Artículo de método

Uso de un modelo aislado de corazón de rata funcional para probar estrategias de preservación del corazón de un donante

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DOI:

10.3791/66910

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4 de octubre de 2024

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo de corazón de rata aislado ex vivo para probar estrategias de preservación del corazón de donantes. En este trabajo se describe el protocolo para su uso en el almacenamiento estático en frío de corazones de donantes de roedores; Sin embargo, el protocolo también se puede utilizar para corazones de donantes obtenidos después de la donación después de la muerte circulatoria y la muerte encefálica.

Resumen

La optimización de las soluciones de preservación del corazón de los donantes ha desempeñado un papel clave en la reducción de las lesiones por isquemia-reperfusión en los corazones de los donantes durante la extracción, el transporte y el trasplante de órganos. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que la adición de trinitrato de glicerilo y eritropoyetina a las soluciones de preservación cardíaca de donantes podría mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío y en la donación después de la muerte circulatoria de los corazones. Este protocolo de suplementación se ha implementado en uso clínico en unidades de trasplante de Australia, Bélgica y el Reino Unido. Aquí, describimos un protocolo para probar estrategias de suplementación utilizando un circuito de perfusión de corazón de rata de trabajo aislado ex vivo (IWRH). Con esta metodología, las estrategias de suplementación se pueden probar en el contexto del almacenamiento estático prolongado en frío, la donación después de la muerte encefálica y la donación después de la muerte circulatoria de la preservación del corazón del donante. La recuperación funcional cardíaca, medida por el flujo aórtico, el flujo coronario, el gasto cardíaco, la presión del pulso y la frecuencia cardíaca, se puede utilizar para determinar si una estrategia de preservación particular puede minimizar la lesión por isquemia-reperfusión del corazón del donante.

Introducción

El éxito de un trasplante de corazón puede verse influenciado en gran medida por el método de preservación utilizado para el corazón del donante. Los corazones de los donantes son sometidos a lesiones isquémicas durante todo el proceso de extracción, transporte y trasplante de órganos. El grado de daño isquémico en el órgano del donante puede mitigarse mediante la selección de una estrategia adecuada de preservación del corazón del donante. El almacenamiento estático en frío (CSS) sigue siendo el método más factible y común para la preservación del corazón del donante; sin embargo, es posible que CSS no sea necesariamente la mejor opción para todas las vías de donación de corazón. Por ejemplo, los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte circulatoria (DCD) se mantienen y se evalúa su viabilidad utilizando la perfusión normotérmica en máquina, mientras que los corazones obtenidos a través de la vía de donación después de la muerte encefálica (DBD) se pueden preservar utilizando CSS o perfusión con máquina hipotérmica. Otro factor determinante importante para la estrategia de preservación utilizada es la cantidad de isquemia caliente (para la DCD) o isquemia fría (para la DBD) a la que se somete el corazón durante la obtención y el transporte del órgano.

Muchos centros utilizan suplementos farmacológicos adicionales de la solución de preservación cardíaca para aumentar la tolerancia isquémica y mejorar la función cardíaca después del trasplante. Los estudios en roedores de nuestro laboratorio demostraron que la suplementación de la cardioplejia con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo fue capaz de mejorar significativamente la recuperación funcional cardíaca después de un almacenamiento prolongado en frío del corazón del donante 1,2. Estos estudios luego progresaron a estudios porcinos de preservación del corazón de donantes y proporcionaron la base preclínica que condujo a la incorporación de eritropoyetina y trinitrato de glicerilo en la solución de cardioplejia de corazones obtenidos a través de una vía DCD utilizando perfusión con máquina normotérmica 3,4,5. En la actualidad, la suplementación con eritropoyetina y trinitrato de glicerilo también se utiliza en las unidades de trasplante australianas para las recuperaciones cardíacas clínicas de DBD que incorporan CSS. El objetivo general del protocolo de perfusión de corazón de rata trabajador aislado (IWRH, por sus siglas en inglés) que se describe a continuación es probar las estrategias de preservación del corazón del donante en un entorno de laboratorio y probar su eficacia para preservar la función cardíaca del donante después de la reperfusión. El protocolo de corazón de rata de trabajo aislado descrito se ha utilizado durante más de dos décadas en nuestro laboratorio y ha demostrado ser extremadamente útil en la detección de posibles suplementos y/o estrategias que pueden mejorar la preservación del corazón del donante 2,7,8,9.

