjerto aorto-bi-ilíaco es un stent bifurcado cubierto que se introduce de forma mínimamente invasiva a través de las arterias femorales mediante un abordaje percutáneo. Esta técnica no requiere pinzamiento aórtico y evita causar isquemia visceral. Se puede realizar bajo anestesia local. Por el contrario, los aneurismas aórticos más extensos, como los aneurismas toracoabdominales y los aneurismas aórticos abdominales complejos, son más difíciles de tratar con técnicas endovasculares. Esto se debe a la afectación de las arterias renales, la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco dentro del segmento aneurismático (Figura 1). Estas arterias viscerales principales deben reconstruirse además de la aorta misma. Por lo tanto, el abordaje endovascular mínimamente invasivo requiere un procedimiento más complejo que involucre el uso de endoinjertos fenestrados y/o ramificados para la reconstrucción de la arteria visceral. La principal limitación de estos endoinjertos es el largo tiempo de fabricación, a menudo varios meses, lo que los hace inadecuados para el tratamiento de emergencia. En tales casos, la reparación quirúrgica abierta convencional sigue siendo una opción factible y confiable.

El tratamiento mediante reparación abierta requiere laparotomía y pinzamiento supravisceral, es decir, isquemia visceral temporal. La tasa de complicaciones es alta durante el tratamiento de estos aneurismas toracoabdominales. La mortalidad varía de 5 a 15%3. Las complicaciones pulmonares ocurren en el 60% y las complicaciones renales en el 40%4. Estas complicaciones, asociadas a una respuesta inflamatoria sistémica, pueden progresar a insuficiencia multivisceral5. Esta morbimortalidad es multifactorial, involucrando agresión quirúrgica, anestesia, analgesia, variaciones hemodinámicas, shock hemorrágico y fenómenos de isquemia-reperfusión. La agresión quirúrgica contribuye a la manifestación de complicaciones, ya sea que el abordaje incluya toracotomía, frenotomía, lumbotomía o laparotomía, modificando la mecánica ventilatoria, con un deterioro particular de la función diafragmática6.

La reperfusión temporal de isquemia visceral afecta a los órganos aguas abajo, incluyendo el tracto digestivo, el sistema esplácnico, los riñones y las extremidades inferiores7. Las complicaciones pulmonares son los eventos adversos más frecuentes después de la cirugía de aorta toracoabdominal. Su origen es multifactorial. El pinzamiento de la aorta supracelíaca no causa directamente isquemia-reperfusión pulmonar. Sin embargo, la isquemia-reperfusión de los órganos viscerales aguas abajo desencadena una respuesta inflamatoria sistémica importante. La hipótesis de un vínculo causal entre la isquemia-reperfusión visceral y la aparición de lesiones remotas, particularmente daño pulmonar, está bien respaldada. La disfunción endotelial pulmonar, un componente crítico de la membrana alveolo-capilar, parece ser fundamental para el desarrollo de la lesión pulmonar aguda (LPA). Una respuesta inflamatoria sistémica masiva y la activación de neutrófilos juegan un papel fundamental en este proceso.

El ALI a menudo se define en función de criterios histológicos en lugar de la presentación clínica. ALI se refiere a un trastorno inflamatorio agudo caracterizado por la alteración de las barreras endoteliales y epiteliales pulmonares. La membrana alveolo-capilar, la unidad funcional del pulmón, consta de tres componentes: el endotelio microvascular, el espacio intersticial y el epitelio alveolar.

Un sello distintivo de ALI es el aumento de la permeabilidad de esta barrera, impulsado por la infiltración de neutrófilos y la liberación de mediadores proinflamatorios citotóxicos. El daño epitelial alveolar afecta tanto a los neumocitos tipo I como a los tipo II. Las células tipo I, que cubren el 95% de la superficie alveolar, son altamente susceptibles a las lesiones y juegan un papel clave en el intercambio de gases. Las células de tipo II, más numerosas pero que cubren un área más pequeña, son esenciales para la producción de surfactantes, la reparación epitelial y el transporte de iones. Después de una lesión, las células tipo II contribuyen a la restauración de la integridad alveolar a través de su capacidad regenerativa y diferenciación en células tipo I.

