Artículo de método

Preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y tinción de moléculas intracelulares para análisis citométrico de flujo

DOI:

10.3791/66945

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26 de julio de 2024

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1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos protocolos para la preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células epiteliales tímicas (TEC) desempeñan un papel esencial en la promoción del desarrollo y la selección del repertorio de células T. Los TEC corticales (cTEC) en la corteza tímica inducen el desarrollo temprano de células T y la selección positiva de timocitos corticales. Por el contrario, los TEC medulares (mTEC) en la médula tímica atraen timocitos seleccionados positivamente de la corteza y establecen autotolerancia en las células T. Una variedad de moléculas, incluidas DLL4 y beta5t expresadas en cTEC, así como Aire y CCL21 expresadas en mTEC, contribuyen a la función del timo que apoya el desarrollo y la selección de células T. El análisis por citometría de flujo de moléculas funcionalmente relevantes en cTECs y mTECs es útil para mejorar nuestra comprensión de la biología de las TEC, a pesar de que los métodos actuales para la preparación de suspensiones unicelulares de TECs solo pueden recuperar una pequeña fracción de TECs (aproximadamente el 1% para las cTECs y aproximadamente el 10% para las mTEC) del timo de ratón adulto joven. Debido a que muchas de estas moléculas funcionalmente relevantes en las TEC se localizan dentro de las células, describimos nuestros protocolos para la preparación de la suspensión unicelular de TEC de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El timo es un órgano epitelial mesenquimal que promueve el desarrollo y la selección del repertorio de linfocitos T. En los microambientes corticales y medulares dentro del timo, las células epiteliales tímicas (TEC) desempeñan un papel crucial en la dirección del desarrollo y la selección de las células T. Es bien aceptado que los TEC corticales (cTEC) en la corteza tímica contribuyen principalmente a la inducción del desarrollo temprano de las células T y a la selección positiva de los timocitos que expresan el receptor de antígeno (TCR) de las células T recién generados. Por el contrario, los TEC medulares (mTEC) en la médula tímica son esenciales para la atracción de timocitos seleccionados positivamente de la corteza y el establecimiento de la autotolerancia central mediante la eliminación de los linfocitos T autorreactivos y la generación de linfocitos T reguladores1,2. Estas funciones de las TEC en el apoyo al desarrollo y la selección de las células T están mediadas por una variedad de moléculas expresadas en cTEC y mTEC.

Estos incluyen el ligando Delta-like 4 (DLL4), importante para la especificación del linaje de células T de los progenitores linfoides)3,4, beta5t (también conocido como Psmb11, importante para la selección positiva de linfocitos T CD8)5,6, y Prss16 (también conocido como serina proteasa específica del timo, o TSSP, importante para la selección positiva de linfocitos T CD4)7,8 expresado en cTECs, y Regulador autoinmune (Aire, importante para la expresión promiscua de autogenes)9,10, Fez family zinc finger 2 (Fezf2, importante para la expresión promiscua de autogenes independientes de Aire y la generación de células de penacho tímico)11,12,13,14y el ligando de quimiocina 21 del motivo C-C (CCL21, importante para la migración medular y la acumulación de timocitos seleccionados positivamente)14,15,16 expresado en mTEC. La citometría de flujo proporciona un medio para detectar cuantitativamente estas moléculas funcionalmente significativas en las TEC, lo que facilita la evaluación tanto del desarrollo como de la función de las cTEC y las mTEC. Dado que muchas de las moléculas de las TEC se expresan principalmente dentro de las células, como en el citoplasma (por ejemplo, el componente beta5t del proteasoma) y el núcleo (por ejemplo, el regulador transcripcional Aire), es ventajoso analizar cuantitativamente las moléculas intracelulares en las cTEC y las mTEC mediante citometría de flujo.