Protocolo

Todos los animales recibieron atención humanitaria de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Australia). Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan de Investigación Médica (Sydney, Australia).

1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit (KH)

  1. Prepare 2 L de una solución madre 20x de tampón KH que contenga 2,36 M de NaCl, 0,094 M de KCl, 0,024 M de MgSO4, 0,024 M de KH2PO4. Aliquotar en tubos de 50 mL y almacenar a -20 °C.
  2. Antes del experimento, prepare dos matraces Erlenmyer de 2 L de 1x tampón KH que contenga 1900 mL de agua desionizada, 100 mL de 20x tampón KH de stock, 4,20 g de NaHCO3 (25 mM) y 3,96 g de glucosa (11 mM).
    1. Coloque los matraces tampón en un baño de agua a 37 °C y gasifique la solución con carbógeno (95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono, caudal ajustado a 2 L/min) a través de piedras difusoras (filtro de entrada deslizante) durante 5 min, luego agregue 2,8 mL de 1 M CaCl2 (1,4 mM). Continúe burbujeando la solución durante al menos 1 hora antes del inicio del experimento. El uso de una piedra difusora ayuda a una aireación uniforme del tampón.
    2. Coloque un pequeño volumen (~50 mL) de tampón en un plato redondo de metal a -20 °C para enfriar y formar una capa de tampón helado.

2. Preparación del circuito de perfusión

  1. Asegúrese de que todos los tubos y cristalería estén limpios y sin crecimiento o contaminación visibles.
  2. Ajuste las alturas de las cámaras de vidrio para que correspondan a las presiones de perfusión requeridas basadas en 1 cm H2O que sean equivalentes a 1,36 mmHg: Langendorff al corazón 100 cm (aproximadamente 75 mmHg), trabajo de precarga de lado al corazón 15 cm (aproximadamente 11 mmHg), cámara del corazón a la poscarga 100 cm (aproximadamente 75 mmHg).
  3. Inicie la circulación de agua caliente alrededor del circuito al menos 10 minutos antes de la perfusión cardíaca.
  4. Coloque los filtros de microfibra (1,2 μm) en los portafiltros y asegúrelos firmemente.
  5. Prepare el circuito con tampón KH, asegurándose de que se elimine todo el aire, y use una abrazadera de tubería de control de flujo para ajustar el flujo en el lado de Langendorff (Figura 1A, B) a ~ 50 mL / min. El flujo más lento facilita la canulación aórtica y evita que el corazón se desplace antes de la ligadura. Coloque un termómetro dentro del circuito a través de un conector de tubo en forma de T para controlar la temperatura del tampón a ~37 °C.

3. Configuración del software Lab Chart (análisis de datos)

  1. Asegúrese de que Powerlab (sistema de adquisición de datos) y el caudalímetro estén encendidos y conectados a la computadora antes de abrir el software de análisis de datos.
  2. Abra un nuevo archivo.
  3. Configure la recopilación de datos seleccionando el menú desplegable Configuración y seleccionando Configuración del canal. Seleccione para presión aórtica, flujo aórtico y frecuencia cardíaca (Figura 2A).
  4. Configure cada canal con la configuración que se muestra en la Figura 2B.

4. Preparación del animal para el aislamiento del corazón de rata

NOTA: A continuación se describe la metodología para el aislamiento y la perfusión del corazón de rata para el almacenamiento estático en frío y sin DBD. Los métodos para la instrumentación del corazón en el circuito de perfusión son relativamente similares, independientemente del método de donación que se utilice. Las diferencias en el protocolo para la donación de corazón de rata DBD y DCD ocurren principalmente desde el momento en que la anestesia animal ha hecho efecto hasta el momento en que se extirpa el corazón del animal.

