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Artículo de método

Preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y tinción de moléculas intracelulares para análisis citométrico de flujo

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DOI:

10.3791/66945

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26 de julio de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos protocolos para la preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Resumen

Las células epiteliales tímicas (TEC) desempeñan un papel esencial en la promoción del desarrollo y la selección del repertorio de células T. Los TEC corticales (cTEC) en la corteza tímica inducen el desarrollo temprano de células T y la selección positiva de timocitos corticales. Por el contrario, los TEC medulares (mTEC) en la médula tímica atraen timocitos seleccionados positivamente de la corteza y establecen autotolerancia en las células T. Una variedad de moléculas, incluidas DLL4 y beta5t expresadas en cTEC, así como Aire y CCL21 expresadas en mTEC, contribuyen a la función del timo que apoya el desarrollo y la selección de células T. El análisis por citometría de flujo de moléculas funcionalmente relevantes en cTECs y mTECs es útil para mejorar nuestra comprensión de la biología de las TEC, a pesar de que los métodos actuales para la preparación de suspensiones unicelulares de TECs solo pueden recuperar una pequeña fracción de TECs (aproximadamente el 1% para las cTECs y aproximadamente el 10% para las mTEC) del timo de ratón adulto joven. Debido a que muchas de estas moléculas funcionalmente relevantes en las TEC se localizan dentro de las células, describimos nuestros protocolos para la preparación de la suspensión unicelular de TEC de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Introducción

El timo es un órgano epitelial mesenquimal que promueve el desarrollo y la selección del repertorio de linfocitos T. En los microambientes corticales y medulares dentro del timo, las células epiteliales tímicas (TEC) desempeñan un papel crucial en la dirección del desarrollo y la selección de las células T. Es bien aceptado que los TEC corticales (cTEC) en la corteza tímica contribuyen principalmente a la inducción del desarrollo temprano de las células T y a la selección positiva de los timocitos que expresan el receptor de antígeno (TCR) de las células T recién generados. Por el contrario, los TEC medulares (mTEC) en la médula tímica son esenciales para la atracción de timocitos seleccionados positivamente de la corteza y el establecimiento de la autotolerancia central mediante la eliminación de los linfocitos T autorreactivos y la generación de linfocitos T reguladores1,2. Estas funciones de las TEC en el apoyo al desarrollo y la selección de las células T están mediadas por una variedad de moléculas expresadas en cTEC y mTEC.

Estos incluyen el ligando Delta-like 4 (DLL4), importante para la especificación del linaje de células T de los progenitores linfoides)3,4, beta5t (también conocido como Psmb11, importante para la selección positiva de linfocitos T CD8)5,6, y Prss16 (también conocido como serina proteasa específica del timo, o TSSP, importante para la selección positiva de linfocitos T CD4)7,8 expresado en cTECs, y Regulador autoinmune (Aire, importante para la expresión promiscua de autogenes)9,10, Fez family zinc finger 2 (Fezf2, importante para la expresión promiscua de autogenes independientes de Aire y la generación de células de penacho tímico)11,12,13,14y el ligando de quimiocina 21 del motivo C-C (CCL21, importante para la migración medular y la acumulación de timocitos seleccionados positivamente)14,15,16 expresado en mTEC. La citometría de flujo proporciona un medio para detectar cuantitativamente estas moléculas funcionalmente significativas en las TEC, lo que facilita la evaluación tanto del desarrollo como de la función de las cTEC y las mTEC. Dado que muchas de las moléculas de las TEC se expresan principalmente dentro de las células, como en el citoplasma (por ejemplo, el componente beta5t del proteasoma) y el núcleo (por ejemplo, el regulador transcripcional Aire), es ventajoso analizar cuantitativamente las moléculas intracelulares en las cTEC y las mTEC mediante citometría de flujo.

