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Artículo de investigación

Información mecanicista sobre la protección mitocondrial de Salidroside a través de la vía AMPK/Sirt1/HIF-1α en células HT22 hipóxicas

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DOI:

10.3791/66923

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25 de abril de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

En este artículo

Resumen

El presente estudio identificó un mecanismo único por el cual el salidrósido ejerce efectos protectores mitocondriales sobre las células HT22 hipóxicas, en parte a través de la vía AMPK/Sirt1/HIF-1α.

Resumen

Se ha descubierto que el salidrósido (Sal), un ingrediente activo de Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba, ejerce efectos protectores mitocondriales al mejorar el metabolismo y aumentar el suministro de energía de las células cerebrales en condiciones hipóxicas. Sin embargo, su mecanismo de acción no ha sido completamente aclarado. En el presente estudio, se empleó por primera vez la cromatografía líquida de alta resolución para analizar los efectos del Sal en los niveles de nucleótidos (ATP, ADP y AMP). A continuación, se eligió el ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), un método de interacción molecular ampliamente utilizado para validar y cuantificar la participación de dianas farmacológicas en células y tejidos de diferentes especies, para confirmar la afinidad de Sal por las proteínas relacionadas con la vía AMPK/Sirt1/HIF-1α. Los resultados revelaron que Sal aumentó los niveles de ATP y ADP en las células HT22 hipóxicas, al tiempo que redujo los niveles de AMP. Además, Sal exhibió una unión estable a las proteínas AMPKα, p-AMPKα, Sirt1 y HIF-1α. En conclusión, Sal puede ejercer efectos protectores mitocondriales al modular la vía AMPK/Sirt1/HIF-1α para regular el contenido de nucleótidos. Este estudio proporciona una referencia metodológica para el análisis del contenido de nucleótidos en muestras celulares y contribuye a la identificación y descubrimiento de objetivos para compuestos derivados de la medicina tradicional china.

Introducción

El cerebro es muy sensible al oxígeno debido a sus altas demandas metabólicas, su limitada capacidad glucolítica y su dependencia de la fosforilación oxidativa. Como resultado, la exposición a un ambiente con poco oxígeno a grandes altitudes puede conducir fácilmente a una lesión cerebral hipóxica hipobárica (HHBI)1,2. Los estudios epidemiológicos indican que cuando los individuos no aclimatados a las grandes altitudes ascienden rápidamente a las regiones de gran altitud, la incidencia del mal agudo de montaña puede alcanzar hasta el 75%, con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 1% para los casos graves. Además, en ausencia de atención médica, las tasas de mortalidad por edema cerebral o pulmonar a gran altitud pueden ser tan altas como el 40%3,4.

El HHBI se presenta con un amplio espectro de síntomas clínicos. Los casos leves a moderados pueden incluir dolores de cabeza, mareos y pérdida de memoria5, mientras que los casos graves pueden provocar deterioro cognitivo, alteración de la conciencia y resultados potencialmente fatales5. La prevención y el tratamiento del HHBI en las regiones de gran altitud se han convertido en un foco clave de la investigación médica. Las estrategias preventivas implican principalmente el entrenamiento adaptativo en entornos de gran altitud, incluyendo un descanso adecuado, una dieta bien balanceada, una nutrición adecuada y un ejercicio físico adecuado 6,7. Además, las intervenciones farmacológicas destinadas a proteger las células cerebrales y aliviar la hipoxia cerebral siguen siendo fundamentales para la investigación actual de la HHBI.

Las mitocondrias sirven como los principales centros de producción de energía dentro de las células, sintetizando trifosfato de adenosina (ATP) para satisfacer las demandas de energía celular. En condiciones hipóxicas, la producción de energía mitocondrial disminuye, lo que lleva a una reducción de los niveles de ATP y a un deterioro de la función celular. La lesión hipóxica también altera la regulación mitocondrial del Ca2+ y la homeostasis del pH, desencadenando la apoptosis y la necrosis 9,10. Existe una relación que se refuerza mutuamente entre la disfunción mitocondrial y la lesión cerebral hipóxica. Por un lado, el deterioro mitocondrial inducido por la hipoxia exacerba la deficiencia de oxígeno al reducir aún más el metabolismo energético celular, creando un círculo vicioso. Por otro lado, la disfunción mitocondrial eleva los niveles intracelulares de Ca2+, activando cascadas apoptóticas y conduciendo a la muerte celular11. Aunque los mecanismos subyacentes a la lesión cerebral hipóxica siguen siendo complejos y no se comprenden completamente, múltiples estudios han identificado el deterioro del metabolismo energético neuronal mitocondrial como un factor crítico en su patogénesis12,13. Por lo tanto, una mayor exploración de la función mitocondrial puede proporcionar información valiosa sobre posibles objetivos terapéuticos para la lesión cerebral hipóxica.