  1. Pesar al animal, asegurándose de que su peso sea de >330 g. El rango de peso ideal para ratas macho es de 330-420 g.
  2. Administrar una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Asegurar un plano quirúrgico adecuado de anestesia basado en la ausencia de un reflejo de pedal (reflejo de pellizco de los pies) y reflejo de parpadeo.
  3. Coloque al animal en posición supina, asegurando las extremidades con cinta adhesiva. Administre oxígeno al animal a través de un cono nasal.
  4. Tenga el contenedor metálico de aguanieve tampón KH y un pequeño recipiente metálico con hielo en la estación de disección. Remoja una gasa de 7,5 cm x 7,5 cm en un tampón KH y colócala en el recipiente con hielo.
  5. Una vez que se confirma el plano quirúrgico adecuado de anestesia, raspe la piel en el sitio de la incisión quirúrgica y limpie la piel con aséptico como betadine o alcohol al 70%. Haga una incisión lateral a través del abdomen (laparotomía) y mueva el estómago y los intestinos hacia un lado para permitir el acceso a la vena renal izquierda. Inyecte 1500 UI de heparina y aplique presión en el lugar de la inyección hasta que se detenga el sangrado. Espere de 1 a 2 minutos para que la heparina circule antes de continuar con la extracción del corazón.
  6. Abra la cavidad torácica cortando a través de la caja torácica a cada lado y cortando a través del diafragma. Sostenga y levante con cuidado el bloque corazón-pulmón mientras corta a lo largo de la aorta descendente, asegurándose de que el arco aórtico permanezca intacto. Esto permitirá que quede suficiente longitud de aorta para la canulación.
  7. La rata es sacrificada mediante la extirpación del corazón y los pulmones mientras está bajo anestesia. Sumerja el bloque corazón-pulmón en el aguanieve de hielo amortiguador KH para permitir que el corazón se detenga.

5. Canulación del corazón en el circuito de perfusión cardíaca de funcionamiento aislado

  1. Transfiera el bloque corazón-pulmón a una gasa con hielo. Diseccione el exceso de grasa alrededor de la aorta, recorte la aorta para dejar una longitud de 3-5 mm para la canulación y haga una pequeña incisión de ~ 1-2 mm en la arteria pulmonar. Esto permitirá un camino para el efluente coronario.
  2. Coloque el bloque corazón-pulmón recortado (mientras aún está en hielo) directamente debajo de las cánulas. Ajuste el flujo desde el lado de Langendorff utilizando una pinza de tubo de control de flujo para facilitar la canulación aórtica. Cánula cuidadosamente la aorta en la cánula izquierda, sujétala con una pinza negra y átala con una sutura de seda 2-0.
  3. Aumente el caudal de la perfusión de Langendorff abriendo completamente la abrazadera del tubo de control de flujo. Abra la abrazadera de poscarga. Asegúrese de que haya un flujo continuo desde la cámara de Langendorff. Comience a monitorear la actividad cardíaca con software.
    NOTA: si el valor del flujo aórtico en la pantalla del caudalímetro es de <10 mL/min, asegúrese de que la arteriotomía pulmonar tenga un tamaño suficiente. Un traza/valor de flujo aórtico bajo también podría indicar que la cánula aórtica se ha insertado demasiado.
  4. Ajuste el bloque corazón-pulmón de modo que la superficie anterior de los pulmones quede orientada hacia el operador. Ate el lóbulo pulmonar izquierdo con una sutura de seda 2-0 y corte el exceso de tejido pulmonar izquierdo. Ate los lóbulos pulmonares restantes en un solo barrido con una sutura de seda 2-0 y corte el tejido. Gire el corazón de modo que los pulmones atados estén hacia atrás.
  5. Con unas tijeras Vannas pequeñas, corte un borde de 2-3 mm del apéndice auricular izquierdo, asegurándose de que se logre una pequeña abertura en las aurículas. Cánula cuidadosamente el apéndice auricular izquierdo a la cánula izquierda, sujételo con una pinza negra y átelo con una sutura de seda 2-0. La figura 3A muestra la ubicación de ambas cánulas.
  6. Ajuste la camisa de agua de la cámara cardíaca de modo que el corazón quede dentro del centro de la cámara.
  7. Abra el transductor de presión al aire y ponga a cero el transductor de presión en el software seleccionando el menú desplegable Presión aórtica > Bridge Amp > Zero. Haga clic en Aceptar.
  8. Perfunde el corazón en modo Langendorff durante 10 min. Asegúrese de que el flujo aórtico de Langendoff mida entre 10 y 20 mL/min (lo ideal es 20 mL/min).
  9. Antes de cambiar el modo de trabajo, asegúrese de que la piedra difusora (filtro de entrada deslizante) del depósito tampón KH de Langendorff esté colocada en el depósito tampón KH en funcionamiento.
  10. Ponga el corazón en modo de funcionamiento cerrando la pinza grande que conduce a la cánula aórtica y abriendo el flujo que conduce al apéndice auricular izquierdo. Grifo abierto de tres vías que conduce desde la perfusión de trabajo. Transfiera el tubo de retorno común (llevando el tampón KH de vuelta al depósito) desde el depósito de Langendorff hasta el depósito de trabajo.
  11. Perfunde el corazón en modo de trabajo durante 15 min. Lo ideal es que los valores de flujo aórtico sean de >30 mL/min al final de la perfusión de 15 min. Una vez que el corazón se haya estabilizado, comience a registrar datos en un software de análisis de datos.
  12. Mida el efluente coronario (flujo coronario) a 1 min, 5 min, 10 min y 15 min.
    NOTA: Los valores de flujo coronario deben estar entre 10-20 mL/min. El flujo coronario superior a 22 mL/min generalmente indica una fuga que se origina en un vaso pulmonar desligado. La frecuencia cardíaca debe estar entre 200 y 300 lpm. El efluente coronario se puede recolectar para el análisis posterior de marcadores de lesión tisular (p. ej., troponina-I, liberación de lactato deshidrogenasa).