Los TEC son raros en el timo. Un ratón hembra a las 5 semanas de edad tiene aproximadamente 1 × 106 cTECs y aproximadamente 2,5 × 106 mTEC, mientras que la corteza tímica contiene aproximadamente 3 × 108 timocitos CD4+CD8+ y la médula tímica contiene aproximadamente 5 × 107 timocitos CD4+CD8- y CD4-CD8+17. Por lo tanto, la gran mayoría (>99%) de las células en el timo son células hematopoyéticas, incluidos los timocitos, en lugar de TEC, en ratones adultos jóvenes. Además, los TEC están estrechamente asociados con las células vecinas (por ejemplo, los timocitos) y los componentes extracelulares arquitectónicos (por ejemplo, el colágeno) dentro del timo, por lo que la liberación de los TEC en suspensión celular requiere la digestión proteasa del timo. Los métodos convencionales para la digestión enzimática producen solo una pequeña fracción de TEC; aproximadamente el 1% (1 × 104) y el 10% (2 × 105) para cTECs y mTEC, respectivamente, de thymus de ratón de 5 semanas de edad17,18,19. La baja eficiencia de la liberación de TEC del timo se debe probablemente a la susceptibilidad de los TECs a las enzimas proteolíticas y al estrés mecánico y a la estrecha asociación de los TECs con las células vecinas, particularmente entre los cTECs y los timocitos CD4+CD8+20. A este respecto, los resultados del análisis de células individuales de TEC de ratón, incluido el análisis de citometría de flujo y el análisis de secuenciación de ARN de células individuales, basados en los métodos actuales de preparación celular mediada por la digestión enzimática, son representativos de solo una pequeña parte de los TEC y, por lo tanto, están lejos de ser exhaustivos. Sin embargo, a pesar de estas limitaciones en la recuperación enzimática de TEC, el análisis por citometría de flujo de TEC de ratón en suspensión unicelular sigue siendo útil para el análisis cuantitativo de moléculas funcionalmente relevantes en cTEC y mTEC. En suspensión celular, las TEC se han definido como células positivas para la molécula de superficie epitelial EpCAM (CD326) y negativas para la molécula de superficie hematopoyética CD45. Dentro de los TEC EpCAM+CD45-, los niveles de expresión en la superficie celular de las moléculas Ly51 (también conocidas como BP-1 y CD249) y la capacidad de unión a la aglutinina I (UEA1) de Ulex Europaeus (UEA1) (principalmente se unen a glicoproteínas y glicolípidos que contienen fucosa ligada a α) para marcar fenotípicamente los cTEC (Ly51alto, UEA1bajo) y mTEC (Ly51bajo, UEA1alto;). En este trabajo describimos nuestros protocolos experimentales para la preparación convencional de la suspensión unicelular de TECs de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo, centrándonos en el análisis cuantitativo de las moléculas intracelulares beta5t, CCL21 y Aire en TECs de ratón recién preparados.

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Protocolo

Todos los experimentos con ratones se realizaron bajo la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Cáncer (ASP21-431, ASP21-432 y EIB-076-3).

1. Preparación de la suspensión de células del timo

NOTA: La ontogenia del ratón afecta la eficiencia de la liberación enzimática de TECs del timo. A continuación se describen tres métodos en función de la edad del ratón.

  1. Para ratones posnatales de más de 3 semanas de edad
    1. Cosecha el timo (dos lóbulos del timo) de un ratón. Coloque el timo en 5 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM HEPES en un plato de plástico de 60 mm con hielo.
    2. Extraiga la sangre, los tejidos que no sean del timo y la grasa con pinzas curvas de punta fina bajo un microscopio de disección. Corta el timo en trozos pequeños (de aproximadamente 1-2 mm de tamaño) con unas tijeras de disección.
    3. Transfiera los trozos de timo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 3 mL de 1 mg/mL de colagenasa/dispasa, y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de suero fetal bovino (FBS). Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 20 min.
    4. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Incubar durante otros 20 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    5. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Incubar durante otros 10 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    6. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL. Agregue 5 mL de EDTA 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS.
    7. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min.
    8. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de tampón FACS (1x HBSS que contiene 1% de albúmina sérica bovina [BSA] y 0,1% NaN3).
    9. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  2. Para ratones neonatos de entre 1 y 2 semanas de edad
    1. Realice el paso 1.1.1.
    2. Extraiga la sangre y los tejidos que no sean del timo con pinzas de disección bajo un microscopio de disección. Transfiera el timo a un tubo de plástico de 1,5 ml que contenga 200 μl de RPMI1640 con HEPES de 10 mM y corte el timo en trozos pequeños (de aproximadamente 1-2 mm de tamaño) con unas tijeras de disección.
    3. Deje que los fragmentos de timo se depositen en el fondo del tubo, luego retire suavemente la suspensión con una micropipeta de 200 μL.
    4. Transfiera los trozos de timo a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 5 mL que contenga 2 mL de 0,5 mg/mL de colagenasa/dispasa y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 10 min.
    5. Mezclar suavemente con una pipeta de transferencia de plástico de 3 mL y, a continuación, con una micropipeta de 1 mL provista de una punta de plástico para una mayor homogeneización.
    6. Agregue 2 mL de EDTA de 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un tubo cónico de 50 mL. Añadir 16 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    7. Centrifugar la suspensión celular 350 × g a 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de tampón FACS.
    8. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  3. Para ratones embrionarios y ratones neonatos de hasta 1 semana de edad
    1. Cosecha el timo (dos lóbulos del timo) de un ratón. Coloque el timo en un plato de plástico de 60 mm y extraiga la sangre, los tejidos que no sean timo y la grasa con pinzas curvas de punta fina bajo un microscopio de disección.
    2. Coloque el timo en 0,2 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM HEPES en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Deseche el líquido con una micropipeta de 200 μL.
    3. Añadir 0,5 mL de 0,5 mg/mL de colagenasa/dispasa y 1 U/mL de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 10 min. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico.
    4. Añadir 0,5 mL de EDTA 5 mM en 1x HBSS que contenga 1% de FBS. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Añadir 9 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    5. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet celular en 1-3 mL de tampón FACS.
    6. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.
  4. Método alternativo: Digestión Liberasa
    1. Realice los pasos 1.1.1 y 1.1.2.
    2. Deje que los fragmentos de timo se depositen en el fondo del tubo; luego retire suavemente la suspensión con una micropipeta de 200 μL. Transfiera los trozos de timo a un tubo de 5 mL que contenga 1 mL de 0,5 U/mL de Liberasa y 1 U/mL de DNasa en RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES. Incubar en un baño de agua o en un bloque de calor a 37 °C durante 15 min.
    3. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico. Incubar durante otros 15 minutos en caso de que los fragmentos de tejido aún sean visibles.
    4. Mezclar suavemente con una micropipeta de 1 mL con punta de plástico. Agregue 1 mL de 5 mM de EDTA en 1x HBSS que contenga 1% de FBS.
    5. Filtre la suspensión celular a través de una malla de nailon de 60 μm y en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Añadir 18 mL de RPMI1640 que contenga 10 mM de HEPES.
    6. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g, 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 10 mL de tampón FACS (1x HBSS que contiene 1% de BSA y 0,1% NaN3).
    7. Almacene las celdas en hielo y determine el número de celdas usando un contador de celdas.

