Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Resumen

Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) son fundamentales para el correcto funcionamiento de la retina. La disfunción del EPR está implicada en la patogénesis de importantes enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la retinopatía diabética. Presentamos un enfoque simplificado para el aislamiento del EPR de los ojos de adultos murinos. A diferencia de los métodos informados anteriormente, este enfoque permite el aislamiento y el cultivo de EPR de alta pureza a partir de ratones adultos. Este método simple y rápido no requiere una gran habilidad técnica y se puede lograr con herramientas y reactivos científicos básicos. El EPR primario se aísla de ratones de fondo C57BL/6 de 3 a 14 semanas de edad mediante la enucleación del ojo seguida de la extirpación del segmento anterior. La tripsinización enzimática y la centrifugación se utilizan para disociar y aislar el EPR de la copa ocular. En conclusión, este enfoque ofrece un protocolo rápido y eficaz para la utilización del EPR en el estudio de la función y la enfermedad de la retina.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa celular especializada que recubre la membrana de Bruch ubicada entre los fotorreceptores y la coroides¹. Las células EPR desempeñan un papel fundamental en el correcto funcionamiento de la retina. Las células EPR transportan glucosa y vitamina A a los fotorreceptores, promueven la visión mediante la reisomerización de todo el retinal trans en retinal 11-cis y mantienen los segmentos externos del fotorreceptor a través de la fagocitosis de los segmentos externos desprendidos, eliminan el agua del espacio subretiniano, forman la barrera hematorretiniana externa a través de la presencia de uniones estrechas y secretan factores de crecimiento neurotrópico (como el factor derivado del epitelio pigmentario, y Factor Básico de Crecimiento de Fibroblastos) que apoyan los fotorreceptores². La disfunción de las células EPR está involucrada en la patogénesis de diversas retinopatías, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la retinopatía diabética ^3,4,5. Los estudios in vitro con células EPR son fundamentales para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Las células primarias del EPR son las preferidas para estos estudios, ya que las líneas celulares del EPR, aunque están fácilmente disponibles, carecen de las características clave de las células primarias del EPR.

Mientras que varias especies se han utilizado como fuentes de células primarias de EPR, los ratones tienen la ventaja de utilizar modificaciones genéticas para ayudar a comprender la patogénesis de las retinopatías. Los protocolos previamente descritos para aislar células EPR de roedores requieren el uso de animales neonatos, son largos, requieren habilidad técnica o no son adecuados para el cultivo 6,7,8,9,10,11,12. Describimos un método simple y rápido para aislar células EPR de ratones adultos que producen cultivos altamente puros de estas células.

Protocolo

El uso de sujetos animales en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Case Western Reserve.

1. Preparación de reactivos

1. Prepare el medio tampón de lavado complementando la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol con 10 mM de solución tampón HEPES. Mantener la solución a 4 °C hasta su uso.
2. Prepare el medio RPE complementando el Medio de Águila Modificado de Dulbecco con 4,5 g/L de glucosa, 1,25x GlutaMAX Supplement (concentración de stock 100x o 200 mM; concentración final de 2,5 mM L-glutamina), con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina y 1x Solución de Aminoácidos No Esenciales MEM (100x). Antes de usar, precaliente el medio a 37 °C en un baño de agua.

2. Extracción del ojo del ratón

1. En este estudio se utilizó la eutanasia del ratón, preferiblemente de 3 a 14 semanas de edad, utilizando un método de eutanasia aprobado por la IACUC (dislocación cervical bajo anestesia con un cóctel de ketamina/xilacina a 0,1 mL por 20 g de ratón [87,5 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilacina]).
   NOTA: Los ojos recolectados de ratones más jóvenes facilitarán un aumento de la producción de células epiteliales pigmentarias de la retina con el tiempo y extenderán la capacidad de pasos sucesivos.
2. Coloque el ratón de lado con el ojo orientado hacia arriba.
3. Coloque el dedo índice y el pulgar por encima y por debajo del ojo, respectivamente. Aplique suavemente presión sobre la estructura ósea que rodea el ojo para inducir la protrusión del globo ocular.
4. Inserte la punta de las tijeras ligeramente abiertas debajo del ojo y gire suavemente la muñeca lejos del ojo 90° hasta que el ojo se desprenda de la cuenca.
   NOTA: No cierre las tijeras para cortar el ojo o el nervio óptico, ya que dificultará la disección de la copa del ojo.
5. Coloque inmediatamente y enrolle el ojo en etanol al 70% durante no más de 5 s antes de transferirlo a un medio tampón de lavado mantenido en hielo.
6. Bajo un microscopio de disección, transfiera un ojo a la vez a una placa de Petri llena de tampón de lavado y tiras de gasa empapadas.
7. Estabilice el ojo sujetando el nervio óptico con pinzas. Realice suavemente una incisión a nivel de la ora serrata con un bisturí quirúrgico de 3,00 mm a 45° o una hoja de afeitar de 0,009".
8. Con las tijeras Vannas, inserte suavemente la tijera en la incisión y corte alrededor de la circunferencia de la ora serrata hasta que el segmento anterior y el vítreo puedan extraerse y desecharse.
9. Despegue suavemente la retina del ocular con pinzas atadas, con cuidado de no alterar la capa de EPR.
   NOTA: Para que la retina sea más fácil de extraer, llene una pipeta de transferencia con medio tampón de lavado y aplíquela cuidadosamente en los bordes del ocular para levantar suavemente la retina.
10. Finalmente, retire el nervio óptico y el exceso de tejido conectivo del ocular con unas tijeras. Tenga cuidado de no perforar el ocular.