El salidrósido (Sal) es un ingrediente activo extraído de la planta de meseta, Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba, y es ampliamente utilizado en alimentos, productos de salud y productos farmacéuticos14. La fórmula molecular de Sal es C14H20O7, y también se conoce como 2-(4-hidroxifenil)-etilo β-D-glucopiranósido. Posee diversas propiedades farmacológicas, entre las que se destacan efectos antihipoxia, antioxidante, antifatiga, antitumoral, inmunomodulador, antiinflamatorio y protector cardiovascular y cerebrovascular 15,16,17. Entre estos, su efecto antihipoxia es uno de los mejor documentados. Estudios recientes han destacado cada vez más los importantes efectos protectores mitocondriales del Sal como un mecanismo potencial para sus efectos preventivos y terapéuticos sobre la lesión cerebral inducida por meseta en ratones14,18. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos por los cuales el Sal influye en los niveles de ATP, ADP y AMP siguen siendo poco conocidos.

La proteína quinasa activada por AMP (AMPK) actúa como un sensor de energía clave que ayuda a mantener la homeostasis de la energía celular. La activación de la AMPK estimula la sirtuina 1 (Sirt1), lo que conduce a un aumento de los niveles intracelulares de NAD+ 19. Los estudios han demostrado que Sirt1 puede regular el factor 1-alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) para coordinar la respuesta celular a la hipoxia20. Investigaciones anteriores han demostrado que Sal inhibe la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial neuronal, regula los procesos de energía mitocondrial mediados por HIF-1α, atenúa la apoptosis neuronal y mantiene la integridad de la barrera hematoencefálica, protegiendo así a las ratas de la lesión cerebral inducida por la meseta14,21. Sin embargo, el efecto del Sal sobre el ATP y sus metabolitos, ADP y AMP, sigue siendo incierto.

Para investigar esto, primero se empleó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para cuantificar los niveles de estos tres nucleótidos. Además, se utilizó el ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), una técnica biofísica ampliamente utilizada e introducida en 2013 para estudiar las interacciones ligando-proteína en células intactas22. Este método se aplica comúnmente para validar y cuantificar la participación de fármacos y dianas en células y tejidos de diferentes especies. Específicamente, después de co-incubar lisados de células diana con el fármaco a temperaturas variables durante un período determinado, la proteína unida al fármaco exhibe una mayor estabilidad térmica, lo que la hace menos propensa a la desnaturalización y la precipitación. A continuación, las proteínas precipitadas no unidas se eliminan mediante centrifugación, y las interacciones entre el fármaco y el objetivo se identifican posteriormente mediante el análisis de Western blot del sobrenadante22. Para identificar posibles dianas moleculares de Sal, se seleccionó CETSA para evaluar su afinidad de unión con las proteínas relacionadas con la vía AMPK/Sirt1/HIF-1α.

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Protocolo

Los detalles comerciales de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la solución