6. Administración de cardioplejia para el almacenamiento estático en frío del corazón

  1. Llene la cámara de cardioplejia (colocada a una altura de 60 cm para producir una presión de perfusión de aproximadamente 40 mmHg) con 50 mL de solución de preservación cardíaca designada (con o sin suplementación).
  2. Baje la camisa de agua y cierre el grifo de tres vías en el lado del modo de trabajo.
  3. Detenga el flujo hacia la cánula auricular izquierda cerrando la pinza.
  4. Abrir el flujo a la cánula aórtica.
  5. Cierre la abrazadera desde el lado de Langendoff y en la carga posterior.
  6. Abra la pinza desde la línea de cardioplejia y enjuague 15 ml de cardioplejia de la línea de presión. Cierre el grifo en la línea de presión.
  7. Permitir que el corazón se lave con cardioplejia a través de la cánula aórtica y recoger el efluente coronario. Ejecute cardioplejia durante 3 minutos y registre el volumen de cardioplejia administrada.
  8. Detenga la grabación de datos en el software y guarde el archivo.
  9. Después de 3 minutos, cierre la pinza para cardioplejia y la pequeña pinza azul que conduce a la cánula aórtica.
  10. Coloque una pinza de bulldog en la cánula aórtica y una segunda pinza de bulldog en la cánula izquierda. Desconecte el bloque de cánula cardíaca del circuito y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga cardioplejia en una caja de hielo (Figura 3B, C).
  11. Guarde el corazón en la nevera durante 6 h (o el tiempo de almacenamiento en frío deseado).