3. Aislamiento del EPR primario

1. Transfiera el ocular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 1 mL de tripsina al 0,25 % + EDTA al 0,02 %.
   NOTA: Se pueden agregar dos oculares a una alícuota de tripsina-EDTA para aumentar el rendimiento de RPE cultivable.
2. Transfiera los tubos de la microcentrífuga a un baño de agua a 37 °C e incube durante 10 minutos. Cada 2 minutos, retire los tubos del baño de agua y golpee firmemente la parte inferior del tubo 40 veces sobre la encimera.
3. Después de 10 minutos, rompa suavemente el ocular mecánicamente con una pipeta serológica P1000 o de 2 ml pipeteando hacia arriba y hacia abajo no más de 3 veces.
   NOTA: La fragmentación de las hojas de RPE es esencial ya que las hojas grandes no se adherirán correctamente.
4. Neutralice la tripsina inmediatamente colocando las láminas de EPR desprendidas, pero no el ocular, sobre 0,5 ml de suero fetal bovino (FBS) en un tubo cónico de 15 ml.
5. Además, diluya la tripsina colocando 3 mL de medios de RPE gota a gota sobre las capas de hojas de FBS y RPE.
6. Centrifugar el RPE a 340 x g durante 3 min.
7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en una cantidad adecuada de medio RPE para una placa de 24 pocillos (1,9 cm²/pocillo) o una placa de 48 pocillos (0,75 cm²/pocillo).
   NOTA: El EPR se puede colocar en placas de pocillos recubiertas con proteínas de la matriz extracelular, específicamente laminina, colágeno IV o fibronectina, para aumentar la adherencia¹¹. El EPR también se puede resuspender en 1 ml de medio EPR y colocarse en capas en un gradiente de separación de densidad del 40% para aislar aún más las células de EPR puro. Además, girar la placa a 340 x g durante 3-5 min puede aumentar la adhesión celular¹³.
8. Incubar a 37 °C con 5% de CO₂.

4. Cultivo de RPE

1. No interrumpa el EPR aislado durante al menos 3 días. Después de 72 h, retire suavemente el medio viejo y reemplácelo con medios nuevos y precalentados.
2. Cambiar el medio cada 48 h después de los 3 primeros días.
3. Una vez que las células alcancen la confluencia, pase las células usando 0.25% de tripsina + 0.02% de EDTA y reduzca el FBS en el medio RPE al 2%.
   NOTA: Anteriormente se informó que los EPR primarios comienzan a desdiferenciarse después de 5-7 pases y comenzarán a perder su forma hexagonal y pigmentación¹⁴.

Resultados

El protocolo descrito se ha utilizado en ratones de fondo C57BL/6. El género no parece cambiar la capacidad de cultivar EPR. Los ratones de menos de 6 semanas producen hojas de RPE limitadas en comparación con los ratones más viejos, y es posible que se necesiten más ojos para alcanzar una confluencia óptima. Después del aislamiento, las células del EPR tardan aproximadamente 3 días en estabilizarse y adherirse a la placa de cultivo celular. Aproximadamente 24 h después del aislamiento, las células redondas y pigmentadas que parecen anucleadas han comenzado a asentarse pero no se han adherido completamente a la placa (Figura 1A). Durante las siguientes 48-72 h, las células comienzan a adherirse y extenderse mientras mantienen su pigmentación oscura y su núcleo transparente (Figura 1B, C). Después de 5 días, los EPR han aumentado la confluencia y han comenzado a formar contactos de célula a célula que recuerdan a una monocapa polarizada con forma hexagonal (Figura 1D).