  1. Prepare el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) añadiendo un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Prepare una solución de 20 mM de sal disolviendo 3 mg de sal en 500 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS)21.
  3. Filtre 500 mL de acetonitrilo cromatográficamente puro (fase móvil A) utilizando una membrana orgánica de 0,45 μm.
  4. Prepare 1000 mL de fase móvil B añadiendo 3,5 mL de reactivo I a 1 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 6,15 con el reactivo II, siguiendo las instrucciones del kit de ensayo de contenido de nucleótidos (ATP, ADP y AMP) (consulte la tabla de materiales).
    NOTA: Los reactivos I y II están incluidos en el kit de ensayo de contenido de nucleótidos (ATP, ADP y AMP).
  5. Filtre la fase móvil B con una membrana acuosa de 0,22 μm.
    NOTA: La fase móvil B debe usarse inmediatamente después de la preparación. Las fases móviles A y B deben sonicarse durante 30 minutos antes de su uso para eliminar las burbujas de aire.
  6. Diluya una solución madre estándar de ATP, ADP y AMP de 1 μM con agua desionizada para obtener soluciones estándar de las series ATP, ADP y AMP de 0,5 μM, 0,1 μM, 0,05 μM, 0,01 μM y 0,005 μM de ATP, ADP y AMP.
  7. Filtre la serie de soluciones estándar utilizando una membrana filtrante microporosa tipo aguja de 0,22 μm.
    NOTA: Se deben usar frascos de inyección marrones para almacenar las soluciones estándar en serie. La serie preparada de soluciones estándar debe utilizarse lo antes posible.

2. Cultivo celular

NOTA: El cultivo celular HT22 y el modelo de hipoxia estimulada por CoCl2 se establecieron de acuerdo con un informe previo21.

  1. Cultivo de células HT22 a 37 °C con 5% de CO2 hasta alcanzar una confluencia del 80% en la placa de Petri. Digiere las células con tripsina al 0,25% durante 1 min.
  2. Siembre 2 × 105 células del paso 2.1 en placas de 6 pocillos con DMEM completo (grupo de control sin tratamiento farmacológico) o DMEM completo que contenga el fármaco (250 μM CoCl2, 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor, 250 μM CoCl2 + 20 μM Sal y 250 μM CoCl2 + 10 μM Dor + 20 μM Sal). Incubar durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2.
    NOTA: Se establecieron tres muestras paralelas en cada grupo.

3. Ensayo de contenido de nucleótidos (ATP, ADP y AMP)

  1. Agregue 1 mL de reactivo de extracción I a cada pocillo en las placas de 6 pocillos del paso 2.2.
    NOTA: El reactivo de extracción I está incluido en el kit de ensayo de contenido de nucleótidos (ATP, ADP y AMP) (consulte la tabla de materiales).
  2. Lisar las células sonicándolas en un baño de hielo utilizando un aparato ultrasónico de disrupción celular (potencia: 300 W, ondas ultrasónicas durante 3 s, intervalo de 7 s, tiempo total: 3 min).
  3. Centrifugar las células lisadas a 10.304 × g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga refrigerada de alta velocidad.
  4. Transfiera 0,75 mL de sobrenadante del paso 3.3 a un tubo de 2,0 mL. Añadir 0,75 mL de reactivo de extracción II, agitar y mezclar con un mezclador de vórtice y centrifugar de nuevo a 10.304 × g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: El reactivo de extracción II está incluido en el kit de ensayo de contenido de nucleótidos (ATP, ADP y AMP).
  5. Pipetear el sobrenadante del paso 3.4 y filtrarlo con una membrana filtrante microporosa de tipo aguja de 0,22 μm en un vial marrón.
    NOTA: ATP, ADP y AMP en la muestra extraída no son estables. Todos los procedimientos experimentales deben realizarse a bajas temperaturas o sobre hielo. Las muestras deben procesarse y analizarse lo antes posible.
  6. Abra el software de cromatografía y configure los siguientes parámetros: volumen de inyección: 10 μL; temperatura de la columna: 27 °C; caudal: 0,8 mL/min; longitud de onda de detección: 254 nm; Duración de la detección: 70 min. Ajuste el procedimiento de elución en gradiente de acuerdo con la Tabla 1.
  7. Haga clic en el botón ejecutar para inyectar automáticamente la muestra y detectar el contenido de ATP, ADP y AMP en soluciones estándar en serie (paso 1.7) y soluciones de muestra (paso 3.5) de acuerdo con el programa establecido en el paso 3.6.
    NOTA: Al final del experimento, lave la columna cromatográfica con un 98% de fase móvil B para evitar obstrucciones.
  8. Traza las curvas estándar de ATP, ADP y AMP utilizando software de análisis estadístico y gráficos, con concentraciones estándar en serie en el eje x y áreas de pico en el eje y.
  9. Calcule el contenido de ATP, ADP y AMP en las muestras utilizando la ecuación de la curva estándar del paso 3.8.

4. Ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA)

  1. Lisar células HT22 normales durante 20 minutos en una placa de Petri utilizando lisado que contenga inhibidores de la proteasa (lisado: inhibidor de la proteasa = 100:1) pipeteando repetidamente las células.
    NOTA: Realice este paso en un baño de hielo para evitar la degradación de proteínas.
  2. Recoja el lisado celular del paso 4.1 y sonique en un baño de hielo utilizando un aparato ultrasónico de disrupción celular (potencia: 300 W, ondas ultrasónicas durante 3 s, intervalo de 7 s, tiempo total: 3 min). Centrifugar a 10.304 × g, 4 °C durante 20 min y recoger el sobrenadante.
    NOTA: Divida el sobrenadante en 14 porciones: 7 grupos para coincubación con Sal y 7 grupos para coincubación con PBS como control. Para el grupo tratado con sal, añadir 100 μL de sobrenadante y 0,1 μL de 20 μM de sal por muestra. Para el grupo de control, añadir 100 μL de sobrenadante y 0,1 μL de PBS por muestra.
  3. Incubar cada muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego incubar a 37 °C, 42 °C, 47 °C, 52 °C, 57 °C, 62 °C y 67 °C durante 3 minutos utilizando un instrumento de control de temperatura de calentamiento de metal.
  4. Centrifugar las muestras del paso 4.3 a 10.304 × g durante 20 min a 4 °C y recoger el sobrenadante con una pipeta.
  5. Mida la concentración total de proteínas del sobrenadante a partir del paso 4.4 utilizando un kit de ensayo de concentración de proteínas BCA, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
  6. Prepare el gel de separación al 10% con un kit de preparación rápida de gel PAGE, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
  7. Cargue 3 μL de marcador de proteína de color previamente teñido y 14 μL de muestras en los pocillos del gel de separación (cantidad final de proteína por pocillo: 20 μg).
  8. Ejecute el gel con tampón de electroforesis durante 1 h a 80-100 mV para obtener proteínas separadas.
  9. Transfiera las proteínas del paso 4.8 a una membrana de PVDF utilizando una solución de transferencia rápida de membrana y una estructura sándwich (algodón-papel de filtro-membrana de PVDF-gel de proteínas-papel de filtro de algodón) a 400 mA durante 30 min.
  10. Bloquee las membranas de PVDF del paso 4.9 con una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1-2 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare la solución de BSA al 5% disolviendo 5 mg de polvo de BSA en 100 ml de solución de TBST que contenga 100 ml de tampón TBS y 0,05% de Tween 20.
  11. Incubar las membranas de PVDF del paso 4.10 con 5 mL de anticuerpo primario diluido a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Diluya el anticuerpo primario en la solución BSA (proporción 1:1000).
  12. Lave las membranas de PVDF tres veces con TBST durante 5 minutos cada una para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.
  13. Incubar las membranas del paso 4.12 con anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante diluido (HRP) durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador de decoloración.
    NOTA: Diluir el anticuerpo secundario acoplado a HRP en una solución de BSA (proporción 1:10.000).
  14. Lave las membranas tres veces con TBST durante 5 minutos cada una para eliminar el anticuerpo secundario residual.
  15. Cubra las membranas del paso 4.14 con un revelador de quimioluminiscencia ECL y, a continuación, obtenga una imagen de la señal de la proteína objetivo mediante un sistema de imágenes.
    NOTA: Realice este paso en la oscuridad para evitar el apagado de la fluorescencia.
  16. Analice y cuantifique el valor de gris de las proteínas diana utilizando el software ImageJ (véase T able of Materials).

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Resultados

Las curvas estándar para ATP, ADP y AMP detectadas por HPLC fueron Y = 7006.5X - 222.99, Y = 5217.3X - 17.796 e Y = 9280.1X + 22.749, respectivamente (Figura 1A-C). Los contenidos de nucleótidos medidos en cada grupo por HPLC se calcularon utilizando las curvas estándar (Figura 1D-I). Se encontró que CoCl2 redujo significativamente los niveles de ATP y ADP en las células HT22 en compa...