Los TEC son raros en el timo. Un ratón hembra a las 5 semanas de edad tiene aproximadamente 1 × 106 cTECs y aproximadamente 2,5 × 106 mTEC, mientras que la corteza tímica contiene aproximadamente 3 × 108 timocitos CD4+CD8+ y la médula tímica contiene aproximadamente 5 × 107 timocitos CD4+CD8- y CD4-CD8+17. Por lo tanto, la gran mayoría (>99%) de las células en el timo son células hematopoyéticas, incluidos los timocitos, en lugar de TEC, en ratones adultos jóvenes. Además, los TEC están estrechamente asociados con las células vecinas (por ejemplo, los timocitos) y los componentes extracelulares arquitectónicos (por ejemplo, el colágeno) dentro del timo, por lo que la liberación de los TEC en suspensión celular requiere la digestión proteasa del timo. Los métodos convencionales para la digestión enzimática producen solo una pequeña fracción de TEC; aproximadamente el 1% (1 × 104) y el 10% (2 × 105) para cTECs y mTEC, respectivamente, de thymus de ratón de 5 semanas de edad17,18,19. La baja eficiencia de la liberación de TEC del timo se debe probablemente a la susceptibilidad de los TECs a las enzimas proteolíticas y al estrés mecánico y a la estrecha asociación de los TECs con las células vecinas, particularmente entre los cTECs y los timocitos CD4+CD8+20. A este respecto, los resultados del análisis de células individuales de TEC de ratón, incluido el análisis de citometría de flujo y el análisis de secuenciación de ARN de células individuales, basados en los métodos actuales de preparación celular mediada por la digestión enzimática, son representativos de solo una pequeña parte de los TEC y, por lo tanto, están lejos de ser exhaustivos. Sin embargo, a pesar de estas limitaciones en la recuperación enzimática de TEC, el análisis por citometría de flujo de TEC de ratón en suspensión unicelular sigue siendo útil para el análisis cuantitativo de moléculas funcionalmente relevantes en cTEC y mTEC. En suspensión celular, las TEC se han definido como células positivas para la molécula de superficie epitelial EpCAM (CD326) y negativas para la molécula de superficie hematopoyética CD45. Dentro de los TEC EpCAM+CD45-, los niveles de expresión en la superficie celular de las moléculas Ly51 (también conocidas como BP-1 y CD249) y la capacidad de unión a la aglutinina I (UEA1) de Ulex Europaeus (UEA1) (principalmente se unen a glicoproteínas y glicolípidos que contienen fucosa ligada a α) para marcar fenotípicamente los cTEC (Ly51alto, UEA1bajo) y mTEC (Ly51bajo, UEA1alto;). En este trabajo describimos nuestros protocolos experimentales para la preparación convencional de la suspensión unicelular de TECs de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo, centrándonos en el análisis cuantitativo de las moléculas intracelulares beta5t, CCL21 y Aire en TECs de ratón recién preparados.

Protocolo

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Todos los experimentos con ratones se realizaron bajo la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Cáncer (ASP21-431, ASP21-432 y EIB-076-3).

1. Preparación de la suspensión de células del timo

NOTA: La ontogenia del ratón afecta la eficiencia de la liberación enzimática de TECs del timo. A continuación se describen tres métodos en función de la edad del ratón.