Se evaluó la pureza y la integridad de la unión cerrada del EPR aislado después de 6 días en cultivo. En primer lugar, se evaluó el EPR para detectar la presencia de retinoide isomerohidrolasa o de la proteína 65 kDA del epitelio pigmentario de la retina (RPE65), un marcador específico del EPR (Figura 2, verde). Además, para que el EPR forme una sola capa de células pigmentadas y de forma hexagonal, las uniones de célula a célula deben permanecer intactas. La proteína-1 de unión estrecha o zonula occludens-1 (ZO-1) son proteínas de andamiaje vitales para el mantenimiento y la integridad de las uniones estrechas entre las células individuales del EPR¹⁴. Los cultivos aislados confluentes de EPR mantuvieron sus proteínas de unión intercelular, lo que se demuestra mediante la tinción de ZO-1 encontrada en la periferia de la célula (Figura 2, rojo). Una vez que estas células alcanzan la confluencia en láminas grandes, mantienen contactos de célula a célula sin crecer en exceso durante un máximo de 2 semanas. Estudios previos han demostrado que ZO-1 se expresa altamente hasta por 9 días en cultivo¹⁵. Los marcadores adicionales utilizados en los cultivos de EPR primario incluyen colágeno IV, CRALBP y OTX2¹¹.

Figura 1. Morfología del EPR primario de ratón cultivado en placa estándar de poliestireno de 24 pocillos. (A) EPR primario aislado de ambos ojos de un ratón C57BL/6 y cultivado en un solo pocillo de una placa de poliestireno de cultivo de tejido no recubierta de 24 pocillos directamente después del aislamiento. (B,C) Después de 48 h y 72 h, el EPR primario comienza a adherirse a la placa y forma células pigmentadas y binucleadas. (D) Después de 5 días, la microscopía de campo claro muestra que las células hiperpigmentadas de forma hexagonal aumentan la confluencia y comienzan a formar contactos de célula a célula. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. El marcador específico de RPE, RPE-65, y el marcador de unión intercelular, ZO-1, se conservan en EPR murino primario aislado. El EPR primario de tres ratones C57BL/6 se cultivó durante 6 días antes de la fijación con paraformaldehído al 4%. Las células se permeabilizaron con Triton-X al 0,1% en PBS durante 5 min, se bloquearon con suero normal de cabra al 5% y se incubaron con anticuerpos contra RPE-65 (verde) o ZO-1 (rojo). Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Representación esquemática simplificada del protocolo de aislamiento del epitelio pigmentario de la retina. Después de retirar el globo ocular del ratón, esterilice el ojo sumergiéndolo brevemente en etanol al 70% antes de pasar al tampón de lavado. En el tampón de lavado, corte a lo largo de la ora serrata y retire el segmento anterior. Extraiga la retina y coloque el ocular en un tubo con tripsina/EDTA. Golpee suavemente el tubo en el mostrador cada 2 minutos durante 10 minutos en total, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml y centrifugue el pellet de RPE. Vuelva a suspender las células y la placa en una placa de 24 o 48 pocillos. Gráficos generados con BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este artículo, hemos esbozado un protocolo simplificado para el aislamiento y cultivo del epitelio pigmentario de la retina murina. Las células EPR aisladas de los ojos de ratones adultos expresaron un marcador específico de EPR, RPE65, y un marcador de unión intercelular, ZO-1. Además, las células cultivadas se desarrollaron en láminas hexagonales pigmentadas durante el cultivo.

Anteriormente se han publicado varios métodos para el aislamiento de EPR en roedores 6,7,8,9,10,11,12. Muchos protocolos despegan las capas de EPR de la membrana de Bruch, lo que requiere habilidad técnica y aumenta el riesgo de daño o muerte celular^del EPR 6,7,9,11,12,16. Por lo tanto, este protocolo utiliza el desprendimiento enzimático de la capa de EPR, en lugar de la disociación mecánica, para promover la supervivencia y mantener la integridad de las láminas de EPR en cultivo. Este método produce RPE de ratón en un cultivo que mantiene la morfología de RPE con células altamente pigmentadas y de forma hexagonal que conservan la expresión de proteínas de unión estrecha. Además, este protocolo carece del uso de reactivos complejos o materiales utilizados en otros protocolos, como insertos de membrana permeable, proteínas de recubrimiento de matriz extracelular adicionales o reactivos especializados en disociación de tejidos. En su lugar, este protocolo utiliza una digestión enzimática simple con tripsina-EDTA al 0,25% en combinación con agitación tisular para disociar la capa de EPR de la membrana de Bruch. Este protocolo se ha realizado con éxito en ratones de 3 a 14 semanas de edad; Sin embargo, es posible que se necesiten más ojos para obtener con éxito un cultivo confluente en ratones jóvenes.