Múltiples vías de muerte celular se han implicado en la lesión epitelial durante la LPA, siendo las células tipo I particularmente vulnerables. La ALI se evalúa comúnmente mediante la evaluación del edema pulmonar, con o sin medidas de permeabilidad microvascular para reflejar la disfunción endotelial.

El objetivo de este modelo es investigar el vínculo entre la isquemia-reperfusión visceral y el desarrollo de lesión pulmonar remota, tanto a nivel metabólico como mecanicista, como se ilustra en la Figura 2. Esta conexión específica sigue siendo solo parcialmente comprendida. Nuestro modelo de pinzamiento aórtico representa un escenario de isquemia-reperfusión visceral en una aorta sana, sin la presencia de un aneurisma de aorta abdominal en rata. Por encima del tronco celíaco, no hay ramas principales ni en humanos ni en ratas. La aorta por encima de este nivel corresponde a la aorta supra-celiácea, que da lugar solo a pequeñas ramas parietales que irrigan la pared torácica. Por lo tanto, no hay diferencias significativas en la anatomía vascular de los vasos principales a este nivel entre humanos y ratas.

El uso de este modelo permite una amplia exploración. Ayudará a identificar biomarcadores tempranos en el desarrollo de lesiones tisulares remotas. Además, este modelo permite el estudio de posibles inhibidores, incluidos los inhibidores de mediadores circulantes o los inhibidores de lesiones específicas de órganos remotos.

Se utilizan otros modelos de isquemia-reperfusión para estudiar lesiones remotas. Los modelos de isquemia-reperfusión cerebral, intestinal y renal están fuertemente representados 8,9,10. Existe una amplia investigación sobre el daño pulmonar después de la isquemia-reperfusión intestinal debido a la oclusión transitoria de la arteria mesentérica superior (AME)11,12,13. La duración de la isquemia y la reperfusión es extremadamente variable, desde minutos hasta varias horas14,15. La razón de ser de la duración de la isquemia es inducir una agresión suficiente para desencadenar una respuesta significativa que conduzca a la aparición de lesiones remotas. Una duración demasiado corta de la isquemia puede no causar una alteración significativa en la vía metabólica estudiada. En cuanto a la duración de la reperfusión, la razón radica en la aparición temprana de lesiones remotas y la naturaleza potencialmente transitoria de los cambios fisiopatológicos. Una duración ideal de la reperfusión no debe ser demasiado temprana ni demasiado tardía para caracterizar adecuadamente el deterioro metabólico.

Los modelos son principalmente en roedores. Las ventajas de los roedores incluyen su pequeño tamaño, facilidad de mantenimiento, ciclo de vida corto y abundantes recursos genéticos16. El uso de animales grandes como cerdos, perros o primates no parece justificado en ausencia de beneficios adicionales, lo que se alinea con las reglas éticas de la experimentación animal con respecto al refinamiento. Además, debido a su similitud anatómica, fisiológica y genética con los humanos, los roedores permiten estudios traslacionales16.

Una de las principales limitaciones de los modelos de pinzamiento de AME es que, en la práctica clínica, el inicio del período de isquemia intestinal no es identificable. Esto hace que la extrapolación a situaciones clínicas humanas sea más incierta. Por el contrario, durante la cirugía aórtica compleja, se identifican claramente los períodos de isquemia y reperfusión de diferentes órganos. Además, durante el pinzamiento aórtico supracelíaco, todas las vísceras subyacentes se encuentran en un período isquémico (tracto digestivo, hígado, bazo, riñones, órganos pélvicos y miembros inferiores). Todos estos órganos sufren el fenómeno de isquemia-reperfusión. Por el contrario, los modelos de isquemia-reperfusión centrados en un órgano específico (intestino, riñón, hígado, etc.), los modelos de pinzamiento aórtico y, por tanto, de isquemia-reperfusión de múltiples órganos con fisiopatología metabólica son menos estudiados. Del mismo modo, las lesiones remotas, como las lesiones pulmonares después del pinzamiento aórtico, están poco estudiadas en términos de metabolismo17,18.

Los modelos de pinzamiento aórtico existentes se centran principalmente en sujetar la aorta abdominal debajo de las arterias renales. La limitación de este modelo es que no induce isquemia-reperfusión visceral. Por lo tanto, no permite demostrar un vínculo entre la isquemia-reperfusión visceral y las posibles lesiones remotas18,19. Además, no existe un modelo in vitro que permita el estudio de la isquemia-reperfusión mediante pinzamiento aórtico, por lo que sigue siendo necesario el análisis mediante modelos in vivo.