2. Tinción de anticuerpos de las células del timo

  1. Coloque 16 × 106 celdas en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Centrifugar las células a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  2. Añadir 10 μL de concentración de trabajo de anticuerpo monoclonal anti-receptor Fc (mAb, clon 2.4G2) en el tampón FACS para bloquear la unión inespecífica de la tinción de IgG al receptor Fc de la superficie celular. Incubar a 4 °C durante 5 min.
  3. Añadir 40 μL de cada una de las concentraciones de trabajo de mAb anti-CD45 (específico de células hematopoyéticas; p. ej., marcado con BV421), mAb anti-EpCAM (específico de células epiteliales; p. ej., marcado con PE-Cy7), mAb anti-Ly51 (detector de cTEC; p. ej., marcado con AF647) y aglutinina I de Ulex europaeus (UEA-1) (detector de mTEC; p. ej., marcado con AF594) en el tampón FACS. Paralelamente, prepare tubos para células teñidas de un solo color y células sin tinción para configurar un citómetro de flujo.
  4. Incubar a 4 °C durante 45 min. Mezclar bien cada 10 min. Añadir 2 mL de tampón FACS.
  5. Centrifugar las celdas a 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  6. Agregue 1 μL de Ghost Dye Violet 510 (para distinguir las células viables de las células muertas en el análisis de citometría de flujo de células fijas y permeabilizadas). Utilice el reactivo Ghost Dye sin diluir; mezclar bien. Incubar a 4 °C durante 30 min; Mezclar bien cada 10 min.
  7. Agregue 2 mL de tampón FACS. Celdas de centrífuga 350 × g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
  8. Fije las células añadiendo 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 2% en PBS e incubando a temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Añadir 3,5 mL de PBS al tubo y centrifugar las celdas 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  10. Permeabilizar las células añadiendo 1 mL de tampón de fijación/permeabilización intracelular e incubando a 4 °C durante 20 min.
  11. Centrifugar las células 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  12. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  13. Agregue 100 μL de cada una de las concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-beta5t o del anticuerpo anti-CCL21, o 40 μL de concentraciones de trabajo del anticuerpo anti-Aire (por ejemplo, marcado con AF488), en 1x tampón de permeabilización, mezcle bien e incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.
  14. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  15. Repita el paso 2.14.
  16. Añadir 100 μL de concentraciones de trabajo de IgG anti-conejo (por ejemplo, marcado con AF555) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  17. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización 1x. Centrifugar las células a 700 × g a 4 °C durante 8 min. Deseche el sobrenadante.
  18. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS y mezcle bien.
  19. Almacene las células en la oscuridad a 4 °C hasta el análisis por citometría de flujo.
  20. Filtre las celdas a través de una malla de nailon de 60 μm antes del análisis de citometría de flujo.