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Discusión

Las mitocondrias son orgánulos clave implicados en la prevención terapéutica del HHBI 23,24,25. Estudios previos del grupo han confirmado que Sal regula la expresión de las proteínas AMPK, Sirt1 y HIF-1α, mejorando la función mitocondrial neuronal y protegiendo contra el HHBI21,24. Sin embargo, el efecto directo de la sal sobre los nucle...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274207 y 82474185), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2024NSFSC1845), la Fundación de Ciencias para Jóvenes del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2023NSFSC1776), el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de Ningxia (2023BEG02012), el Proyecto de Apoyo al Talento Juvenil de la Asociación China de Medicina China para 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) y el Xinglin Scholar Research Proyecto de Promoción de la Universidad de Chengdu de TCM (XKTD2022013 y QJJJ2024027).

CONTRIBUCIÓN DEL AUTOR:
Xiaobo Wang, Yating Zhang, Ya Hou, Rui Li y Xianli Meng concibieron este proyecto. Yating Zhang, Ya Hou y Tingting Kuang realizaron los experimentos y analizaron los datos. Yating Zhang y Hong Jiang escribieron el manuscrito. Xiaobo Wang y Xianli Meng revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloAladdinA104440
0.22 µ m membrana acuosaJintengJTMF0445
0,22 µ membrana de filtro microporoso tipo agujaJintengJTSFM013001
0.45 µ membrana orgánicaJintengJTMF0448
Agilent OpenLab software   Agilentversión 2.x
anticuerpo-AMPK&alfa;Tecnología de señalización celular#2532
Anticuerpo-HIF-1 y alfa;Tecnología de señalización celular#41560
Anticuerpo-p-AMPK&alfa;Tecnología de señalización celular#50081
Tecnología de señalización celularde anticuerpos-Sirt1#2028
Tecnología de señalización celularde anticuerpos-β-actina#4970
Kit de ensayo de concentración de proteínas BCABoster Biological Technology17E17B46
Albúmina sérica bovinaCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW127-02
Inhibidor de la fosfatasa de amplio espectro (100×)Boster Biological TechnologyAR1183
Columna cromatográficaAgilentSB-C18
CoCl2Sigma15862
Agitador de decoloraciónKylin-BellTS-2
DorsomorfinaMedChemExpress (MCE)HY-13418A
Águila de Dulbecco modificada medioGibco8121587
Tampón de electroforesisNCM Biotech20230801
Suero fetal bovinoGibco2166090RP
Cabra Anti-conejo IgG H& L (TRITC)ZenBioScience Co., Ltd.
Software GraphPad PrismSoftware GraphPad, LLCVersión 9.0.0
Cromatografía líquida de alta resoluciónAgilent1260 Infinity II Prime 
centrífuga refrigerada de alta velocidadThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
HRP conjugado affinipure cabra anti-conejo IgG(H+L)Boster Biological Technology Co., Ltd.Células BA1054
HT22Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd.JNO-02001
Kit de quimioluminiscencia ECL hipersensibleNCM BiotechP10300
Image J softwareInstitutos Nacionales de Saludv1.8.0
Instrumento de control de temperatura de calentamiento de metalBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.HG221-X3
metanolAladdinM116118
nucleótidos (ATP, ADP y AMP)Beijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd.BC5114
PAGE kit de preparación rápida de gelBiosharpPL566B-5
Penicilina-estreptomicinaNCM BiotechC125C5
Solución salina tamponada con fosfato (1×)Gibco8120485
Marcador de proteína de color preteñido (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Tampón de carga de proteínas (5x)Boster Biological TechnologyAR1112
PVDF (0.45 μ m)Cywin Innovation (Pekín) Biotechnology Co., Ltd.SW120-01
Solución de transferencia rápida de membranaCywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
Lisado de RIPABoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.RFS-H0400191102
tampón TBSNCM Biotech23HA0102
Tampón transmembranaNCM Biotech23CA2000
Tripsina (0.25%, 1×)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.
Aparato ultrasónico de disrupción celularNingbo Xinyi equipo ultrasónico Co., Ltd.JY92-IIDN
Sistema de imagen VisionworksAnalytik JenaUVP ChemStudio
Mezclador de vórticeKylin-BellXW-80A
511202Kit de ensayo de contenido de PM12012

Referencias

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