Por lo tanto, este modelo experimental de pinzamiento aórtico supracelíaco en ratas facilita una investigación exhaustiva de los mecanismos fisiopatológicos y las intervenciones farmacológicas dirigidas a lesiones pulmonares remotas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

La creación de este modelo cumple con las directrices para el cuidado y la experimentación animal, así como con la legislación francesa y europea. Este modelo ha sido validado en un estudio experimental con animales que fue aprobado por el Comité Regional de Ética de la Universidad en Normandía, Rouen, Francia (n°APAFIS: #18974).

1. Modelo animal y aclimatación

  1. Periodo de adaptación del modelo animal
    NOTA: El modelo se adhiere a los principios de refinamiento.
    1. Aloje a los animales en instalaciones no superpobladas durante una semana para permitir la adaptación antes de la cirugía.
    2. Aloje a las ratas dos por jaula con acceso ad libitum a agua y comida, que será revisado diariamente por personal experimentado.
    3. Verifique la limpieza de la ropa de cama (tiras de papel) diariamente y cámbiela sistemáticamente por personal experimentado dos veces por semana o más si es necesario.
    4. Después de un período de aclimatación de una semana, durante el cual tendrán contacto diario con el experimentador y exposición a ciclos de iluminación de 12 h, los procedimientos se llevarán a cabo en una habitación separada y tranquila con el mismo experimentador.
  2. Especies modelo animales
    1. Utilizar ratas macho Wistar o Sprague Dawley para evitar influencias hormonales, como el estradiol, en el análisis de la fisiopatología de isquemia-reperfusión visceral de un centro de cría acreditado y certificado11,20.
    2. Determine los grupos experimentales y el número de animales por grupo con anticipación.
    3. Elija la edad, se recomienda el uso de ratas de 6 a 10 semanas (350 g).

2. Anestesia y analgesia

  1. Analgesia
    1. Pese a cada animal el día del procedimiento.
    2. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea a nivel de la piel de la espalda de la rata 1 h antes del procedimiento con fines analgésicos con aguja de 25 G y jeringa de 2 ml.
    3. Aplicar gel de clorhidrato de lidocaína al 1% sobre la piel del abdomen a nivel de la futura incisión cutánea. Reevalúe el dolor regularmente (al menos dos veces al día) después de la operación utilizando una escala para evaluar las expresiones faciales de dolor en la rata21.
    4. Administrar durante las primeras 24 h, inyecciones subcutáneas sistemáticas de buprenorfina (0,01 a 0,05 mg/kg) cada 8 h.
    5. Posteriormente, administrar inyecciones de buprenorfina (0,01 a 0,05 mg/kg) según la escala de dolor facial del Centro Nacional para el Reemplazo, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación, y repetir cada 8 h si es necesario21.
  2. Anestesia general
    1. Usar gases halogenados (isoflurano) para anestesia general22.
    2. Utilice una cámara ventilada con isoflurano (5 %) a un caudal de aire de 2 L/min durante 2 min para la fase de inducción.
    3. Para el mantenimiento de la anestesia, cambie la rata a una máscara personalizada para ventilación espontánea con isoflurano (2-2,5%) a una tasa de flujo de aire de 2 L / min durante toda la cirugía.
    4. Despeje las vías respiratorias superiores moviendo la lengua fuera de la cavidad bucal para permitir la ventilación a través de la máscara.
    5. Controle continuamente la profundidad de la anestesia durante el procedimiento y ajuste la concentración de isoflurano según sea necesario.

3. Colocación de ratas durante el procedimiento

  1. Coloque a la rata en decúbito dorsal con las extremidades delanteras y traseras inmovilizadas con cinta adhesiva, respetando los rangos de movimiento fisiológicos de las articulaciones de la rata.
  2. Coloque la rata en una almohadilla térmica a 37 ° C con control de la temperatura rectal.
  3. Proteja los ojos aplicando dacryogel. Afeite el pelaje abdominal y desinfecte bien el abdomen con una solución de povidona yodada.