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Resultados

El análisis requiere un citómetro de flujo que permita la detección de al menos seis canales de fluorescencia (para CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye y beta5t, CCL21 y/o Aire), así como los parámetros de dispersión hacia adelante y dispersión lateral. Los perfiles citométricos representativos de células de timo digeridas con colagenasa/dispasa provenientes de ratones de 0 días de edad y ratones de 2 semanas de edad se muestran en la Figura 1 y la Figura 2, resp...

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Discusión

La colagenasa, con o sin Dispasa, se usa ampliamente para digerir el timo de ratón para preparar TEC 4,5,9,18,21. La liberasa, que contiene una mezcla de proteasas, incluida la colagenasa, también se usa para digerir el timo para preparar los TEC17,22. El uso de colagenasa y liberasa proporciona rendim...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Izumi Ohigashi por leer el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros ZIA BC 011806 de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer y el Centro de Investigación del Cáncer.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colagenasa/Dispasa Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Factor de transcripción Juego de tampones de tincióneBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anticuerpo monoclonal CD45 anti-ratón, clon 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-ratón anticuerpo monoclonal Ly51, clon 6C3BioLegend108312
anticuerpo monoclonal PE/Cy7 anti-ratón EpCAM / CD326, clon G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus aglutinina I (UEA1)Vector LaboratoriosDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anticuerpo monoclonal anti-ratón Aire, clon 5H12eBioscience53-5934-82
anti-ratón Psmb11/beta5t anticuerpo monoclonal de conejo, clon CPTC-PSMB11 (ratón)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (ratón)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
anti-ratón CCL21/exodus 2 anticuerpo policlonal de conejoBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-conejo IgG de cadena pesada cabra recombinante anticuerpoInvitrogenA27039
Anti-Ratón CD32/CD16 – Purificado (anticuerpo de bloque Fc)Leinco TechnologiesC247
Malla de nailon 60 micrasSuministro de componentesW31436
Equipo
ThermomixerEppendorfBloque
Celómetro Auto 2000 Contador de viabilidad celularNexcelomRecuento
viables LSRFortessa Analizador de célulasBD BiosciencesCitómetrode flujo Cinco láseres (355, 408, 488, 595 y 637 nm)
Software FACSDiva versión 9.0.1BD BiosciencesAnálisis
FlowJo 10.9.0BD BiosciencesAnálisis de datos de citometría
AnticuerpoTasa de dilución (concentración de trabajo)Tampón
Anti-Mouse CD32/CD16 – Purificado (anticuerpo de bloqueo Fc)1:40Tampón
BV421 anti-ratón Anticuerpo monoclonal CD451:25Tampón
PE/Cy7 anti-ratón Anticuerpo monoclonal EpCAM/CD3261:100Tampón
Alexa Fluor 647 anti-ratón Anticuerpo monoclonal Ly511:100Tampón
DyLight 594 Ulex Europaeus Aglutinina I (UEA1)1:400Tampón
Anti-ratón CCL21/exodus 2 anticuerpo policlonal de conejo1:2001x Tampón
Anti-ratón Psmb11/beta5t anticuerpo monoclonal de conejo, clon CPTC-PSMB11(ratón)-11:10001x Tampón
Alexa Fluor 555 anti-conejo IgG anticuerpo recombinante de cabra de cadena pesada1:4001x Tampón
TampónPropósito
RPMI1640 que contiene 10 mM HEPES Para la preparación
de células RPMI1640 que contienen un 2% de FBS Para lacélulas
tampón FACS (1x HBSS que contiene un 1% de BSA  y azida sódica al 0,1%)Para la preparación celular y la tinción de anticuerpos
1 mg/ml de colagenasa/dispasa y 1U/ml de solución de DNasa en RPMI1640 que contenga 2% de FBS Para ladigestión enzimática
2% de PFA en PBSPara la
Tampón de fijación/permeabilización (1 parte de concentrado de fijación/permeabilización con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización)Para la fijación celular
1x Tampón de permeabilización (1 parte de concentrado 10X con 9 partes de agua destilada)Para tinción de anticuerpos intercelulares 
de calorde célulasde citometría de flujode flujode diluciónFACSFACSFACSFACSFACSde permeabilizaciónde permeabilizaciónde permeabilización preparación de , ,fijación celular

Referencias

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