7. Reperfusión cardíaca después del almacenamiento estático en frío

  1. Prepare el tampón KH según la sección 1.
  2. Cebe el circuito de perfusión como se indica en la sección 2.
  3. Abra el archivo guardado desde la perfusión de línea base.
  4. Retire con cuidado el bloque de cánula cardíaca de la caja de hielo y asegúrelo al circuito de perfusión. Antes de volver a conectar la cánula aórtica, use una jeringa de 18 G de extremo romo llena de tampón KH para eliminar el aire de la cánula. Conecte primero la cánula aórtica, abra la pinza de tubo en el lado de Langendorff y asegúrese de que la pinza de tubo de poscarga esté abierta.
  5. Vuelva a conectar la cánula auricular izquierda, asegurándose de que se haya eliminado el aire de la cánula antes de conectarla al circuito de perfusión. Mantenga la abrazadera del lado de trabajo cerrada hasta que sea el momento de cambiar del modo de trabajo de Langendorff.
  6. Perfunde el corazón en modo Langendorff durante 15 min. Asegúrese de iniciar el registro de datos al inicio de la reperfusión de Langendorff.
  7. Antes de cambiar al modo de trabajo, coloque ambas piedras burbujeantes en el tampón KH, abra el grifo de 3 vías en el lado de trabajo y transfiera el tubo de retorno común al depósito de trabajo.
  8. Cierre la pinza Langendorff blanca, abra la pinza blanca del lado de trabajo y perfunda el corazón durante 30 min. Mida y recoja el efluente coronario en puntos de tiempo designados para el análisis posterior (p. ej., marcadores de lesiones cardíacas). Asegúrese de detener y reiniciar la grabación de software para iniciar un nuevo segmento (o, alternativamente, agregue un comentario).
  9. Aproximadamente a los 15 minutos del modo de trabajo de reperfusión, cierre el grifo de tres vías.
  10. Al final de la reperfusión, guarde el archivo de datos, detenga el flujo a través del circuito y desconecte el bloqueo cardíaco. Recolectar muestras del ventrículo izquierdo para el procesamiento histológico y/o congelarlas para estudios futuros (p. ej., extracción de proteínas para estudios de Western blot).
  11. Retire los filtros de los portafiltros, drene el tampón del circuito y enjuague dos veces con 5 L de agua destilada.
    NOTA: Aunque no es necesario, ayuda precalentar el agua destilada en un recipiente grande dentro del baño de agua.

8. Análisis de la recuperación funcional

  1. Abra el archivo LabChart.
  2. Resalte una región de al menos 30 s de grabación y, a continuación, haga clic en Comando > Agregar selección de datos O Agregar varias veces a los datos. Esto agregará los parámetros deseados a un archivo DataPad dentro del software.
  3. Seleccione el menú desplegable Ventana > DataPad.
  4. Resalte y copie los valores de recuperación del DataPad en una hoja de cálculo para el análisis de recuperación funcional. Calcule la recuperación funcional como un porcentaje de su respectivo valor de referencia 1,6,7.

Resultados

Los resultados de la perfusión basal determinarán si el experimento inicial (prealmacenamiento) fue exitoso. El flujo aórtico mostrado durante el modo de Langendorff debe estar entre 14 y 22 mL/min. El flujo de Langendorff se muestra como un valor negativo en el caudalímetro debido a la perfusión retrógrada de la aorta. En la Figura 4A se muestra un ejemplo de una traza de Langendorff aceptable.

Una vez que se cambia al modo de trabajo, el flujo aórtico debe ser de al menos 30 mL/min una vez que el corazón se asienta. Es normal que el flujo aumente inicialmente a aproximadamente 50 mL/min, luego disminuya a aproximadamente 25 mL/min antes de volver a aumentar a un flujo aórtico basal estable. Una vez que los parámetros basales son satisfactorios (FA > 30 mL/min, CF 10-20 mL/min, FC 200-300 lpm), se puede almacenar el corazón. En la Figura 4B se muestra un ejemplo de un buen trazado de referencia.

Dependiendo de la solución de conservación probada, algunos corazones no producirán una buena recuperación después de un almacenamiento estático prolongado en frío a pesar de tener una excelente línea de base. En la Figura 4C se muestra un ejemplo de un seguimiento que indica una recuperación deficiente en modo de trabajo.

La recuperación funcional final del flujo aórtico se puede calcular sobre la base de la lectura final del flujo aórtico como porcentaje del valor basal. Por ejemplo, si la fibrilación auricular basal cardíaca fue de 40 ml/min, y la fibrilación auricular al final de la reperfusión después del almacenamiento estático en frío fue de 20 ml/min, la recuperación de la fibrilación auricular para este corazón fue del 50 %. En la figura 5 se muestra un ejemplo de esta representación de datos.