Pueden surgir varios desafíos durante la ejecución de este protocolo. Se requiere habilidad técnica para cortar con precisión alrededor de la ora serrata y extraer cuidadosamente la retina sin alterar la capa de EPR. La retina puede verse alterada al cortar la circunferencia de la esclerótica, lo que puede alterar la viabilidad del EPR. El refinamiento de esta técnica solo se puede lograr a través de la práctica repetitiva y continua. Además, las láminas de EPR pueden permanecer adheridas a la capa de la retina después de la extracción. Para evitar la pérdida excesiva de EPR, estimule el desprendimiento de retina mediante el uso de una jeringa o pipeta de transferencia llena de medio tampón de lavado para levantar suavemente los bordes de la retina del ocular. La incubación de la hialuronidasa también puede facilitar el desprendimiento¹⁶. En el caso de que los EPR no se desprendan adecuadamente de la membrana de Bruch y la coroides, aumente el tiempo de incubación con tripsina en el baño de agua. Además, congele las alícuotas de tripsina fresca a -20 °C y descongele directamente antes de su uso para mantener una actividad enzimática óptima. Si las células se siembran a una densidad demasiado baja o si el EPR se daña durante el proceso de aislamiento, puede producirse si el EPR se adhiere a la placa del pocillo después del aislamiento. Además, nuestro protocolo no requiere el recubrimiento de proteínas de matriz extracelular (MEC) para el cultivo. Sin embargo, se ha demostrado que las proteínas de la MEC, como la fibronectina, el colágeno IV, la laminina o el colágeno I, aumentan la adhesión celular y deben tenerse en cuenta si la adherencia es deficiente¹¹.

Para aumentar el rendimiento de las monocapas cultivadas con RPE, agrupe al menos 2-3 ojos de ratones de la misma edad con el mismo fondo genético; Las células pueden perder su forma hexagonal y pigmento con el tiempo si no se siembran a una densidad lo suficientemente alta. Para los ratones que tienen más de 8 semanas de edad, 2 ojos por placa de 24 pocillos deberían ser suficientes para una confluencia óptima. Si los ratones tienen menos de 8 semanas de edad, 3-4 ojos darán como resultado una mejor adherencia y confluencia. Con el tiempo, las células pueden ser susceptibles a la transición epitelio-mesenquimal (EMT) con pérdida de pigmentación y adquisición de una forma alargada. La adición de inhibidores de la Rho-quinasa y de TGFβR-1/ALK5, como Y27632 y Repsox, respectivamente, puede prevenir la EMT de las células EPR cultivadas¹². Si bien el protocolo de aislamiento es breve, solo requiere 1 h para el aislamiento de 2 a 4 ojos, el cultivo primario puede tardar hasta 7 a 10 días en alcanzar la confluencia completa. Además, el RPE de paso es limitado, con un mayor riesgo de EMT en cada paso posterior.

Las células epiteliales pigmentarias de la retina son células críticas para mantener la homeostasis en el ojo. Los EPR actúan como fagocitos para ayudar en el mantenimiento de los fotorreceptores, evitan que las capas neuronales sufran daños por luz y actúan como una barrera epitelial apretada para regular el transporte¹⁷. Las enfermedades que afectan directamente al EPR, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinitis pigmentosa y la retinopatía diabética, pueden exacerbar la inflamación, aumentar la apoptosis y alterar las uniones celulares, lo que aumenta la probabilidad de degeneración de la retina y ceguera¹⁷. El cultivo de EPR primario facilita el estudio de la patogenia de las enfermedades oculares que afectan al EPR. En conclusión, nuestro protocolo acorta la duración del aislamiento y simplifica las técnicas y reactivos necesarios, manteniendo el cultivo celular de alta pureza.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.009 RD Cuchillas de un solo filo	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio
Suero fetal bovino	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Solución salina equilibrada	Gibco	14175095	sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol
Solución tampón HEPES (1M)	Gibco	15630106
MEM Aminoácidos no esenciales, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Solución de penicilina-estreptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
	Falcon	08-772-1	de 24 o 48 pocillos
	Corning	35-010-CV
Tripsina-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	con rojo fenol
Tijeras Vannas	Fine Science Tools	10091-12