4. Procedimiento quirúrgico

  1. Condición del procedimiento quirúrgico
    1. Realizar el procedimiento bajo una lupa microquirúrgica para facilitar maniobras delicadas, aunque no es indispensable.
  2. Incisión
    1. Después de la palpación del proceso xifoides en el borde superior de la incisión, haga una incisión en la piel en el centro del abdomen, revelando la línea alba de los músculos abdominales.
    2. Incisión central del músculo abdominal en la línea alba para evitar el sangrado de los músculos abdominales.
  3. Exposición intraabdominal
    1. Mantenga la pared abdominal en ambos lados con retractores de autoretención.
    2. Asegurar la ausencia de anomalías (tumores), movilizar las vísceras, el estómago, el bazo y el hígado hacia el lado derecho del abdomen y luego exponer la aorta supracelíaca.
    3. Mantenga todas las vísceras dentro del abdomen tanto como sea posible mediante una pequeña compresa doblada a lo largo y empapada en solución salina tibia (37 ° C).
    4. Cubra todas las vísceras con una compresa empapada en solución salina calentada a 37 °C, para evitar la hipotermia y la deshidratación.
  4. Identificación de los principales vasos intraabdominales
    1. Identificar la aorta supracelíaca por sus pulsaciones y su ubicación entre los pilares diafragmáticos.
    2. Control de la aorta entre los pilares diafragmáticos con una disección suave y cuidadosa utilizando aplicadores con punta de algodón y pinzas de disección para liberar la aorta de la manera más atraumática posible.
    3. Rodear la aorta supracelíaca con una sutura monofilamento 5-0 con pinzas de disección y ligadura.
    4. Verificar el origen del tronco celíaco y la arteria mesentérica subyacente. La duración de este procedimiento quirúrgico es de 10 a 15 minutos por rata.
    5. La identificación subyacente de la vena cava inferior subrenal es fácil debido a la transparencia del retroperitoneo.
    6. Liberar la vena cava inferior subrenal solo en su superficie anterior, lo que permite la administración intravenosa directa de cualquier agente farmacológico.
  5. Inyección intravenosa
    1. Para ello, utilice una aguja de 30 G para la inyección y coloque unos milímetros de compresa hemostática para lograr la hemostasia.
    2. Si realiza un preacondicionamiento farmacológico, administre la inyección antes del pinzamiento aórtico. Para el tratamiento posterior al acondicionamiento, adminístrelo durante o después del pinzamiento aórtico.
    3. Este protocolo estudió el preacondicionamiento farmacológico, por lo que se administraron 5 min antes del pinzamiento aórtico.
  6. Período isquémico
    1. Pinzar la aorta celíaca con un pinzamiento microvascular atraumático durante todo el período isquémico de 40 minutos. Verifique la efectividad de la pinza mediante la desaparición de las pulsaciones aórticas subyacentes y la decoloración de las vísceras y las extremidades varias veces durante el pinzamiento.
    2. Cierre parcialmente el abdomen con tres suturas absorbibles trenzadas 5-0 simples para limitar la pérdida de agua y calor. Cubra la incisión quirúrgica con una compresa estéril empapada en solución salina tibia durante toda la duración de la isquemia.
  7. Período de reperfusión
    1. Al final del período isquémico, vuelva a abrir el abdomen y exponga la aorta de la misma manera que se describió anteriormente.
    2. Retire la pinza vascular y verifique la reanudación de la pulsatilidad aórtica subyacente y la recoloración de las vísceras y las extremidades. El período de reperfusión comienza inmediatamente después de retirar la micropinza.
  8. Cierre del abdomen
    1. Vuelva a colocar las vísceras en su posición original y cierre el abdomen con una sutura absorbible trenzada 5-0 en la línea alba y la piel con una sutura absorbible monofilamento 5-0.
  9. Despertar animal
    1. Coloque a la rata en una posición de decúbito lateral izquierdo para evitar comprimir la vena cava inferior por la masa visceral y el contexto de hipovolemia. Coloque a la rata en una jaula individual con una lámpara de calor para mantener la temperatura hasta que se despierte, aproximadamente 10 minutos después.
  10. Segunda anestesia general
    1. Al final del período de reperfusión de 180 min, anestesiar a la rata con el mismo gas de anestesia a través de una cámara ventilada con isoflurano (5%) a una velocidad de flujo de aire de 2 L / min durante 2 min para la fase de inducción.
    2. Para el mantenimiento de la anestesia, cambie la rata a una máscara ajustada a medida para ventilación espontánea con isoflurano (2-2,5%) a una tasa de flujo de aire de 2 L / min durante todo el período de recolección de tejido.