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Figura 1: Circuito de perfusión cardíaca en funcionamiento. (A) Foto del circuito de perfusión cardíaca de rata aislado en funcionamiento. El recuadro rojo indica dónde se encuentra el corazón aislado. (B) Esquema del circuito de perfusión cardíaca de trabajo aislado que indica la dirección del flujo del tampón KH a través del circuito para la perfusión de Langendorff (línea punteada) y modo de trabajo (línea sólida). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración del software LabChart. (A) Configuración de los ajustes de los canales para la presión aórtica, el flujo aórtico y la frecuencia cardíaca. (B) Ejemplo de plantilla de LabChart configurada con tres canales. Las ventanas de la derecha muestran cada configuración de canal individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Canulación y cardioplejia. (A) Canulación del corazón antes de la colocación dentro de la cámara de la camisa de agua. La cánula izquierda se inserta en la aorta y la cánula derecha se inserta en el ventrículo izquierdo a través del apéndice auricular izquierdo. Se han ligado los vasos pulmonares y se ha diseccionado el tejido pulmonar. (B) Después de que se ha administrado la cardioplejia, el corazón se coloca en un vaso de precipitados que contiene la solución para la cardioplejia. Las cánulas se han sujetado con clips bulldog antes de desconectarse de la plataforma. (C) Ejemplo de corazones colocados dentro de una caja de hielo para almacenamiento prolongado en frío. Aquí, dos corazones han sido almacenados para la reperfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ejemplos de trazas de LabChart. Trazas de presión (gráfico rojo), flujo aórtico (gráfico azul) y frecuencia cardíaca (gráfico verde) para un corazón con (A) Buena traza de Langendorff, (B) Buena recuperación durante la reperfusión en modo de trabajo, (C) Mala recuperación durante la reperfusión en modo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Gráficos representativos de la recuperación funcional. (A) flujo aórtico, (B) flujo coronario, (C) gasto cardíaco y (D) frecuencia cardíaca. Esta figura ha sido reutilizada con permiso de Gao et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Dada la naturaleza sensible de la función basal del corazón, se debe tener cuidado de mantener el equipo de perfusión limpio y con componentes compatibles. Por ejemplo, se debe utilizar el tubo de PVC correcto. Algunos materiales de los tubos, como la silicona, pueden contribuir a reducir el flujo aórtico y la contractilidad, lo que puede deberse a la pérdida de oxígeno a través del tubo. Si bien existen circuitos aislados de perfusión cardíaca de rata disponibles comercialmente, la mayoría de estos se utilizan principalmente solo para la perfusión de Langendorff. Generalmente, las mediciones funcionales se pueden obtener en un modelo de perfusión de Langendoff a través de la inserción de un catéter con balón en el ventrículo izquierdo para obtener mediciones de la presión diastólica del ventrículo izquierdo (LVDP). Sin embargo, no es posible medir las mediciones del flujo aórtico bruto y el gasto cardíaco en un sistema de perfusión Langendoff. Una de las principales ventajas del protocolo IWRH es la capacidad de obtener mediciones funcionales del flujo aórtico y del gasto cardíaco sin necesidad de intervenciones adicionales del corazón (es decir, catéter con balón). Existen opciones comerciales para un sistema de perfusión cardíaca de rata que funcione y, aunque pueden personalizarse para los requisitos individuales del estudio, estos sistemas pueden ser costosos.

Hay pasos críticos en el protocolo para garantizar una función basal óptima del corazón del roedor durante la perfusión. La preparación de las soluciones de reserva tampón KHB no debe tener más de 4 semanas. El circuito de perfusión debe estar libre de burbujas de aire durante el cebado. Se debe tener cuidado al canular el apéndice auricular izquierdo. La manipulación excesiva del tejido puede aumentar el riesgo de desgarro y también puede aumentar la irritabilidad funcional del corazón.

La calidad del rendimiento del circuito de perfusión IWRH generalmente se puede determinar por las lecturas basales obtenidas en corazones (AF > 30 mL/min, CF ~20 mL/min). Se pueden realizar pruebas de control de calidad adicionales en un modelo CSS deteniendo y almacenando el corazón en una solución de conservación Celsior suplementada con 1 μmol/L de zoniporide más 0,1 mg/mL de trinitrato de glicerilo. Los corazones detenidos con Celsior suplementado con trinitrato de glicerilo más zoniporide garantizan una recuperación inmediata de la reperfusión de Langendorff y una recuperación funcional final entre el 40-60% después de 6 h de almacenamiento en frío. En caso de duda sobre si el equipo está funcionando bien, es útil probar esta suplementación de control de calidad.