  1. Para ratones posnatales de más de 3 semanas de edad
    1. Cosecha el timo (dos lóbulos del timo) de un ratón. Coloque el timo en 5 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM HEPES en un plato de plástico de 60 mm con hielo.
    2. Extraiga la sangre, los tejidos que no sean del timo y la grasa con pinzas curvas de punta fina bajo un microscopio de disección. Corta el timo en trozos pequeños (de aproximadamente 1-2 mm de tamaño) con unas tijeras de disección.
    3. Transfiera los trozos de timo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 3 mL de 1 mg/mL de colagenasa/dispasa, y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de suero fetal bovino (FBS). Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 20 min.
    4. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Incubar durante otros 20 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    5. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Incubar durante otros 10 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    6. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Agregue 5 mL de EDTA 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS.
    7. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min.
    8. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de tampón FACS (1x HBSS que contiene 1% de albúmina sérica bovina [BSA] y 0,1% NaN3).
    9. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  2. Para ratones neonatos de entre 1 y 2 semanas de edad
    1. Realice el paso 1.1.1.
    2. Extraiga la sangre y los tejidos que no sean del timo con pinzas de disección bajo un microscopio de disección. Transfiera el timo a un tubo de plástico de 1,5 ml que contenga 200 μl de RPMI1640 con HEPES de 10 mM y corte el timo en trozos pequeños (de aproximadamente 1-2 mm de tamaño) con unas tijeras de disección.
    3. Deje que los fragmentos de timo se depositen en el fondo del tubo, luego retire suavemente la suspensión con una micropipeta de 200 μL.
    4. Transfiera los trozos de timo a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 5 mL que contenga 2 mL de 0,5 mg/mL de colagenasa/dispasa y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 10 min.
    5. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL y, a continuación, con una micropipeta de 1 mL provista de una punta de plástico para una mayor homogeneización.
    6. Agregue 2 mL de EDTA de 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un tubo cónico de 50 mL. Añadir 16 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    7. Centrifugar la suspensión celular 350 × g a 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de tampón FACS.
    8. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  3. Para ratones embrionarios y ratones neonatos de hasta 1 semana de edad
    1. Cosecha el timo (dos lóbulos del timo) de un ratón. Coloque el timo en un plato de plástico de 60 mm y extraiga la sangre, los tejidos que no sean timo y la grasa con pinzas curvas de punta fina bajo un microscopio de disección.
    2. Coloque el timo en 0,2 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM HEPES en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Deseche el líquido con una micropipeta de 200 μL.
    3. Añadir 0,5 mL de 0,5 mg/mL de colagenasa/dispasa y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 10 min. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico.
    4. Añadir 0,5 mL de EDTA 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Añadir 9 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 1-3 mL de tampón FACS.
    6. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  4. Método alternativo: Digestión Liberasa
    1. Realice los pasos 1.1.1 y 1.1.2.
    2. Deje que los fragmentos de timo se depositen en el fondo del tubo; luego retire suavemente la suspensión con una micropipeta de 200 μL. Transfiera los trozos de timo a un tubo de 5 mL que contenga 1 mL de 0,5 U/mL de Liberasa y 1 U/mL de DNasa en RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 15 min.
    3. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico. Incubar durante otros 15 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    4. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico. Agregue 1 mL de 5 mM de EDTA en 1x HBSS que contenga 1% de FBS.
    5. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Añadir 18 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    6. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g, 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 10 mL de tampón FACS (1x HBSS que contiene 1% de BSA y 0,1% NaN3).
    7. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.

2. Tinción de anticuerpos de las células del timo

  1. Coloque 16 × 106 celdas en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Centrifugar las células a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  2. Añadir 10 μL de concentración de trabajo de anticuerpo monoclonal anti-receptor Fc (mAb, clon 2.4G2) en el tampón FACS para bloquear la unión inespecífica de la tinción de IgG al receptor Fc de la superficie celular. Incubar a 4 °C durante 5 min.
  3. Añadir 40 μL de cada una de las concentraciones de trabajo de mAb anti-CD45 (específico de células hematopoyéticas; p. ej., marcado con BV421), mAb anti-EpCAM (específico de células epiteliales; p. ej., marcado con PE-Cy7), mAb anti-Ly51 (detector de cTEC; p. ej., marcado con AF647) y aglutinina I de Ulex europaeus (UEA-1) (detector de mTEC; p. ej., marcado con AF594) en el tampón FACS. Paralelamente, prepare tubos para células teñidas de un solo color y células sin tinción para configurar un citómetro de flujo.
  4. Incubar a 4 °C durante 45 min. Mezclar bien cada 10 min. Añadir 2 mL de tampón FACS.
  5. Centrifugar las celdas a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  6. Agregue 1 μL de Ghost Dye Violet 510 (para distinguir las células viables de las células muertas en el análisis de citometría de flujo de células fijas y permeabilizadas). Utilice el reactivo Ghost Dye sin diluir; mezclar bien. Incubar a 4 °C durante 30 min; Mezclar bien cada 10 min.
  7. Agregue 2 mL de tampón FACS. Celdas de centrífuga 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  8. Fije las células añadiendo 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 2% en PBS e incubando a temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Añadir 3,5 mL de PBS al tubo y centrifugar las celdas 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  10. Permeabilizar las células añadiendo 1 mL de tampón de fijación/permeabilización intracelular e incubando a 4 °C durante 20 min.
  11. Centrifugar las células 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  12. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  13. Agregue 100 μL de cada una de las concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-beta5t o del anticuerpo anti-CCL21, o 40 μL de concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-Aire (por ejemplo, marcado con AF488), en 1x tampón de permeabilización, mezcle bien e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.
  14. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  15. Repita el paso 2.14.
  16. Añadir 100 μL de concentraciones de trabajo de IgG anti-conejo (por ejemplo, marcado con AF555) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  17. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  18. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS y mezcle bien.
  19. Almacene las células en la oscuridad a 4 °C hasta el análisis por citometría de flujo.
  20. Filtre las celdas a través de una malla de nailon de 60 μm antes del análisis de citometría de flujo.