5. Muestreo

  1. Muestras de sangre
    1. Recolectar muestras de sangre con una aguja de 23-G y una jeringa de 5 ml mediante punción directa en la vena cava inferior debajo de las venas renales.
    2. Logre la hemostasia después de la punción aplicando un pequeño trozo de compresa hemostática.
    3. Use una pequeña porción (100 μL) de la sangre total para gases y análisis de sangre estándar en una sola tarjeta de prueba a temperatura ambiente.
    4. Recoger la sangre entera restante en un tubo de EDTA de 4 ml y centrifugarla a 1.000 × g durante 10 min a +4 °C.
    5. Congelar el plasma en criotubos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta el análisis.
  2. Muestras de tejido
    1. Muestreo de tejidos
      1. Recolectar muestras de tejido (pulmón, intestino, riñón, hígado y corazón) durante la eutanasia del animal. Realizar la eutanasia mediante toma de muestras de sangre que conduzca a la desangración después de la anestesia general con isoflurano de acuerdo con el mismo protocolo mencionado anteriormente.
      2. A través del abdomen abierto, recolecte 50 mg de cada tejido: el polo superior del riñón izquierdo, el lóbulo hepático izquierdo y el intestino delgado distal 1 cm antes del ciego.
      3. Luego, realice una esternotomía mediana rápidamente para identificar el corazón y los pulmones.
      4. Liberar el pulmón izquierdo de su ligamento y extirparlo por completo para su análisis histológico. Libere el pulmón multilobulado derecho de sus ligamentos. Separar el lóbulo anterior para análisis de ácidos nucleicos y proteínas, almacenar el resto en una taza con suero fisiológico a 37 °C durante unos minutos para posteriormente realizar la gravimetría.
      5. Extraiga el corazón como un bloque completo con secciones de la aorta, la arteria pulmonar y ambas venas cavas. Tome una muestra de un trozo del ventrículo izquierdo para análisis de ácidos nucleicos y proteínas, almacene el resto en una taza con suero fisiológico a 37 °C durante unos minutos para posteriormente realizar la gravimetría.
    2. Análisis de ácidos nucleicos
      1. Para el análisis de ácidos nucleicos, recolecte inmediatamente una porción de tejido de 50 g. Congélelo en nitrógeno líquido y luego guárdelo a -80 °C hasta su análisis.
      2. Extraiga el ARN total con un reactivo listo para usar para el aislamiento de ARN total de alta calidad según el protocolo del fabricante.
      3. Determine la concentración y pureza del ARN con un espectrofotómetro. Mida la concentración de ARN utilizando 2 μL de muestra, con 2 μL de agua libre de ARNasa como referencia en blanco. Utilice la absorbancia a 260 nm para determinar la concentración de ARN.
        NOTA: La pureza aceptable del ARN se definió como una relación de absorbancia de 260/280 y 260/230 que oscila entre 1,7 y 2,0.
      4. Utilice 1 μg de cada muestra de ARN para la transcripción inversa.
      5. Mida los niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) y una referencia interna (beta2-microglobulina), mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) en un ciclador de bloque térmico rápido basado en placas con capacidades integradas de detección en línea en tiempo real utilizando una mezcla de reacción de inicio en caliente lista para usar (los cebadores se enumeran en la Tabla 1).
      6. Calcule el nivel relativo de ARNm utilizando el método 2-ΔΔCT.
    3. Análisis de proteínas
      1. Para el análisis de proteínas, coloque 50 mg de tejido en un tubo de lisis de 2 ml que contenga cincuenta perlas cerámicas de óxido de circonio de 2,8 mm. Este tubo de lisis contiene 1 ml de tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) con una tableta inhibidora de proteasa y una tableta inhibidora de fosfatasa.