Los métodos para el uso de corazones de roedores obtenidos por donación después de la muerte circulatoria han sido descritos previamente10,11. Brevemente, se anestesia a las ratas, se canulica la arteria carótida y se obtienen lecturas de presión. La heparina (500 UI) se inyecta a través de la cánula de la arteria carótida. La tráquea se liga para iniciar la retirada del soporte vital. Una vez que se alcanza el tiempo isquémico caliente requerido, el corazón puede ser extirpado y canulado en el circuito de perfusión. Para la administración de la solución de conservación en el corazón del DCD, se enjuagan 60 mL de solución de conservación a través de la aorta (~20 mL/min) a través de la línea de presión en el circuito. Se ligan los vasos pulmonares, se diseccionan los pulmones, se inserta la cánula izquierda y luego se enjuagan 40 ml de solución de conservación a través de la línea de presión. A continuación, se perfunde el corazón según el protocolo anterior. La recuperación funcional se toma como un valor bruto de la hemodinámica funcional, y el análisis estadístico se realiza comparando los valores con los corazones que fueron operados de forma simulada (sin DCD, sin embargo, no se lavó en la plataforma).

Los métodos para el uso de corazones de roedores obtenidos después de la muerte encefálica han sido descritos previamente12. En resumen, los animales son anestesiados, intubados y ventilados, con monitoreo hemodinámico según el protocolo de roedores DCD. Se realiza un orificio de rebaba en el cráneo temporoparietal y se coloca un catéter de embolectomía 3F por vía subdural. Los controles simulados tienen orificios de rebaba, pero no se insertan catéteres. El globo se infla con 0,3 mL de agua durante 2 min y se mantiene inflado durante 1 h. Después de 1 h de observación hemodinámica, los corazones se explantan y se colocan en el circuito de perfusión cardíaca de trabajo aislado, se registran las mediciones basales, se administra la cardioplejia y los corazones se almacenan en frío como se describe anteriormente.