Resultados

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El análisis requiere un citómetro de flujo que permita la detección de al menos seis canales de fluorescencia (para CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye y beta5t, CCL21 y/o Aire), así como parámetros de dispersión frontal y lateral. Los perfiles representativos de citometría de flujo de células de timo digeridas por colagenasa/dispasa de ratones de 0 días de edad y ratones de 2 semanas de edad se muestran en Figura 1 y Figura 2, respectivamente. En ambas figuras, el diagrama de puntos del Panel A muestra la intensidad de la dispersión directa (FSC) y la intensidad de fluorescencia Ghost Dye Violet 510 de las señales de partículas totales. Más del 90% de las señales de partículas representan células viables, a juzgar por la tinción negativa del reactivo Ghost Dye y por el tamaño de la célula reflectante de dispersión directa. El panel B muestra las señales de fluorescencia de la superficie celular de las células de timo viables para CD45, una molécula expresada por las células hematopoyéticas, y EpCAM, una molécula expresada por las células epiteliales. Una población celular pequeña pero distintiva es CD45-EpCAM+, por lo que representa a los TEC.

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Figura 1: Perfiles citométricos de flujo representativos de células de timo digeridas con colagenasa/dispasa de ratones de tipo salvaje C57BL/6 de 0 días de edad. (A) Intensidad de dispersión directa e intensidad de fluorescencia Ghost Dye Violet 510 de las señales de partículas totales. El recuadro rojo indica las señales de las células viables. (B) Señales de fluorescencia de células viables (recuadro rojo en el panel A) para CD45 y EpCAM. El recuadro rojo indica los TEC CD45-EpCAM+. (C) Las señales de tinción de la superficie celular de Ly51 y UEA1 en TEC (recuadro rojo en el panel B) revelan dos poblaciones principales: célulasbajas de Ly51con alto contenido de UEA1 enriquecidas con cTEC y célulasLy51 con alto contenidode UEA1 enriquecidas con mTEC. (D-F) Detección de (D) beta5t, (E) CCL21 y (F) Aire en cTEC (paneles superiores) y mTEC (paneles inferiores) según se define en el panel C. Los histogramas grises muestran perfiles de control teñidos solo con anticuerpo secundario (D,E) y (F) teñidos con células de ratones con deficiencia de Aire. Abreviaturas: FSC = dispersión directa; TECs = Células epiteliales tímicas; cTECs = TECs corticales; mTECs = TECs medulares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Perfiles representativos de citometría de flujo de células de timo digeridas por colagenasa/dispasa de ratones de 2 semanas de edad de tipo salvaje C57BL/6-fondo. (A) Intensidad de dispersión directa e intensidad de fluorescencia Ghost Dye Violet 510 de las señales de partículas totales. El recuadro rojo indica las señales de las células viables. (B) Señales de fluorescencia de células viables (recuadro rojo en el panel A) para CD45 y EpCAM. El recuadro rojo indica los TEC CD45-EpCAM+. (C) Las señales de tinción de la superficie celular de Ly51 y UEA1 en TEC (recuadro rojo en el panel B) revelan dos poblaciones principales: célulasbajas de Ly51con alto contenido de UEA1 enriquecidas con cTEC y célulasLy51 con alto contenidode UEA1 enriquecidas con mTEC. (D-F) Detección de (D) beta5t, (E) CCL21 y (F) Aire en cTEC (paneles superiores) y mTEC (paneles inferiores) según se define en el panel C. Los histogramas grises muestran perfiles de control teñidos solo con anticuerpo secundario (D,E) y teñidos con IgG emparejada con isotipo marcado con (F) FITC. Abreviaturas: FSC = dispersión directa; TECs = Células epiteliales tímicas; cTECs = TECs corticales; mTECs = TECs medulares; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ly51 y las señales de tinción de la superficie celular UEA1 como se muestran en el Panel C revelan dos poblaciones principales en TEC: una población relativamente alta en Ly51 y baja en UEA1 enriquecida con cTEC, y otra relativamente baja en Ly51 y alta en UEA1 enriquecida con mTECCs21,22,23,24,25. Durante las etapas embrionarias y neonatales, incluyendo los 0 días de vida, la frecuencia de cTECs es mayor que la de mTEC. En las etapas postnatales, la frecuencia de mTECs domina principalmente porque la eficiencia de la liberación de cTEC del timo se vuelve extremadamente baja (aproximadamente el 1% de los cTECs y el 10% de los mTECs pueden recuperarse en una suspensión de una sola célula)17.