      2. Extraiga la proteína de las muestras por homogeneización en el molino de tubos de laboratorio con 3 repeticiones de verificación de 5 s, seguido de un período de reposo de 10 s.
      3. Centrifugar las muestras a 10.000 g a +4 °C durante 10 min y almacenar los sobrenadantes en criotubos a -20 °C hasta su análisis.
      4. Determine las concentraciones de proteínas con un ensayo de proteínas basado en Bradford y mantenga las muestras a -80 °C.
      5. Separe una cantidad igual de proteínas de cada muestra usando SDS-PAGE.
      6. Transfiera proteínas separadas en membranas de nitrocelulosa de 0,2 μm.
      7. Incubar la membrana después del bloqueo con leche descremada descremada TBS-Tween al 5% durante 1 h, con un anticuerpo primario contra la proteína específica de elección. Por ejemplo, para explorar la heparanasa, use un anticuerpo primario policlonal de conejo contra la heparanasa humana (dilución 1:2000) y una proteína de control como GAPDH, use un anticuerpo primario monoclonal de cabra contra GAPDH (dilución 1:5000) durante la noche a 4 °C.
      8. Lave las manchas tres veces con tampón TBST-Tween al 0,1%.
      9. Incubar con un anticuerpo secundario conjugado con HRP dirigido contra el anticuerpo primario a temperatura ambiente (RT) durante 1 h en solución de bloqueo. Por ejemplo, para explorar la heparanasa, use el anticuerpo secundario de cabra contra conejo (dilución 1: 5000) y para explorar GAPDH, use el anticuerpo secundario de conejo contra cabra (dilución 1: 10000).
      10. Detecte los complejos inmunes utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL).
      11. Analizar las membranas utilizando un software dedicado para determinar los valores densitométricos de las bandas objetivo, utilizando GAPDH como control interno. Realice un análisis densitométrico de la banda correspondiente a la heparanasa (50 kDa) y normalícela a la banda de proteína GAPDH (35 kDa) para determinar la intensidad relativa de la señal.
    4. Análisis histológico
      1. Para el análisis histológico, tome el pulmón unilobular izquierdo en el hilio, luego infunda a través del bronquio principal izquierdo con una solución de criopreservación usando un catéter de 16 G. Congélelo en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.
    5. Análisis de gravimetría
      1. Después de las muestras para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas, analizar la porción restante del corazón y el pulmón multilobulillar derecho mediante gravimetría, con desecación en hornos a 70 ° C, lo que permite que la relación peso húmedo / seco proporcione una estimación del edema tisular.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Se encontró que este protocolo era seguro, con pérdidas mínimas de animales (menos del 5%) durante la anestesia y la cirugía, y efectivo para la inducción de lesión pulmonar aguda. La anestesia con isoflurano fue más segura que la ketamina combinada con anestesia con xilacina (pérdida de aproximadamente el 15%), con un despertar rápido y una mejor recuperación en ratas (datos no mostrados). Todos los animales anestesiados pudieron someterse a un pinzamiento aórtico seguro y eficaz con este método. Todos los animales (100...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este modelo quirúrgico de pinzamiento cruzado aórtico ofrece la ventaja de permitir un análisis completo, tanto tisular como plasmático, de la lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral. También brinda la oportunidad de probar moléculas farmacológicas con administración intraperitoneal, enteral o intravenosa en pre o post-acondicionamiento.