La principal limitación del uso del circuito de perfusión IWRH es la imposibilidad de utilizar un tampón de perfusión basado en sangre para circular por el sistema. Sería imposible obtener suficiente sangre de roedor para agregarla a la perfusión; por lo tanto, la perfusión sanguínea no es factible. Es probable que sea necesario realizar modelos alternativos, como el trasplante de corazón heterotópico en roedores o los estudios de trasplante de corazón ortotópico de animales grandes, para probar el impacto de la perfusión sanguínea. Sin embargo, estos métodos alternativos requieren experiencia en habilidades microquirúrgicas y/o instalaciones quirúrgicas de animales grandes y anestesistas, perfusionistas y cirujanos cardiotorácicos experimentados.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los estudios descritos aquí han sido financiados por subvenciones otorgadas a P.S Macdonald por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia, la Fundación de la Clínica St Vincent y la Subvención de Investigador Senior de la Capacidad de Investigación Cardiovascular de NSW Health.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo Eppendorff incoloro de 1,5 mL, 1000 por cajaBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL cent/tubos (S) Manguito/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Kit de transductor/cableADInstruments MLT1199Puente de adquisición de datos
ADInstrumentsFE221Carbogen de adquisición de datos
555G2BOCBOC002
Termómetro Checktemp1Hanna InstrumentsHI98509Abrazadera de construcción de aparejos
Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Abrazadera de construcción de aparejos
con vástago de extensión Med.Thomas Scientific8847T08Abrazadera de construcción de plataforma
con vástago de extensión Sm.Thomas Scientific8847T02Clips para la construcción de la plataforma
, recipiente, 60 g Conectorequipos quirúrgicosScientific14121
Scientific8847E25Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 negro precortado 45 cm caja de 24Suministros Médicos EspecializadosS195Consumibles quirúrgicos
Hecho a medida 250 mL Desgasificador encamisadoCristalería soplada a medida Pty LtdN/AConstrucción de la plataforma
Depósito a medida de 750 mL Cristaleríasoplada a medida Pty LtdN/AConstrucción de la plataforma
D-(+)-Glucosa anhidra SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgPara hacer Krebs Buffer
Consola de doble canal ADInstrumentsTS402Adquisición de datos
Matraces Erlenmyer 2 L 
Filtro Microfibra tipo GF/C fibra de vidrio 47 mm, 100Bio-strategy Pty Ltdde 1822047
, 15 cm, 0,3 mm, CRVDCoherent Scientific14114Equipo quirúrgico Cuatro
pinzas de punta con brazo de 9 mm x 115 mm de largo para sujetar objetos de 2-70 mm de diámetro. Recubierto de vinilo Met-App Australia Pty Ltd1352Rig
Construction Heater Circulator. Control digital de estado sólido. (1020 vatios/240 voltios)Thermoline ScientificTU3Construcción de
equipos de perforación Heparina 5000 U/5 mL caja 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Medicamentos
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010Anestésico
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Ketamina 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Anestésico
Sulfato de Magnesio heptahidratado AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gPara hacer Krebs
Buffer Adaptador con bisagras macho/hembraThomas Scientific8847V08Rig Construction
Masterflex L/S Cabezal de carga fácil para tubos de precisión, PPS, CRS RotorJohn Morris1015164Rig Construction
Tijeras Metzenbaum, curvas de 11,5 cmCoherent ScientificWPI-501748Equipo quirúrgico
Tijeras Metzenbaum, rectas de 14,5 cmCoherent ScientificWPI-501252Herrajes de montaje para equipos quirúrgicos
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Tornillos de montaje para cabezales de bomba
Conector de lado abiertoThomas Scientific8847E05Construcción
de equipos de perforación Paraformadehído Sigma-AldrichP6148-500GProcesamiento de muestras
Cloruro de potasio (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR Chemicals 26764.26Para hacer Krebs
Buffer Fosfato de potasio monobásico Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gPara hacer Krebs Buffer
Powerlab 2/26, Registrador de 2 canales + SoftwareLabchart ADInstrumentsML826Hardware y software de computadora
Precision XN Sensor de flujo en línea, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXN
Bisturí de construcción de plataforma con mango desechable #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Junta de silicona para Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701 Rig Construction
Junta tórica de silicona 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707 Rig Construction
Abrazadera de bureta simpleThomas Scientific8847T32Rig Construction
Entrada deslizante Tamaño de poro del filtro 10 y micro; m (burbujeador)Sigma-aldrich59277Construcción de equipos
Sm. 360 Conector de rotaciónThomas Scientific8847E35Construcción de equipos de perforación
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gPara hacer Krebs Buffer
Swinnex Portafiltros, 47 mmJeringas Merck MilliporeSX0004700Rig Construction Caja
1 mL/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Abrazaderas de tres puntas con brazo de 9 mm de diámetro x 125 mm de largo y doble tornillo para sujetar 5-80 mmMet-App Australia Pty Ltd1356Módulo
de caudalímetro de tubería de construcción de plataforma TS410 Instrumentos TS410adquisición de datos
PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD Rollo de 50 pies 15,24 m, transparente, sin ftalatos de DEHP, grado alimenticio cumple con REACThermo FisherNAL 8701-0600Construcción de plataformas
Tubo de PVC de 7,94 mm de diámetro interno x 11,1 mm de diámetro exterior Rollo de 50 pies de 15,24 m, transparente, sin ftalatos de DEHP, grado alimenticio cumple con REACThermo FisherNAL 8701-0900
Tubo de construcción de plataformas de PVC de 9,52 mm de diámetro interno x 12,7 mm de diámetro exterior Rollo de 100 piesThermo FisherNAL 8701-4120 Construcción deequipos de perforación
Tijeras Vannas, 8,5 cm, rectas, 7 mm Cuchillasquirúrgico
Coherent Scientific WPI-500-086Baño de agua de 30 litros con bandeja suspendidaThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
cerrado para coherentes a la presión Thomas Pinzas de Tubo de Equipo

Referencias

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