La fijación y permeabilización de las células permite la detección de moléculas intracelulares dentro de los TEC. El panel D muestra la expresión de beta5t detectada en la mayoría de los cTEC pero no en los mTEC; el panel E muestra la detección de CCL21 en una fracción de mTECs pero no en cTEC, y el panel F muestra Aire expresado en una subpoblación de mTECs.

Se pueden encontrar perfiles de citometría de flujo adicionales de moléculas intracelulares en TEC de ratón en artículos publicados; para beta5t6,20, CCL2114,16,26, y Aire27,28, así como para moléculas intracelulares adicionales, incluida la queratina22,29 y Fezf211,30.

Discusión

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La colagenasa, con o sin Dispasa, se usa ampliamente para digerir el timo de ratón para preparar TEC 4,5,9,18,21. La liberasa, que contiene una mezcla de proteasas, incluida la colagenasa, también se usa para digerir el timo para preparar los TEC17,22. El uso de colagenasa y liberasa proporciona rendimientos y calidad esencialmente equivalentes de cTEC y mTEC del timo de ratón, aunque pueden aparecer diferencias menores según el lote de productos de las enzimas. La tripsina también se usa para la digestión eficiente del timo 21,23, aunque se ha demostrado que muchas moléculas de la superficie celular, incluidas EpCAM y CD80 expresadas por TEC, son susceptibles a la digestión de tripsina21. Para la digestión enzimática del timo, a menudo se agrega ADNasa para reducir la viscosidad debido a la liberación de ADN de las células dañadas17,21.

La digestión enzimática del timo es esencial para la liberación de los TEC del timo. El timo debe digerirse lo suficiente hasta que los fragmentos de tejido se vuelvan invisibles y la suspensión celular parezca homogénea. Sin embargo, la digestión no debe dejarse demasiado tiempo porque el tratamiento enzimático excesivo daña las células y disminuye la viabilidad celular. En cada experimento, es importante prestar especial atención al período de incubación y a la fuerza de pipeteo durante la digestión del timo. También es importante tener en cuenta que la tecnología actual de digestión enzimática permite la liberación de solo una pequeña fracción de TEC, como se detalla en la Introducción y como se informó anteriormente 17,18,19.

Debido a que los TEC son raros en la suspensión total de células del timo, el análisis de citometría de flujo de los TEC que utilizan la suspensión total de células del timo requiere la tinción de muchas células, generalmente de 8 × 106 a 16 × 106 células por medición.