Uno de los pasos críticos sigue siendo el pinzamiento de la aorta supracelíaca durante la cirugía....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.2 µ m membranas de nitrocelulosa Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500.2 µ M membranas de nitrocelulosa precortadas
Jeringa Luer Slip de 1cc sin agujaTerumoMDSS01SEJeringa Luer Slip de 1cc sin aguja
Jeringa Luer Slip de 2cc sin agujaBecton DinckinsonJeringa Luer Slip de 2cc sin aguja
Tubo de EDTA de 4 ml BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD368860Tubo de EDTA de 5 ml BD K3 13 mm x 75 mm
5-0 sutura trenzada / Vicryl 5-0 (Ethicon) o Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson and JohnsonV7970EVicryl 5-0 Aguja Punto cónico 1/2 círculo 13 mm Longitud 45 cm
5-0 sutura absorbible monofilamento / Poliglecaprona monocriloEthicon - Johnson and JohnsonY493GAguja 3/8 círculo Longitud 18in
Jeringa Luer Slip de 5cc sin agujaTerumoSS-05LE1Jeringa Luer Slip de 5cc sin aguja
Pinza microvascular atraumática / Pinzas de vasos desechables para venasAROSquirúrgicoTKF-1-20gPinza microvascular atraumática para uso en venas con el fin de pinzar la aorta de rata
BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 mm
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 mm
BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 mm
beta-actina InvitrogenCarlsbad, Estados Unidos15G5A11/E2
Ensayo de proteínas con método basado en BradfordBiorad, Marnes-la-Coquette, Francia5000201
BuprenorfinaBuprenorfina
Centrifugadora Sigma 3-30Sigma, Alemania10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Centrifugadora para eppendorf
Mini completoRoche11836153001Cóctel de inhibidores de proteasa 25 comprimidos
Cotonete
Dacryogel /  Gel ocular Lubrithal 10 gProductos veterinarios DechraCódigo  ACL7376464Gel ocular Lubrithal 10 g
Bisturí desechablePrimordialPDSS11Hoja de bisturí desechable n° 11
ElectrocauterizaciónDentRMedEMB/87400Pluma hemostática con alta temperatura
Sistema de detección ECL mejoradoBiorad, Hércules, California, Estados Unidos1705060S
Molino de abalorios Fisherbrand 24Fisher científico15515799Utilizado para  molienda, lisis y homogeneización de muestras biológicas antes de la extracción molecular
Hisopos de gasaRaffin.010106Hisopos de gasa
Software ImageLabTMBioraden una unidad USB o licencia
Isoflurano 5%Isoflurano 5%
Lidocaína Prilocaína gel 5% Aguettant, Lyon, FranciaLidocaína Prilocaína gel 5% 
Instrumento LightCycler 480Roche, Bâ le, Suiza5015243001termociclador
Lubricante Jelly Estéril K-Y 82 gRECKITT BENCKISERLubricante Jelly Estéril K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.ND-2000espectrofotómetro
Peha Pince anatómicoHartmann991063Alicates anatómicos
PhosSTOPRoche4906837001inhibidor de la fosfatasa 20 comprimidos
Yeso/Cinta adhesivaAnapore135320Cinta adhesiva quirúrgica / yeso
Solución de povione-yodo / Vé té Solución para cenarVé toquinolSolución antiséptica para uso externo
Kit de lisado Precellys tube Homogeneización de tejidos duros CK28, BertinCK28Kit de lisado Precellys tube 
Prolè ne Sutura de prolipropilenoEthicon - Johnson and Johnson7472HProlè ne 5-0 Aguja Corte cónica 3/8 círculo 13 mm Longitud 75 cm
Tubos Safe-Lock 1,5 mlEppendorf.0030120086Tubos Safe-Lock 1.5cc sin color 1000 tubos para centrifugación
Tubos Safe-Lock 2 mLEppendorf.0030120094Tubos Safe-Lock 2.0cc sin color 1000 tubos para centrifugación
Tubos Safe-Lock 5 mLEppendorf.0030119401Tubos Safe-Lock 5.0cc sin color 200 tubos para centrifugación
Solución salina NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, Francia600502Solución salina al 0,9% 500 mL
SDS-PÁGINASigma-Alrich
Catéter intravenoso Surflash 16 GTerumoSR*FF1651
CirugíaEthicon - Johnson and JohnsonHisopos hemostáticos reabsorbibles
Juego de suturas n° 12Hartmann4701762Juego de suturas estériles con adhesine champ, tijeras, alicates Adson, portaagujas
SYBR Verde KIT Light Cycler 480 SYBR Verde I MasternRoche4707516001SYBR Verde
TBST-Tween 0.1% tampónSigma-Alrich
Tarjetas de prueba Epoc 24 tarjetas 13 parámetrosSiemens-Healthineers
Tejido TEKSakura FinetecSolución de criopreservación 
Reactivo TRIzol InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, EE. UU.15596026Reactivo TRIzol

Referencias

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Modelo quirúrgico en ratasaorta supracelíacainflamación pulmonaranálisis de gases en sangrehistología pulmonaredema pulmonarinfiltración de neutrófilos
Un modelo de lesión pulmonar aguda después de la isquemia-reperfusión visceral por pinzamiento cruzado de la aorta supracelíaca en ratas
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.