Los TEC derivados de células del timo digeridas por enzimas pueden enriquecerse utilizando perlas magnéticas anti-CD4522 y/o centrifugación en gradiente de densidadPercoll 31. Estos procedimientos de enriquecimiento ahorran tiempo, especialmente cuando los TEC se purifican posteriormente sobre un clasificador de células de citometría de flujo. También debe tenerse en cuenta que el enriquecimiento anti-CD45 eliminaría una subpoblación de TEC que están estrechamente asociados con timocitos que expresan CD4520 y la centrifugación de Percoll podría eliminar una subpoblación inesperadamente densa de TEC.

Con respecto a la fijación de TEC, se sabe que el tratamiento con PFA encoge las células y reduce la intensidad de dispersión directa en el análisis de citometría de flujo. Un pipeteo suave de las células inmediatamente después de la adición de PFA al 2% y la posterior adición de PBS puede ayudar a prevenir la contracción celular excesiva.

Para el análisis de citometría de flujo, dada la aparición poco frecuente de TEC dentro del timo, su delineación requiere un enfoque distinto en comparación con los timocitos o los esplenocitos. La clasificación inicial se basa en la utilización de CD45, un panmarcador hematopoyético omnipresente en timocitos y otras células hematopoyéticas, incluidas las células dendríticas y los macrófagos. Por el contrario, los TEC, al ser de origen no hematopoyético, carecen de expresión de CD45. En cambio, los TEC expresan EpCAM en su superficie, lo que permite una estrategia de activación directa de CD45 negativo y EpCAM positivo para discernir los TEC. En nuestro análisis de citometría de flujo, comenzamos definiendo esta población y posteriormente aseguramos una escala adecuada de los parámetros de dispersión directa y lateral, dada la discrepancia de tamaño sustancial entre los TEC y los timocitos, y dado el gran tamaño y la alta autofluorescencia de los TEC.

Posteriormente, la atención se dirige hacia la evaluación de los marcadores cTEC y mTEC dentro de la población positiva para EPCAM CD45 negativos. Debido al diminuto tamaño de esta población, este paso se vuelve imperativo para compensar los cTEC y mTEC. El examen de un panel totalmente teñido (por ejemplo, el marcador de cTEC Ly51 y el marcador de mTEC UEA-1 junto con CD45 y EpCAM que definen TEC) garantiza aún más la adecuación de la escala de dispersión. Durante la configuración de la citometría de flujo, nuestro objetivo principal gira en torno a discernir las poblaciones positivas y negativas para cada anticuerpo.

En la co-tinción de Aire, beta5t y CCL21, se identifican distintas poblaciones dentro de los subconjuntos de TEC. Dada la expresión selectiva de Aire por mTEC, nos centramos en la tinción de cuatro colores de células CD45 negativas / EPCAM positivas / UEA-1 positivas / Ly51 negativas. Aquí, las células UEA-1 positivas se utilizan para establecer el control negativo de Aire, lo que facilita la identificación clara de las células positivas para Aire. Se adopta un enfoque similar para CCL21, que se expresa dentro de los mTEC. Por el contrario, para beta5t, expresada exclusivamente por cTEC, se aplica una estrategia de compuerta comparable, con énfasis en las células positivas para Ly51 dentro de la tinción de cuatro colores, para determinar los niveles de fondo para beta5t. El análisis posterior de muestras teñidas con anti-beta5t facilita la identificación de una población positiva.

El anticuerpo anti-beta5t y el anticuerpo anti-CCL21 son anticuerpos de conejo, por lo que estos anticuerpos no deben mezclarse sin un marcado previo de fluorescencia. Las concentraciones de trabajo de anticuerpos deben predeterminarse realizando análisis de citometría de flujo de células de control (por ejemplo, TEC de ratones de tipo salvaje y knockout) teñidas con diluciones seriadas de anticuerpos.

En el análisis de citometría de flujo, los cTEC y mTEC se definen con frecuencia por la expresión de la superficie celular de Ly51 o CD205 para cTEC y de UEA1 y CD80 para mTEC. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los cTEC y mTEC deben definirse eventualmente por su localización microanatómica en el timo. En el timo embrionario, la evidencia emergente ha sugerido que la expresión de Ly51 y CD205 no se limita a los cTEC, sino que se extiende a otras poblaciones de TEC, incluidos los progenitores bipotentes de cTEC / mTEC y los mTEC inmaduros32,33. Además, la expresión de Ly51 en los cTECs sigue siendo baja durante la embriogénesis y el período perinatal en comparación con el período postnatal33, como también se muestra en la Figura 1 y la Figura 2.

En conclusión, el análisis de citometría de flujo de la suspensión unicelular liberada enzimáticamente de TEC ofrece una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de TEC y sus subpoblaciones a resolución unicelular, a pesar de la eficiencia limitada de la liberación de TEC. En particular, el análisis de citometría de flujo de moléculas intracelulares en suspensión de TEC unicelular es útil para estudiar la expresión de una variedad de moléculas importantes para el desarrollo y la función de los TEC y sus subpoblaciones.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Izumi Ohigashi por leer el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros ZIA BC 011806 de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Centro de Investigación del Cáncer.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colagenasa/Dispasa Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Factor de transcripción Juego de tampones de tincióneBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anticuerpo monoclonal CD45 anti-ratón, clon 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-ratón anticuerpo monoclonal Ly51, clon 6C3BioLegend108312
anticuerpo monoclonal PE/Cy7 anti-ratón EpCAM / CD326, clon G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus aglutinina I (UEA1)Vector LaboratoriosDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anticuerpo monoclonal anti-ratón Aire, clon 5H12eBioscience53-5934-82
anti-ratón Psmb11/beta5t anticuerpo monoclonal de conejo, clon CPTC-PSMB11 (ratón)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (ratón)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
anti-ratón CCL21/exodus 2 anticuerpo policlonal de conejoBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-conejo IgG de cadena pesada cabra recombinante anticuerpoInvitrogenA27039
Anti-Ratón CD32/CD16 – Purificado (anticuerpo de bloque Fc)Leinco TechnologiesC247
Malla de nailon 60 micrasSuministro de componentesW31436
Equipo
ThermomixerEppendorfBloque
Celómetro Auto 2000 Contador de viabilidad celularNexcelomRecuento
viables LSRFortessa Analizador de célulasBD BiosciencesCitómetrode flujo Cinco láseres (355, 408, 488, 595 y 637 nm)
Software FACSDiva versión 9.0.1BD BiosciencesAnálisis
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesAnálisis de datos de citometría
AnticuerpoTasa de dilución (concentración de trabajo)Tampón
Anti-Mouse CD32/CD16 – Purificado (anticuerpo de bloqueo Fc)1:40Tampón
BV421 anti-ratón Anticuerpo monoclonal CD451:25Tampón
PE/Cy7 anti-ratón Anticuerpo monoclonal EpCAM/CD3261:100Tampón
Alexa Fluor 647 anti-ratón Anticuerpo monoclonal Ly511:100Tampón
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutinina I (UEA1)1:400Tampón
Anti-ratón CCL21/exodus 2 anticuerpo policlonal de conejo1:2001x Tampón
Anti-ratón Psmb11/beta5t anticuerpo monoclonal de conejo, clon CPTC-PSMB11(ratón)-11:10001x Tampón
Alexa Fluor 555 anti-conejo IgG anticuerpo recombinante de cabra de cadena pesada1:4001x Tampón
TampónPropósito
RPMI1640 que contiene 10 mM HEPES Para la preparación
de células RPMI1640 que contienen un 2% de FBS Para lacélulas
tampón FACS (1x HBSS que contiene un 1% de BSA  y azida sódica al 0,1%)Para la preparación celular y la tinción de anticuerpos
1 mg/ml de colagenasa/dispasa y 1U/ml de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS Para ladigestión enzimática
2% de PFA en PBSPara la
Tampón de fijación/permeabilización (1 parte de concentrado de fijación/permeabilización con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización)Para la fijación celular
1x Tampón de permeabilización (1 parte de concentrado 10X con 9 partes de agua destilada)Para tinción de anticuerpos intercelulares 
de calorde célulasde citometría de flujode flujode diluciónFACSFACSFACSFACSFACSde permeabilizaciónde permeabilizaciónde permeabilización preparación de , ,fijación celular

Referencias

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